기공 계통 세포에서 막 트래피킹 사건을 연구하기 위한 이미지 기반 방법

요약

원형질막 수용체 키나아제의 막 이동 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 몇 가지 방법이 여기에 소개됩니다. 이 원고는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정을 포함한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

초록

진핵 세포에서 단백질과 지질을 포함한 막 구성 요소는 내막 시스템 내에서 시공간적으로 목적지로 운반됩니다. 여기에는 새로 합성된 단백질을 세포 표면 또는 세포 외부로 분비 수송하는 것, 세포외 화물 또는 원형질막 성분을 세포로 세포내로 운반하는 것, 세포내 소기관 사이에서 화물을 재활용하거나 이동하는 것 등이 포함됩니다. 막 밀매 사건은 모든 진핵 세포의 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격한 규제를 받고 있습니다. 세포외 공간에서 리간드 신호를 감지하는 세포 표면 수용체 키나아제는 분비 및 세포내 수송을 모두 거칩니다. 원형질막-국소화된 류신-풍부한-반복 수용체 키나아제, ERL1을 사용하여 막 트래피킹 이벤트를 연구하기 위해 일반적으로 사용되는 접근법이 여기에 기재되어 있다. 접근 방식에는 식물 재료 준비, 약리학적 처리 및 컨포칼 이미징 설정이 포함됩니다. ERL1의 시공간 조절을 모니터링하기 위해 이 연구에서는 ERL1과 다소포체 마커 단백질인 RFP-Ara7 사이의 공동 국소화 분석, 이 두 단백질의 시계열 분석, 막 밀매 억제제 brefeldin A 및 wortmannin으로 처리된 ERL1-YFP의 z-스택 분석에 대해 설명합니다.

서문

막 이동(Membrane traffic)은 단백질, 지질 및 기타 생물학적 산물을 포함한 막 구성 요소(화물이라고도 함)를 진핵 세포 내의 서로 다른 세포 기관 사이 또는 원형질막을 가로질러 세포외 공간으로 또는 세포외 공간으로 분배하는 보존된 세포 과정입니다¹. 이 과정은 핵막, 소포체, 골지체, 액포/리소좀, 원형질막 및 다중 엔도솜으로 구성된 내막 시스템(endomembrane system)이라는 막과 세포 기관의 집합체에 의해 촉진된다¹. 내막 시스템은 이러한 세포 기관 사이를 왕복하는 동적 소포를 사용하여 막 구성 요소의 수정, 포장 및 운송을 가능하게 합니다. 세포막 밀매 현상은 세포 발달, 성장 및 환경 적응에 매우 중요하므로 엄격하고 복잡한 규제를 받고 있습니다². 현재, 분자 생물학, 화학 생물학, 현미경 및 질량 분석법의 여러 접근법이 개발되어 막 이동 분야에 적용되었으며 내막 시스템 ^3,4의 시공간 조절에 대한 이해를 크게 발전시켰습니다. 분자 생물학은 관심 단백질의 유전자 발현을 변경하거나 관심 단백질에 특정 태그를 표시하는 것과 같이 막 ....

프로토콜

1. 용액 준비

1. 표백제 15mL와 증류수 35mL 및 Triton X-100 50μL를 혼합하여 종자 살균 용액을 준비합니다.
2. BFA 분말을 에탄올에 용해시켜 브레펠딘 A(BFA) 용액을 최종 농도 10 mM(스톡)으로 제조한다. Wm 분말을 DMSO에 용해시켜 최종 농도 10 mM(stock)이 되도록 맥아즙만닌(Wm) 용액을 제조한다.

2. 씨앗 파종

1. 필요한 형질전환 식물 각각에서 10-50개의 종자를 1.5mL 미세원심분리기 튜브에 분취합니다. 각 튜브에 종자 멸균 용액 1mL를 넣고 셰이커에서 10분 동안 튜브를 부드럽게 뒤집어 완전히 혼합합니다.
2. 종자 살균 용액을 버리고 1mL의 오토클레이브 증류수로 종자를 5회 세척합니다.
3. 오토클레이브 증류수 300μL를 각 튜브에 넣고 1%(w/v) 자당과 0.75%(w/v) 한천을 포함하는 절반 강도 MS 배지에 종자를 뿌립니다. 필요에 따라 해당 항생제로 배지를 보충하십시오.
4. 플레이트를 4°C의 어두운 곳에서 2일 동안 거꾸로 보관하여 발아를 동기화합니다.
5. 2일 후, 플레이트를 22°C에서 16시간 ....

토론

내막 시스템은 진핵 세포의 세포질을 서로 다른 구획으로 분리하여 이러한 세포 기관의 특수한 생물학적 기능을 가능하게 합니다. 화물 단백질과 거대분자를 적시에 최종 목적지로 전달하기 위해 수많은 소포가 이러한 세포 기관 사이를 왕복하도록 안내됩니다. 고도로 조절된 막 밀매 사건은 세포의 생존력, 발달 및 성장에 근본적인 역할을 합니다. 이 중요하고 복잡한 과정을 조절하는 메커니즘.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug