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요약

이 연구는 [68Ga] D-도데카펩티드 길항제의 양전자 방출 단층 촬영 이미징을 기반으로 전신에서 프로그래밍된 죽음 리간드 1의 분포를 평가하는 비침습적 실시간 방법을 개발했습니다. 이 기술은 기존의 면역조직화학에 비해 장점이 있으며 면역관문 차단 요법의 혜택을 받을 적절한 환자를 식별하는 효율성을 향상시킵니다.

초록

프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1)/프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)을 기반으로 하는 면역 관문 차단 요법의 개발은 최근 몇 년 동안 암 치료에 혁명을 일으켰습니다. 그러나 종양 세포에서 PD-L1의 이질적인 발현으로 인해 PD-1/PD-L1 억제제에 반응하는 환자는 극히 일부에 불과합니다. 이러한 이질성은 일반적으로 사용되는 면역조직화학(IHC) 접근법으로 종양 세포를 정밀하게 검출하는 데 어려움을 초래합니다. 이러한 상황은 치료 효능을 향상시키기 위해 면역 관문 차단 요법의 혜택을 받을 환자를 계층화하는 더 나은 방법을 요구합니다. 양전자 방출 단층 촬영(PET)을 사용하면 비침습적 방식으로 전신 PD-L1 발현을 실시간으로 시각화할 수 있습니다. 따라서 PET 이미징을 통해 종양의 PD-L1 분포를 검출하기 위한 방사성 표지 추적자의 개발이 필요합니다.

L-펩타이드와 비교하여 덱스트로로터리(D)-펩타이드는 단백질 분해 저항성 및 현저하게 연장된 대사 반감기와 같은 특성을 가지고 있습니다. 이 연구는 종양이 있는 마우스에서 D-도데카펩티드 길항제(DPA)인 68Ga-표지 PD-L1 표적 D-펩타이드의 PET 이미징을 기반으로 PD-L1 발현을 검출하는 새로운 방법을 설계했습니다. 그 결과, [68Ga]DPA는 생체 내에서 PD-L1 과발현 종양에 특이적으로 결합할 수 있으며, 우수한 이미징 능력과 함께 유리한 안정성을 보였으며, 이는 [68Ga]DPA-PET가 종양의 PD-L1 상태 평가에 유망한 접근법임을 시사합니다.

서문

면역관문단백질의 발견은 종양치료의 돌파구였으며, 면역관문차단요법 개발의 큰 진전을 이끌었다1. 프로그램된 세포 사멸 단백질 1(PD-1) 및 프로그램된 사멸 리간드 1(PD-L1)은 미국 식품의약국(FDA)에서 승인한 여러 항체를 가진 잠재적인 약물 표적입니다. PD-1은 CD4+, CD8+ T세포, 조절T세포 등 종양 침윤 면역세포에 의해 발현됩니다. PD-L1은 PD-1 리간드 중 하나로, 다양한 종양 세포 2,3에서 과발현됩니다. PD-1과 PD-L1의 상호작용은 PD-1을 비활성화시켜 항종양 면역반응을 억제한다4. 이러한 발견은 PD-L1의 억제가 면역 세포의 사멸 효과를 개선하고 종양 세포를 제거할 수 있음을 시사한다5. 현재 발색 면역조직화학(chromogenic immunohistochemistry, IHC)은 면역관문요법에 반응할 가능성이 가장 높은 환자를 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 접근법이다 6,7. 그러나 종양 세포에서 PD-L1의 이질적인 발현으로 인해 생검의 IHC 결과는 환자의 PD-L1 발현에 대한 정확한 정보를 제공할 수 없다8. 이전 연구에서는 20%-40%의 환자만이 면역관문 차단 요법으로 장기적인 이점을 얻는다고 보고했습니다 1,9,10. 따라서 이러한 면역 관문 단백질의 이질적인 발현으로 인한 위음성 결과를 피할 수 있는 새로운 방법을 개발하는 것이 시급합니다.

양전자 방출 단층 촬영(PET)과 같은 분자 이미징 기술은 비침습적 방식으로 전신의 실시간 시각화를 가능하게 하므로 기존의 IHC 방법을 능가할 수 있습니다 11,12,13. 방사성 표지 항체, 펩타이드 및 저분자는 암 환자에서 PD-L1 발현을 모니터링하기 위한 유망한 추적자입니다 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. FDA는 아벨루맙(avelumab), 아테졸리주맙(atezolizumab), 더발루맙(durvalumab)26 등 3가지 PD-L1 치료용 단일클론항체를 승인했다. 이들 항체에 기초한 면역-PET 추적자는 27,28,29,30,31,32로 잘 문서화되어 있다. 초기 단계 임상 시험은 불리한 약동학30 때문에 임상 적용에 대한 제한된 가치를 밝혔다. 항체와 비교했을 때, 펩타이드는 건강한 장기에서 더 빠른 혈액 및 장기 청소를 나타내며 화학적으로 쉽게 변형될 수 있다33. PD-1/PD-L1에 대한 친화력이 높은 여러 펩타이드가 보고되었습니다2; WL12는 PD-L134에 특이적인 결합을 나타내는 보고된 펩타이드입니다. 방사성 표지된 추적자, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 및 [18F]FPyWL12는 높은 in vivo 특이적 종양 표적화 능력을 나타내는 것으로 보고되었으며, 이는 종양 26,35,36,37에서 PD-L1 발현의 고품질 이미지를 수집할 수 있습니다. 더욱이, 방사성 표지된 WL12에 대한 최초의 인체 내 평가는 [68Ga]WL12(NOTA에 의해 킬레이트화됨)가 임상 종양 영상에 안전하고 효율적인 잠재력을 가지고 있음을 입증했다38. WL12는 높은 소수성과 건강한 간에서의 높은 흡수로 인해 임상적 사용이 제한적입니다. PD-L1에 특이적으로 결합하는 TPP1 및 SETSKSF와 같은 다른 방사성 표지 펩타이드도 전신 PD-L1 발현을 시각화하기 위한 잠재적인 안정성과 특이성을 보여주었습니다39,40. 그러나 변형되지 않은 펩타이드는 프로테아제에 의해 쉽게 분해되며 신장에서 빠르게 대사됩니다. Dextrorotary (D) - 펩타이드는 왼손잡이 (L) - 펩타이드 41,42,43의 열악한 안정성으로 인해 효과적인 매개체로 널리 사용되었습니다. D-펩타이드는 단백질 분해에 대한 내성이 강하며 대사 반감기가 현저히 연장됩니다. L-펩타이드와 비교하여 D-펩타이드는 대부분 특정 결합 능력 44,45,46을 나타냅니다.

이 연구는 종양이 있는 마우스 모델47에서 68Ga 표지된 PD-L1 표적 D-펩타이드, D-도데카펩티드 길항제(DPA)의 PET 이미징을 기반으로 PD-L1 발현을 검출하는 새로운 방법을 설계했습니다. [68Ga]DPA의 안정성은 먼저 인산염 완충 식염수(PBS) 및 마우스 혈청에서 연구되었으며, 그 후 PD-L1 과발현 종양에서 [68Ga]DPA의 결합 친화도를 테스트했습니다. 그 후, 교모세포종 이종이식 모델에서 PET 이미징을 수행하여 [68Ga]DPA가 종양에서 PD-L1 발현을 모니터링하는 데 이상적인 PET 추적자인지 여부를 확인했습니다. PET 이미징과 DPA의 결합은 PD-L1의 이질적인 발현과 관련된 문제를 극복하기 위한 새로운 접근 방식을 제공할 뿐만 아니라 D-펩타이드 기반 방사성 추적자 개발의 기반을 마련합니다.

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프로토콜

동물 실험 절차는 난징 의과 대학의 동물 윤리위원회 또는 국립 양자 과학 기술 연구소의 승인을 받았습니다. 생쥐 실험은 실험동물 관리 및 이용 위원회의 제도적 지침에 따라 엄격하게 수행되었습니다.

