그래핀 전극 어레이를 이용한 뇌 매핑

요약

침습성을 줄이고 시공간 해상도를 개선하기 위해 그래핀 어레이 기반 뇌 매핑 절차를 제시합니다. 그래핀 어레이 기반 표면 전극은 복잡한 뇌에서 장기적인 생체 적합성, 기계적 유연성 및 뇌 매핑에 대한 적합성을 나타냅니다. 이 프로토콜을 사용하면 여러 형태의 감각 맵을 동시에 순차적으로 구성할 수 있습니다.

초록

피질 지도는 대뇌 피질의 감각 운동 자극에 대한 위치 의존적 신경 반응의 공간적 구성을 나타내므로 생리학적으로 관련된 행동을 예측할 수 있습니다. 피질 지도를 얻기 위해 관통 전극, 뇌파 검사, 양전자 방출 단층 촬영, 자기 뇌파 검사 및 기능적 자기 공명 영상과 같은 다양한 방법이 사용되었습니다. 그러나 이러한 방법은 열악한 시공간 해상도, 낮은 신호 대 잡음비(SNR), 높은 비용 및 비생체 적합성으로 인해 제한되거나 뇌에 물리적 손상을 유발합니다. 본 연구에서는 기존 방법의 단점을 극복하여 우수한 생체적합성, 높은 시공간 해상도, 바람직한 SNR, 최소화된 조직 손상을 제공하는 전기피질검사의 특징으로 그래핀 어레이 기반 체성감각 매핑 방법을 제안한다. 이 연구는 쥐의 체성 감각 매핑을 위한 그래핀 전극 어레이의 타당성을 입증했습니다. 제시된 프로토콜은 체성감각 피질뿐만 아니라 청각, 시각, 운동 피질과 같은 다른 피질에도 적용될 수 있어 임상 구현을 위한 첨단 기술을 제공합니다.

서문

피질 지도는 대뇌 피질의 감각 운동 자극에 대한 반응 특성을 나타내는 일련의 국소 패치입니다. 그것들은 신경망의 공간적 형성이며 지각과 인지에 대한 예측을 가능하게 합니다. 따라서 피질 맵은 외부 자극에 대한 신경 반응을 평가하고 감각 운동 정보를 처리하는 데 유용합니다 1,2,3,4. 피질 매핑을 위해 침습적 및 비침습적 방법을 사용할 수 있습니다. 가장 일반적인 침습적 방법 중 하나는 ^5,6,7,8을 매핑하기 위해 피질 내 (또는 관통) 전극을 사용하는 것입니다.

관통 전극을 사용하여 주문형 고해상도 피질 지도를 평가하는 것은 몇 가지 장애물에 직면했습니다. 이 방법은 적절한 지도를 얻기에는 너무 힘들고 임상용으로 구현하기에는 너무 침습적이어서 추가 개발을 금지합니다. 뇌파 검사 (EEG), 양전자 방출 단층 촬영 (PET), 자기 뇌파 검사 (MEG) 및 기능적 자기 공명 영상 (fMRI)과 같은 최신 기술은 덜 침습적이고 재현 가능하기 때문에 인기를 얻고 있습니다. 그러나, 그들의 엄청난 비용과 열악한 해상도를 감안할 때, 그들은 제한된 수의 경우에 사용됩니다 9,10,11. 최근, 신호 신뢰성이 우수한 유연한 표면 전극이 상당한 주목을 받고 있습니다. 그래핀 기반 표면 전극은 장기적인 생체 적합성과 기계적 유연성을 보여 주며 복잡한 뇌에서 안정적인 기록을 제공합니다 12,13,14,15,16. 우리 그룹은 최근 피질 표면의 고해상도 기록 및 부위별 신경 자극을 위한 그래핀 기반 다중 채널 어레이를 개발했습니다. 이 기술을 통해 우리는 오랜 기간 동안 감각 정보의 피질 표현을 추적 할 수 있습니다.

이 기사에서는 30채널 그래핀 다중 전극 어레이를 사용하여 체성 감각 피질의 뇌 지도를 획득하는 단계를 설명합니다. 뇌 활동을 측정하기 위해 그래핀 전극 어레이를 피질의 경막하 영역에 놓고 앞발, 앞다리, 뒷발, 뒷다리, 몸통 및 수염을 나무 막대기로 자극합니다. 체성감각 유발 전위(SEP)는 체성감각 영역에 대해 기록됩니다. 이 프로토콜은 청각, 시각 및 운동 피질과 같은 다른 뇌 영역에도 적용될 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 취급 절차는 인천대학교 기관동물관리이용위원회(INU-ANIM-2017-08)의 승인을 받았습니다.

1. 수술을 위한 동물 준비

참고: 이 실험에서는 성별 편견 없이 Sprague Dawley Rat(8-10주령)를 사용하십시오.

1. 쥐를 90mg/kg 케타민과 10mg/kg 자일라진 칵테일을 복강 주사로 마취합니다. 수술 내내 원하는 마취 깊이를 유지하려면 쥐가 깨어날 징후를 보일 때 45mg/kg 케타민과 5mg/kg 자일라진 칵테일을 보충하십시오.
2. 쥐가 깊은 마취 상태인지 확인하고 발가락 꼬집기, 꼬리 꼬집기, 각막 반사와 같은 신체 반사를 정기적으로 확인합니다.
3. 트리머를 사용하여 눈과 귀 뒤쪽 사이의 털을 면도하십시오.
4. 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 안과용 연고를 눈에 바르십시오.

2. 피질 표면 노출을 위한 수술

1. 입체 어댑터로 입체 장치에 쥐 머리를 고정하십시오. 수술 중 체온을 37°C로 유지하려면 체온이 조절되는 가열 패드에 쥐를 올려 놓으십시오.
2. 면도 부위를 알코올과 포비돈 요오드를 번갈아 가며 세 번 소독하십시오.
3. 겸자를 사용하여 두피를 단단히 잡고 주사기로 리도카인 0.1mL(2%)를 두피에 직접 주입하여 수술 부위에 국소 마취를 유도합니다.
4. 메스로 2-3cm 길이의 정중선을 절개하고 두피를 당겨 두개골을 노출시킵니다.
5. 두개골을 노출시키기 위해 모기 집게로 두피를 고정하십시오.
6. 골막으로 두개골 표면을 집게로 긁어 골막을 제거하십시오.
7. 둔기는 후두 두개골 위의 근육을 해부하여 척수 상단의 축 위에 수조를 노출시킵니다.
8. 칼날로 수조를 절개하여 뇌척수액을 배출하고 수조 마그나 절개 부위에 멸균 거즈를 넣어 뇌척수액을 지속적으로 흡수하여 뇌부종을 예방하고 염증을 최소화합니다.
9. 연필을 사용하여 우반구의 브레그마에서 전후 축으로 3mm, 오른쪽 측면 방향으로 6mm 크기의 직사각형 창을 두개골에 표시하십시오.
   알림: 마킹은 상부 시상동 파열을 방지하기 위해 정중선에서 1mm 거리를 확보해야 합니다.
10. 입체 좌표에 따라 표시된 영역을 뚫고 뼈 rongeur로 두개골을 제거하십시오.
11. 경막을 제거하려면 26G 바늘 끝을 90°로 구부리고 경막에 구멍을 뚫고 경막을 들어 올려 그 구멍에 집게를 넣고 집게로 찢습니다.
12. 체성 감각 피질에 식염수를 적신 거즈를 놓아 건조를 방지하십시오.

3. 기록 시스템에 연결된 그래핀 전극 어레이의 제조

1. 오메틱스 커넥터가 있는 그래핀 전극 어레이를 준비합니다.
   1. 식염수를 도포하여 손상을 입히지 않고 그래핀 다중전극 어레이를 분리합니다.
   2. 커넥터에서 기준 및 접지선의 외부 덮개를 제거합니다.
2. 헤드 스테이지를 그래핀 전극 어레이와 커넥터에 연결합니다.
3. 헤드 스테이지에 연결된 인터페이스 케이블을 녹음 시스템에 꽂습니다.
4. 그래핀 전극 어레이 복합체를 스테렉탁스 암에 고정합니다.
5. 모든 채널에서 신경 신호를 캡처하려면 미리 결정된 정위 좌표를 따라 구부리지 않고 체성 감각 피질에 배열을 배치합니다.
6. 후두골 뒤의 조직 아래에 기준선을 놓고 접지선을 접지된 광학 테이블에 연결합니다.

4. 매핑을 위한 물리적 자극 및 SEP 기록

1. 신경 신호 기록 소프트웨어를 엽니다.
2. 녹음 소프트웨어 환경 설정: (1) SEP 및 노치 필터(60 또는 50Hz, 가정용 전력 주파수)의 s에 대한 samp링률 설정하여 전력선에서 노이즈를 제거합니다.
3. 수염 매핑의 경우 가는 막대기로 수염을 구부립니다.
4. 신체 매핑을 위해 나무 막대기로 앞발, 앞다리, 뒷발, 뒷다리 및 몸통을 끊임없이 찌릅니다.
5. 표시된 시간 동안 데이터 수집 시스템에 신경 신호를 기록합니다.

5. 동물 안락사

1. 모든 기록 절차가 끝나면 >5 % 이소 플루 란을 사용하여 마취로 쥐를 희생하고 자궁 경부 절제를 시행하십시오.

6. 피질 매핑을 위한 SEP 측정

1. 신호 분석을 위해 MATLAB 코드명 read_Intan_RHS2000_file.m을 엽니다.
   참고 : read_Intan_RHS2000_file.m은 "https://intantech.com/downloads.html?tabSelect=Software"에서 다운로드 할 수 있습니다.
2. 실행 버튼을 클릭하고 파일 이름 확장자가 ".rhs"인 녹음 파일을 선택한 다음 파일이 처리되고 읽힐 때까지 기다립니다.
3. "plot (t, amplifier_data("channel number",:))" 명령을 입력하여 기록 데이터의 2D 선 플롯을 생성하고, SEP를 찾고, 모든 채널에서 SEP의 진폭을 계산합니다.
   참고: "채널 번호"에 채널 번호를 입력합니다. 예를 들어, "plot(t, amplifier_data(1,:))"은 채널 1의 2D 선 플롯을 만듭니다. 또한 실험자가 응답의 진폭을 계산할 때 각 채널에서 기록된 응답을 선택합니다.
4. SEP의 진폭에 따라 그리드를 다른 색조로 채색하여 데이터를 얻습니다.
   참고: MATLAB 명령 "imagesc"를 사용하면 지형도를 더 빨리 얻을 수 있습니다.

결과

이 프로토콜은 그래핀 다중 채널 어레이가 뇌 표면에 장착되는 방법을 설명합니다. 체성감각 지도는 물리적 자극에 대한 신경 반응을 획득하고 반응의 진폭을 계산하여 구성되었습니다. 그림 1 은 이 실험의 개략도를 보여줍니다.

도 2A 는 그래핀 전극 어레이의 구조적 특성을 나타낸다. 전극 사이에는 기판의 관통 구멍이 있습니다...

토론

제시된 프로토콜은 그래핀 전극 어레이를 사용하여 쥐의 체성 감각 반응에 접근하고 매핑하는 방법을 설명하는 심층적인 단계별 프로세스를 제공합니다. 프로토콜 획득 데이터는 각 신체 부위에 시냅스적으로 연결된 체성 감각 정보를 제공하는 SEP입니다.

이 프로토콜의 여러 측면을 고려해야 합니다. 뇌부종을 예방하고 염증을 완화하기 위해 뇌척수액을 추출 할 때 실험자?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
3mL syringe	KOREAVACCINE CORPORATION		injecting the drug for anesthesia
Bone rongeur	Fine Science Tools	16220-14	remove the skull
connector	Gbrain		Connect graphene electrode to headstage
drill	FALCON tool		grind the skull
drill bits	Osstem implant		grind the skull
Graefe iris forceps slightly curved serrated	vubu	vudu-02-73010	remove the tissue from the skull or hold wiper
graphene multielectrode array	Gbrain		records signals from neuron
isoflurane	Hana Pharm Corporation		sacrifce the subject
ketamine	yuhan corporation		used for anesthesia
lidocaine(2%)	Daihan pharmaceutical		local anesthetic
Matlab R2021b	Mathworks		Data analysis Software
mosquito hemostats	Fine Science Tools	91309-12	fasten the scalp
ointment	Alcon		prevent eye from drying out
povidone	Green Pharmaceutical corporation		disinfect the incision area
RHS 32ch Stim/Record headstage	intan technologies	M4032	connect connector to interface cable and contain intan RHS stim/amplifier chip
RHS 6-ft (1.8m) Stim SPI interface cable	intan technologies	M3206	connect graphene electrode to headstage
RHS Stim/Recording controller software	intan technologies		Data Acquisition Software
RHS stimulation/ Recording controller	intan technologies	M4200
saline	JW Pharmaceutical
scalpel	Hammacher	HSB 805-03
stereotaxic instrument	stoelting		fasten the subject
sterile Hypodermic Needle	KOREAVACCINE CORPORATION		remove the dura mater
Steven Iris Tissue Forceps	KASCO	50-2026	remove the dura mater
surgical blade no.11	FEATHER		inscise the scalp
surgical sicssors	Fine Science Tools	14090-09	inscise the scalp and remove the dura mater
wooden stick			whisker stimulation
xylazine	Bayer Korea		used for anesthesia