무균 말벌의 사육 절차 최적화

요약

나소니아 말벌 배아를 12-24시간 동안 기생시킨 후 Lucillia sericata 번데기에서 해부하고 알코올과 10% 차아염소산나트륨 용액으로 세척하여 무균 배아를 얻었습니다. 무균 배아를 사육하고 시험관 내에서 성장 및 발달할 수 있도록 Nasonia 사육 배지를 공급한 후 무균 Nasonia 성인을 얻었습니다.

초록

무균 사육 기술은 무균 또는 거의 무균 상태에서 곤충을 배양하는 방법으로 곤충 미생물군에 대한 외부 미생물의 영향을 효과적으로 제거하여 곤충 미생물군 연구의 급속한 발전을 촉진할 수 있습니다. 나소니아(말벌속)는 기생 말벌 곤충으로 수명이 짧고 유전적 변이가 높으며 조작이 용이한 등 많은 장점을 가지고 있으며 곤충 모델 시스템으로 널리 사용됩니다. 동물의 미생물 수만 줄일 수 있는 항생제 처리와 달리 무균 사육 기술은 동물의 미생물 구성과 양을 모두 제어할 수 있어 숙주-미생물 상호 작용 연구를 더욱 용이하게 합니다. 그러나 이전 버전의 나소니아 사육 배지(NRM)는 복잡하고 시간이 많이 소요되는 준비 과정, 박테리아 또는 곰팡이에 의한 쉬운 오염, 짧은 보관 시간 등 몇 가지 결함과 문제가 있습니다. 따라서 본 연구에서는 NRM 준비 과정에서 사용되는 도구, 보관 조건 및 구성 요소 비율을 최적화하여 이러한 문제를 해결합니다. 최적화된 배지는 -20°C에서 최소 3개월 동안 보관할 수 있으며 무균 말벌에게 먹이를 주는 동안 NRM 오염 가능성을 제거할 수 있습니다. 이것은 Nasonia를 미생물 연구의 모델로 사용하는 데 중요한 무균 Nasonia의 생존율과 건강 수준을 더욱 향상시킵니다.

서문

무균 동물은 검출 가능한 살아있는 미생물과 기생충이 없는 동물이다¹. 무균 배아는 무균 상태에서 모체를 해부하여 얻을 수 있으며, 이후 장벽 시스템에서 키울 수 있다². 이러한 동물은 장내 미생물군, 면역체계 및 신진대사와 같은 동물에 대한 미생물의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있다¹. 특정 기술적 수단을 사용하면 많은 곤충과 심지어 포유류까지도 불임이 될 수 있습니다 ^3,4. 무균 동물은 독특한 역할을 하며 미생물학 연구의 다양한 측면에서 널리 사용되어 왔다⁵. 예를 들어, 무균 나소니아 말벌을 사용하면 미생물이 숙주가 장기간의 외인성 환경 스트레스 하에서 새로운 환경에 적응하는 데 도움이 될 수 있음^{이 밝혀졌습니다 6,7}.

나소니아 기생충은 파리의 번데기에 알을 주입하는 작은 기생 말벌입니다....

프로토콜

1. 무균 나소니아 사육배지 제조

1. 시중에서 판매되는 L. sericata 번데기( 재료 표 참조)를 쟁반이나 종이와 같이 모든 번데기를 수용할 수 있는 표면에 놓습니다. 발육이 저조한 유충, 짙은 늙은 번데기, 빈 번데기 껍질, 톱밥 또는 기타 불순물은 버리십시오. 갈색을 띤 붉은 색의 어린 번데기 만 보관하고 비커 (약 3,000-4,000 마리의 번데기)로 옮깁니다.
   참고: 많은 실험을 수행한 후 어두운 오래된 번데기로 만든 배지가 쉽게 어두워지고 무균 말벌의 발달을 멈추는 것으로 나타났습니다. 이 현상은 어린 갈색-적색 번데기를 사용하여 배지를 생산할 때 발생하지 않았습니다. 그 이유는 아직 불분명하며 이를 확인하기 위해 추가 조사가 필요합니다.
2. 번데기의 전체 표면을 덮을 수 있도록 비커에 충분한 탈이온수를 추가합니다. 비커의 입을 은박지나 거즈로 감싸고 비커를 흔들어 번데기 표면의 불순물을 닦은 다음 물을 붓습니다. 3-5 번 반복하십시오.
3. 세척한 L. sericata 번데기를 마늘 프레스의 필터 탱크에 넣고 세게 짜낸 다음 L. sericata 번데기의 조직액을 50mL 멸균 원심분리기 ....

토론

유전체학(genomics) 및 대사체학(metabolomics)과 같은 고처리량 검출 기술을 적용하면서 연구자들은 장내 미생물군에 엄청난 유전적 다양성과 대사 복잡성이 존재한다는 사실을 점차 깨닫게 되었다¹⁶. 이러한 공생 박테리아는 숙주와의 복잡한 상호작용을 통해 숙주의 영양 대사, 종양, 면역 및 노화와 같은 다양한 생리학적 또는 병리학적 상태와 밀접하게 관련된다(¹⁷

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 Sterile vacuum filter	NEST	331011
10% SodiumHypochlorite	LIRCON	XB-84BS-1
1x PBS solution	Solarbio	P1020
200 mesh nylon net	BIOBYING	BY-378Z
24 well-plate	NEST	702001
8, 1.2, 0.8, and 0.45 µm filters	Shanghai Xingya Purification Material Factory	HN-AA-JT-10079
Absolute ethyl alcohol	Macklin	E809057-500ml
Cell Strainer	BIOLOGIX	15-1100
Commercial Drosophila Medium	Boer	B645446-500ml
Dissecting needle	Bioroyee	17-9140
Garlic press	Taobao	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Lucillia sericata pupae	Hefei Dayuan Biotechnology Co., Ltd.	No Catalog numbers	Purchase on Taobao
Small writing brush	Cestidur	BL0508
Stereoscope	SOPTOP	RX50
Tweezers	SALMART	A109001-56