1. 펩타이드 합성

  1. 100mg의 4-메틸벤즈하이드릴아민(MBHA) 수지(적재 용량 0.37mmol/g)를 N-메틸-2-피롤리돈(NMP) 1mL에 30분 동안 약한 N2 버블링 하에서 팽창시킵니다.
  2. NMP 1mL에 Fmoc 보호 아미노산(5.0 당량), HCTU(4.9당량) 및 DIPEA(10.0당량)로 구성된 신선한 스톡 버퍼를 준비하고 수지(100mg)에 첨가합니다. 커플링 반응이 1.5-2시간 동안 진행되도록 합니다.
  3. NMP에서 50%(vol/vol) 모르폴린으로 구성된 탈보호화 완충액을 준비합니다. 수지(100mg)를 각 세척 시 탈보호 완충액 1mL로 2 x 30분 세척하여 아민기에서 Fmoc기를 제거합니다. 레진을 디클로로메탄(DCM, 1mL)으로 1분 동안 세척하고 DCM을 제거한 후 NMP(1mL)로 다시 1분 동안 세척합니다. 다음으로 NMP를 제거하고 DCM으로 1분 동안 수지를 다시 세척합니다.
    알림: 모든 세탁 절차는 약한 N2 버블링 하에서 수행됩니다. 위의 과정은 마지막 아미노산까지 반복됩니다.
  4. 펩타이드에 1,4,7,10-테트라아자사이클로도데칸-1,4,7,10-테트라아세트산(DOTA)을 첨가하기 위해 N-(3-디메틸아미노프로필)-N-에틸카르보디이미드 염산염(EDC· HCl) 및 N-하이드록시숙신이미드(NHS). DOTA/EDC의 스톡 버퍼를 배양합니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 3시간 동안 1:1:1의 몰비로 HCl/NHS를 유지하고, 최종 DOTA 농도는 1M입니다. 다음으로, 스톡 버퍼(1mL)를 수지(100mg)에 첨가하고, 부드러운N2 버블링으로 2시간 동안 반응을 진행시킨다.
    참고 : 1,4,7- 트리 아자 사이클로 노난 -1,4,7- 트리 아세트산 (NOTA)은 68Ga착화의 킬레이터로도 사용할 수 있습니다. NOTA 커플링에도 동일한 절차를 사용할 수 있습니다.
  5. DCM을 사용하여 레진을 상단에서 철저히 헹구고 진공을 도포하여 잔류 반응 용액을 동시에 제거합니다. DCM(1.5mL)을 사용하여 레진을 3배 헹구고 MeOH(1.5mL)로 헹구어 레진을 수축시킵니다. 수지가 마를 때까지 밤새 질소 아래에 두거나 고진공 상태에서 최소 4시간 동안 두십시오.
  6. 건조된 DPA 펩타이드 함유 수지를 나사 캡이 있는 2mL 폴리프로필렌 용기에 넣습니다. 적절한 분열 칵테일(95/2.5/2.5 TFA/TIS/H2O 부피, 1mL/100mg 수지)을 넣고 나사 캡을 사용하여 용기를 단단히 밀봉합니다. 2시간 동안 20-25°C의 흄 후드에서 궤도 쉐이커의 반응을 부드럽게 저어줍니다.
    주의 : 트리플루오로아세트산(TFA)은 부식성이 높기 때문에 보호복을 착용하고 흄 후드에 준비하십시오.
  7. 흄 후드의 질소 아래에서 증발하여 대부분의 TFA를 제거합니다. 디에틸 에테르(~1.5mL/수지 100mg)를 첨가하여 펩타이드를 침전시킵니다.
  8. 혼합물을 소용돌이치게 하여 펩타이드를 트라이튜레이트하고 실온(10,000× g, 5분)에서 원심분리합니다. 용기에서 용매를 조심스럽게 붓습니다. 1.7-1.8단계를 반복합니다.
  9. 열린 용기에 잔여물을 10분 동안 자연 건조시킵니다. 50%(vol/vol) 수성 아세토니트릴을 첨가하고 1-2초 동안 와류하여 생성물(1mL/수지 100mg)을 용해시킵니다.
  10. 혼합물을 여과하여 수지를 제거한 다음 50%(vol/vol) 수용성 아세토니트릴 0.2mL를 사용하여 수지를 2배 세척합니다. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 정제를 위해 여과액을 혼합합니다. 다음 HPLC 조건을 사용합니다. 컬럼: YMC-Triat-C18(내경 4.6mm[내경], 150mm, 5mm); 용매 구배: 용매 A-탈이온수; 용매 B-아세토니트릴 (0.1% TFA); 흐름 시간 : 20 분, 10 %에서 90 %까지 아세토 니트릴 포함; 유속: 1mL/분
  11. 수집된 HPLC 용리액을 -80°C에서 밤새 동결하고 동결건조합니다(-50°C 및 <1pa). 방사성 표지를 위해 고체 펩타이드를 아세트산나트륨 완충액(100mM, pH 5.0)에 최종 농도 1mg/mL로 스톡 완충액으로 용해시킵니다.

2. 68Ga 방사선 표지

NOTE 68Ga는 난징 제1병원(중국 난징)에서 68Ge/68Ga 발생기를 사용하여 사내에서 생성되었습니다.

  1. 스크류 캡이 있는 1.5mL 폴리프로필렌 용기에 5μL의 스톡 버퍼를 피펫팅합니다. 용기에 200MBq [68Ga]GaCl3 (400μL)를 추가합니다.
  2. 혼합물을 5초 동안 소용돌이칩니다. pH 테스트 스트립을 사용하여 pH를 측정합니다. NaOH(4M)를 사용하여 pH를 4.5-0.1로 조정합니다.
    알림: 적절한 pH는 68Ga와 DOTA 사이의 착화에 중요합니다.
  3. 용액을 실온에서 5-10분 동안 배양합니다. 다음 조건에서 방사성 표지 수율 분석을 위해 반응 혼합물을 방사성 HPLC에 적용: 컬럼: YMC-Triat-C18(4.6mm 내경, 150mm, 5mm); 용매 구배: 용매 A-탈이온수; 용매 B-아세토니트릴 (0.1% TFA); 흐름 시간 : 20 분, 10 %에서 90 %까지 아세토 니트릴 포함; 유속: 1mL/분
    참고: 무선 박층 크로마토그래피(TLC)는 방사성 표지 수율을 검사하기 위한 대체 접근법으로 사용할 수 있습니다. 제안된 TLC 용출 완충액은 0.1 M Na3C6H5O7, pH 4입니다.

3. 트레이서 안정성 시험

  1. PBS의 트레이서 안정성 테스트
    1. PBS(68μL)에 [3.7Ga]DPA(NaOAc에서 990μL, 990μL)를 추가합니다. 37°C에서 1, 2, 4시간 동안 약간의 교반을 가하여 배양합니다.
    2. 각 시점에서 200μL의 용액을 수집합니다. 분석을 위해 radio-HPLC에 주입합니다.
  2. 마우스 혈청의 추적자 안정성
    1. [68Ga]DPA(10 μL, ~3.7 MBq, NaOAc)를 마우스 혈청(90 μL, 갓 준비)에 추가합니다. 37°C에서 1, 2, 4시간 동안 약간의 교반을 가하여 배양합니다.
    2. 각 시점에서 20μL의 용액을 수집합니다. MeCN과 물(100μL, 1:1, v/v)을 추가합니다.
    3. 혼합물을 10분(5,000× g, 25°C) 동안 원심분리합니다. 방사선 HPLC를 사용하여 상층액을 분석합니다.

4. 유세포 분석에 의한 PD-L1 발현 분석

  1. RPMI-1640 배지에 10%(vol/vol) 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(vol/vol)을 보충하여 배양 배지를 준비합니다. U87MG 세포를 배양 배지에 재현탁시키고 105 cells/well의 밀도로 12웰 플레이트에 파종합니다. 세포를 인큐베이터(5% CO2, 37°C)에 넣고 방해하지 않고 최소 24시간 동안 배양합니다.
  2. 0.5mL의 PBS로 세포를 세척하고 250μL의 트립신-EDTA(0.25%)를 추가합니다. 세포를 인큐베이터(5% CO2, 37°C)에 2분 동안 다시 넣습니다.
  3. 세포 해리를 막기 위해 배양 배지 1mL를 추가합니다. 세포에 배지를 추가하여 위아래로 피펫팅하여 접시에서 분리하고 1.5mL 튜브에 수집합니다. 세포를 5분(100× g) 동안 원심분리합니다.
  4. 상층액을 제거하고 PBS 1mL에 세포를 재현탁시킵니다. 세포를 5분(100× g) 동안 원심분리합니다. 이 단계를 한 번 더 반복합니다.
  5. 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC) 접합 PD-L1 항체를 3% 소 혈청 알부민(BSA)으로 희석하여 20nmol/L로 희석합니다. 세포에 첨가하고 4°C에서 1시간 동안 배양합니다.
  6. 세포를 5분(100× g) 동안 원심분리한 후 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. 유세포 분석기 및 분석 소프트웨어를 사용하여 PD-L1 양성 세포를 분석합니다.

5. 면역세포화학(Immunocytochemistry)

  1. 유리 바닥 세포 배양 접시(35mm)에 U87MG 세포를 웰당 2.5 × 105 개의 세포의 밀도로 파종합니다. 60% 밀도에 도달하면 배양 배지를 흡인하고 PBS 1mL를 추가합니다. 부드럽게 여러 번 흔들어 흡인합니다. 세탁 단계를 3번 수행합니다.
  2. 접시에 500μL의 4% 파라포름알데히드를 추가합니다. 셀을 실온에 놓고 30분 동안 고정합니다.
  3. PBS로 세포를 3번 세척합니다. 1mL의 3% BSA(wt/vol, PBS)를 추가하고 고정 셀을 실온에서 2시간 동안 차단합니다.
  4. 3% BSA를 제거하고 1차 항-PD-L1 항체(mAb,1:100, 3% BSA에 희석)를 4°C에서 밤새 직접 배양합니다.
    알림: BSA로 세포를 차단한 후 PBS로 세척하지 마십시오.
  5. 3% BSA 완충액으로 세포를 3번 세척합니다. FITC 접합 항인간 IgG Fc 2차 항체(1:500, PBS에 희석)로 세포를 1시간 동안 배양합니다.
  6. PBS로 세포를 3번 세척합니다. 0.5mL의 DAPI(1μg/mL)를 세포에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 염색된 세포를 PBS로 3번 세척하고 컨포칼 형광 현미경을 사용하여 관찰합니다.

6. 세포 흡수 및 억제 실험

  1. 세포 흡수 실험
    1. 80% 밀도에 도달할 때까지 12웰 플레이트에서 U87MG 세포를 배양합니다. 배지를 제거하고 0.5mL의 PBS로 세포를 세척합니다.
    2. [68Ga]DPA를 신선한 배지에 74KBq/mL의 농도로 희석합니다. 희석된 [68Ga]DPA 완충액 0.5mL를 각 웰에 추가합니다.
    3. 37°C에서 [68Ga]DPA로 세포를 다른 기간(10, 30, 40 및 120분) 동안 배양합니다. 피펫을 사용하여 배지를 흡입합니다. PBS(0.5mL)로 세포를 세 번 세척합니다.
    4. NaOH 용액(웰당 0.5M, 300μL)을 추가하여 세포를 용해합니다. 30초 후 점성 세포 용해물을 1.5mL 튜브에 수집합니다.
    5. PBS 0.4mL로 접시를 두 번 씻습니다. 위의 1.5mL 튜브에 세척액을 수집합니다.
    6. 자동 감마 카운터의 내장 컴퓨터를 시작하십시오. 튜브를 붙박이 선반에 넣습니다. 모든 샘플을 컨베이어에 적재한 후, START 버튼을 누릅니다. 결과는 내부 소프트웨어에서 계산됩니다. 판독값은 각 튜브의 분당 붕괴 상관 횟수(CPM)를 기록합니다.
  2. 경쟁력 있는 결합 분석
    1. 80% 밀도에 도달할 때까지 12웰 플레이트에서 U87MG 세포를 배양합니다. 배지를 제거하고 0.5mL의 PBS로 세포를 세척합니다.
    2. [68Ga]DPA를 신선한 배지에 74KBq/mL의 농도로 희석합니다. 10% DMSO에 적당량의 BMS202 화합물을 용해시켜 10mM 농도(400μL)를 생성합니다.
    3. 10μM의 농도를 얻기 위해 396μL의 PBS에 10mM BMS202의 4μL를 희석하여 100μM의 농도를 얻습니다. 이 단계를 반복하여 다양한 농도의 BMS202(1μM, 10nM, 100pM 및 1pM)를 생성합니다.
    4. 희석된 [68Ga]DPA 완충액 0.5mL를 각 웰에 추가합니다(웰당 0.37MBq). 각 웰에 5μL의 BMS202 용액을 추가합니다(각 농도당 3개의 웰). 37°C의 세포 인큐베이터에서 120분 동안 세포를 배양합니다.
    5. 피펫을 사용하여 배지를 흡입합니다. 3 x 0.5mL의 PBS로 세포를 세척합니다.
    6. NaOH 용액(웰당 0.5M, 300μL)을 추가하여 세포를 용해합니다. 30초 후 점성 세포 용해물을 1.5mL 튜브에 수집합니다. 2 x 0.4mL의 PBS로 접시를 씻습니다.
    7. 위의 1.5mL 튜브에 세척액을 수집합니다. 자동 감마 카운터의 내장 선반에 튜브를 넣습니다.
    8. 6.1.6단계와 동일한 절차를 수행합니다.

