세포 기관 특이적 염료를 사용한 Caenorhabditis elegans 및 포유류 세포에서 Mitophagy 검출

요약

전자 현미경, 유전자 센서 및 면역형광을 통해 미토파지를 탐색하려면 값비싼 장비, 숙련된 인력 및 상당한 시간 투자가 필요합니다. 여기에서 우리는 Caenorhabditis elegans 와 간암 세포주 모두에서 미토파지 과정을 정량화하는 상용 형광 염료 키트의 효능을 입증합니다.

초록

미토콘드리아는 에너지 생산, 지질 대사, 칼슘 항상성, 헴 생합성, 조절된 세포 사멸 및 활성 산소 종(ROS) 생성을 포함한 다양한 생물학적 기능에 필수적입니다. ROS는 주요 생물학적 과정에 필수적입니다. 그러나 통제되지 않으면 미토콘드리아 손상을 포함한 산화적 손상을 유발할 수 있습니다. 손상된 미토콘드리아는 더 많은 ROS를 방출하여 세포 손상과 질병 상태를 심화시킵니다. 미토콘드리아 자가포식(mitophagy)이라는 항상성 과정은 손상된 미토콘드리아를 선택적으로 제거한 다음 새로운 미토콘드리아로 대체합니다. 여러 미토파지 경로가 있으며, 일반적인 종점은 리소좀에서 손상된 미토콘드리아의 분해입니다.

유전자 센서, 항체 면역형광 및 전자 현미경을 포함한 여러 방법론에서 이 엔드포인트를 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 미토파지를 검사하는 각 방법은 특정 조직/세포 표적화(유전자 센서 사용) 및 매우 상세하게(전자 현미경 사용)와 같은 장점이 있습니다. 그러나 이러한 방법은 종종 고가의 자원, 훈련된 인력 및 형질전환 동물을 만드는 것과 같은 실제 실험 전에 긴 준비 시간이 필요합니다. 여기에서 우리는 미토콘드리아와 리소좀을 표적으로 하는 상업적으로 이용 가능한 형광 염료를 사용하여 미토파지를 측정하기 위한 비용 효율적인 대안을 제시합니다. 이 방법은 선충 Caenorhabditis elegans 및 인간 간 세포에서 미토파지를 효과적으로 측정하며, 이는 다른 모델 시스템에서 잠재적인 효율성을 나타냅니다.

서문

미토콘드리아는 인간을 포함한 모든 호기성 동물에게 필수적입니다. 산화적 인^{산화를 통해} 생체분자의 화학적 에너지를 아데노신 삼인산(adenosine triphosphate, ATP)으로 변환하고, 헴(hem)2을 합성하고, 산화^{β 산화3}를 통해 지방산을 분해하고, 칼슘(calcium⁴)과 철(iron)5 항상성을 조절하고, 세포사멸(apoptosis)⁶에 의한 세포 사멸을 조절하며, 산화환원 항상성(redox homeostasis⁾7에 중요한 역할을 하는 활성산소종⁽reactive oxygen species, ROS⁾을 생성한다. 두 가지 보완적이고 반대되는 과정은 미토콘드리아의 완전성과 적절한 기능을 유지합니다: 새로운 미토콘드리아 성분의 합성(생물 발생)과 미토콘드리아 자가포식(즉, 미토파지)^을 통한 손상된 성분의 선택적 제거8.

여러 미토파지 경로는 PINK1/Parkin과 같은 효소와....

프로토콜

참고: 독자의 편의를 위해 프로토콜을 두 부분으로 나눴습니다 : 하나는 예쁜꼬마선충의 미토파지 측정 프로토콜에 초점을 맞추고 다른 하나는 간 세포에서 미토파지를 측정하기 위한 프로토콜에 초점을 맞춥니다. 재료 목록은 제공된 재료 표 에서 찾을 수 있습니다.