7. PET 이미징

알림: 수평 시야 159cm, 축 시야 10cm로 0.796mm 간격(중심에서 중심까지)의 159개의 횡축 단면을 제공하는 마이크로 PET 스캐너를 사용하여 소동물 PET 이미징을 수행합니다. 목록 모드에서 수집된 모든 데이터는 3차원 시노그램으로 구성됩니다. 그런 다음 푸리에를 2차원 시노그램으로 재조립합니다(프레임 × 분: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. 이 연구에서는 5-8주 된 BALB/C 누드 생쥐 수컷을 사용했습니다. 4.1-4.4단계에 따라 U87MG 세포를 수집하고 세포를 0.5mL 주사기로 흡인합니다. 세포를 마우스에 피하 주사합니다(종양당 1 ×10 6 개 세포, 마우스당 2개의 종양). 종양 부피가 100-300mm가 될 때까지 주사 후 종양 성장을 모니터링합니다3.
  2. 1%-2%(v/v) 이소플루란(1mL/분)을 사용하여 마우스를 마취합니다. 가열 장치를 켜고 PET의 동물 침대를 37°C로 유지하십시오.
  3. 마취된 쥐를 PET 기계의 동물 침대에 올바른 위치에 놓습니다. 건조함을 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
    주의 : 스캔하는 동안 사망하지 않도록 마우스를 엎드린 자세로 유지하십시오. 전체 이미징 과정에서 사전 설치된 튜브를 사용하여 코를 통해 이소플루란 흐름(1.0mL/분)을 투여합니다.
  4. 제어판을 통해 동물 침대 위치를 조정하십시오. 사전 설치된 꼬리 정맥 카테터를 통해 추적자(10-17MBq/100-200μL)를 정맥 주사합니다.
  5. 참조된 소프트웨어를 사용하여 호스트 컴퓨터에서 스캔 워크플로 생성( 재료 표 참조) 스터디 폴더를 만들고 제조업체의 프로토콜에 따라 수집 프로토콜을 설정합니다. 3D 목록 모드에서 모든 마우스에 대해 동적 스캔(각 마우스당 60분)을 수행합니다.
  6. 히스토그램 프로토콜과 제조업체의 프로토콜에 따라 재구성 프로토콜을 정의합니다. 0.5 cycle/pixel의 Nyquist 컷오프와 함께 Hanning의 필터를 사용하여 필터링된 역 투영을 통해 PET 동적 이미지(25-30분 및 55-60분)를 재구성합니다. 모든 마우스에 대한 최대 강도 투영(MIP) 이미지를 생성합니다.
  7. 워크플로에서 프로토콜을 결합하고 워크플로를 실행합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 소프트웨어를 사용하여 결과 3차원 이미지를 분석합니다.
    참고: 시뮬레이션 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 볼륨을 선택합니다. 방사능은 주입 시간에 따라 붕괴 보정되며 총 주입량/그램 조직당 백분율(% ID/g)로 표시됩니다.

8. 생체 외 생체 내 분포

  1. 꼬리 정맥 주입을 통해 U87MG 함유 BALB/C 누드 마우스에 [68Ga]DPA(1.85 MBq/100 μL)를 투여합니다. 1%-2%(v/v) 이소플루란(1mL/분)을 사용하여 마우스를 마취한 다음 주사 후 자궁경부 탈구를 통해 5분, 30분, 60분 및 120분 동안 3마리의 마우스를 희생합니다.
    알림: 이 절차를 시연하는 개인은 의식 상실이 빠르게 유도되도록 경추 탈구의 기술에 대한 교육을 받아야 합니다. 이렇게 하면 이 실험의 안락사 절차가 모두 인도적으로 수행될 수 있습니다.
  2. 죽음이 확인되면 쥐의 흉벽을 엽니다. 그런 다음 마음을 여십시오. 1mL 주사기를 사용하여 혈액을 채취합니다. 주사기의 혈액을 감마 계수기용 방사성 면역분석법(RIA) 튜브(직경 13mm)에 압착합니다.
  3. 주요 장기와 종양을 절제하고 감마 계수기용 RIA 튜브(직경 13mm)에 넣습니다. 주요 장기는 혈액, 심장, 흉선, 간, 비장, 뼈, 위, 신장, 근육, 장 림프절, 소장, 췌장, 고환, 뇌, 폐 등이다. 모든 장기의 무게를 잰다.
  4. 자가감마 계수기를 사용하여 수집된 장기 내의 방사능을 측정하고 값을 붕괴 보정합니다. 습성 티슈 그램당 주입된 선량의 백분율(% ID/g)을 계산합니다.

9. 면역조직화학

  1. 신경교종 조직을 채취하여 PBS로 3회 세척합니다. 신선한 티슈를 4% 파라포름알데히드에 넣고 4°C에서 밤새 고정합니다.
  2. 고정 조직을 파라핀에 넣고 10μm 두께로 절편합니다. 절편을 인큐베이터(60°C)에 넣고 2시간 동안 배양합니다. 왁스를 제거하고 절편을 10분 동안 배양하여 수분을 공급합니다: 크실렌(2회), 절대 알코올, 95% 알코올, 95% 알코올, 80% 알코올, 75% 알코올.
  3. 절편을 0.01M 구연산나트륨에 넣고 92-95°C로 가열합니다. 항원 회수를 위해 40분 동안 온도를 유지합니다.
  4. 200μL의H2O2용액(3%)을 절편에 첨가하고 실온에서 10분 동안 엔도퍼록시다아제를 비활성화합니다. 실온에서 2시간 동안 3% BSA로 처리하여 비특이적 부위를 차단합니다.
  5. 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항-PD-L1 항체(mAb, 1:100, 3% BSA에 희석)에서 절편을 배양합니다.
    알림: BSA로 차단한 후 PBS로 세척하지 마십시오.
  6. PBS로 섹션을 3번 세척합니다. HRP 표지 염소 항 토끼 2차 항체(1:500, PBS에 희석)로 절편을 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
  7. PBS로 세포를 3번 세척합니다. 200μL의 3,3-디아미노벤지딘(DAB) 작업 용액(용액 A: 용액 B: 용액 C = 1:1:18)을 절편에 추가하고 어두운 곳에서 5분 동안 배양합니다.
  8. PBS로 섹션을 3번 세척합니다. 500μL의 헤마톡실린 용액(100%)을 넣고 실온에서 5분간 배양합니다. 30초 동안 물로 섹션을 씻으십시오. 섹션을 분화 용액(75% 알코올:HCL = 99:1)에 30초 동안 넣습니다. 물을 사용하여 1분 동안 섹션을 세척합니다.
  9. 75% 알코올, 80% 알코올, 90% 알코올, 95% 알코올, 절대 알코올 및 자일렌(2회)(각각 10분)으로 순차적으로 배양하여 샘플을 탈수합니다. 중성 수지를 사용하여 모든 섹션을 장착하고 광학 현미경으로 관찰하십시오.