1. 예쁜꼬마선충 프로토콜

1. 선충 성장 배지(NGM) 플레이트 및 대장균 OP50 박테리아 스톡 준비
   참고: 명확히 하자면, NGM 플레이트 및 OP50 박테리아 스톡^25,26의 준비에 대한 표준 프로토콜을 따랐지만 서로 다른 실험실 간에 이러한 프로토콜에 차이가 있을 수 있음을 알고 있습니다. 따라서 실험의 정확한 복제를 보장하기 위해 완전한 프로토콜을 포함했습니다.
   1. pH 6에 도달할 때까지 ~150mL의 1M K 2HPO 4를 500mL의 1M KH_2PO4 용액에 첨가하여 1M 인산칼륨 완충액, pH 6을 만듭니다. 버퍼를 0.22μm 진공 필터/보관 시스템에 통과....

토론

다중 미토파지 경로는 다양한 단백질과 생체 분자(예: 카디오리핀²⁹)를 포함합니다. 그러나 이러한 경로의 종점은 유사하며 리소좀 효소^12,13에 의한 미토콘드리아의 분해입니다. 실제로 여러 방법에서 이 종점을 사용하여 미토파지를 정량화합니다. 그러나 전자 현미경과 같은 일부 방법은 값비싼 장비, 훈련된 전문가, 표본 및 분석을 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent or resource
Analytical balance	Mettler-Toledo
Bacto Agar	BD-Difco	214010
Bacto Peptone	BD-Difco	211677
Bacto Tryptone	BD-Difco	211705
Bacto Yeast extract	BD-Difco	212750
Calcium chloride	Sigma	C1016
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP)	Sigma	C2920
Chemicals
Cholestrol	Thermo Fisher	C/5360/48
DMEM high glucose	Biological Industries	01-055-1A
Double distilled water (DDW)
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS)	Biological Industries	02-023-1A
FBS heat inactivated	Invitrogen	M7514
Gluteradehyde (25%)	Sigma	G5882
HEPES Buffer 1 M	Biological Industries	03-025-1B
L-gluatamine	Biological Industries	03-020-1B
Lysosome/Mitochondria/Nuclear Staining Cytopainter Reagent	Abcam	ab139487
Magnesium Sulfate	Sigma	M7506
Nonidet P 40	Sigma	74385
Paraformalydehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15720
Poloxamer 188 Solution	Sigma	P5556
Potassium dihydrogen phosphate	Millipore	1.04873.1000
Potassium phosphate dibasic	Sigma	P3786
SeaKem LE Agarose	Lonza	50004
Sodium Chloride	Bio-Lab	1903059100
Sodium Hydroxide	Gadot	1310732
Sodium phosphate dibasic dodecahydrate	Sigma	4273
Tetracycline hydrochloride	Sigma	87128-25G
Trypsin-EDTA	Biological Industries	03-052-1A
VL-850: 1,8-diaminooxy-octane	Patented
Glass/Plastic Disposables
0.22 μm syringe filter	Millex GV	SLGV033RS
1.7 mL Micro Centrifuge Tubes	Lifegene	LMCT1.7B-500
10 cm Petri plates	Corning	430167
1,000 mL Erlenmeyer Flask	IsoLab, Germany
15 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB15-500
35 mm Petri dishes	Bar Naor	BN9015810
500 mL vacuum filter/storage bottle system, 0.22 μm	Lifegene	LG-FPE205500S
50 mL Sterile Polypropylene tube	Lifegene	LTB50-500
Deckgläser Microscope cover glass 24 x 60 mm	Marienfeld	101152
Glass test tubes (10 mL- 13 x 100 mm) Borosilicate glass	Pyrex	99445-13
iBiDi 8 well μ-slides	iBiDi	80826
Microscope cover glass 24 x 40 mm	Bar Naor	BN1052421ECALN
Platinum iridium 0.25 mM wire	World Precision Instruments	PT1002
Instruments
Cell counter CellDrop BF	DeNovix	CellDrop BF-UNLTD
Microspin FV-2400	Biosan	BS-010201-AAA
Nikon Yokogawa W1 Spinning Disk confocal microscope with DAPI, FITC, and TRITC filters and bright-field, with a 60x CFI Plan-Apochromat Lambda type lens (air lens) and NIS-Elements software	Nikon	CSU-W1
Olympus SZ61 stereo microscope	Olympus	SZ61
pH meter	Mettler-Toledo	MT30019032
Revolver Adjustable Lab Rotator	Labnet	H5600