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결과

[68Ga]DPA 방사성 표지 및 안정성
모델 펩타이드인 DPA는 효과적인 PD-L1 길항제입니다. DOTA-DPA는 순도 >95%, 수율 68%로 수득되었습니다. DOTA-DPA의 질량은 실험적으로 1,073.3([M+2H]2+)에서 관찰됩니다. 68분갈륨은 PET 이미징을 위한 펩타이드를 라벨링하는 데 적합한 방사성 핵종으로 간주되므로 이 연구를 위해 선택되었습니다. 68Ga(반?...

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토론

이 방법에 설명된 중요한 단계에는 DPA에 대한 68Ga의 효율적인 라벨링과 종양에서 DPA의 약력학적 패턴과 완벽하게 일치해야 하는 PET 이미징에 적합한 시간 창을 선택하는 것이 포함됩니다.

IHC와 달리 PET 이미징은 비침습적 방식으로 전신 PD-L1 발현을 실시간으로 검출할 수 있어 이질적인 종양의 각 양성 영역을 시각화할 수 있습니다 6,7

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공개

상충되는 이해관계는 선언되지 않습니다.

감사의 말

이 연구는 중국의학원 비영리중앙연구소 기금(제2022-RC350-04호)과 CAMS 의학혁신기금(제2021-I2M-1-026호, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101호, 2022-I2M-2-002호)의 지원을 받았다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA)Merck60239-18-168Ga  chelation
3,3-diaminobenzidine (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunohistochemistry
anti-PD-L1 monoclonal antibodyWuhan Proteintech17952-1-apImmunohistochemistry: primary antibody
BMS202Selleck1675203-84-5Competitive binding assay: inhibitor
BSAMerckV900933Immunofluorescent : blocking 
DAPIMerckD9542Immunofluorescent: staining of nucleus
Dichloromethane (DCM)Merck34856Solvent
DIPEAMerck3439Peptide coupling
EDC·HClMerckE6383Activation of DOTA
FBSGibco10099Cell culture: supplement
FITC-conjugated anti-human IgG Fc AntibodyBiolegend409310Immunofluorescent: secondary antibody
FITC-conjugated anti PD-L1 antibodyBiolegend393606Flow cytometry: direct antibody
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptide coupling
HRP labeled goat anti-rabbit antibodyServicebioGB23303Immunohistochemistry: secondary antibody
Hydroxysuccinimide (NHS)Merck130672Activation of DOTA
MeCNMerckPHR1551Solvent
MorpholineMerck8.06127Fmoc- deprotection
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydeMerck30525-89-4Fixation of tissues
PBSGibco10010023Cell culture: buffer
Penicillin-streptomycin Gibco10378016Cell culture: supplement
RIA tubePolyLabP10301AAs tissue sample container
RPMI-1640 mediumGibco11875093Cell culture: basic medium
Sodium acetateMerck1.06264Salt for buffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Cell culture: dissociation agent
U87MG cell lineProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Ga generatorIsotope Technologies Munich, ITMNot applicableGeneration of [68Ga]
Autogamma counterPerkin Elmer Wizard2Detection of radioactivity
Confocal fluorescent microscopyKeyenceObservation of immunofluorescent results
Flow cytometerBecton Dickinson, BDLSRIIMonitoring the PD-L1 positive cells
High-performance liquid chromatography (HPLC)SHIMAZULC-20AT Purification of DPA peptide
PET scannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET imaging
Optical microscopyNikon Eclipse E100Observation of immunohistochemistry results
Solid phase peptide synthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthesis of DPA-DOTA peptide
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNot applicableAnalysis of PET-CT results
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analysis of the flow cytometer results
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNot applicableManagement of PET mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analysis of the data 

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