미토콘드리아 접촉 부위를 분리하는 개선된 방법

요약

미토콘드리아 접촉 부위는 미토콘드리아 내막 및 외막 단백질과 상호 작용하는 단백질 복합체입니다. 이 부위는 미토콘드리아 막과 세포질과 미토콘드리아 기질 사이의 통신에 필수적입니다. 여기에서는 이 특정 종류의 단백질에 적합한 후보를 식별하는 방법을 설명합니다.

초록

미토콘드리아는 거의 모든 진핵 세포에 존재하며 철-황 클러스터, 지질 또는 단백질의 합성, Ca²⁺ 완충 및 세포 사멸 유도와 같은 에너지 생산을 훨씬 능가하는 필수 기능을 수행합니다. 마찬가지로 미토콘드리아 기능 장애는 암, 당뇨병 및 신경 퇴행과 같은 심각한 인간 질병을 초래합니다. 이러한 기능을 수행하기 위해 미토콘드리아는 두 개의 막으로 구성된 외피를 통해 세포의 나머지 부분과 통신해야 합니다. 따라서 이 두 멤브레인은 지속적으로 상호 작용해야 합니다. 미토콘드리아 내막과 외막 사이의 단백질 접촉 부위는 이 점에서 필수적입니다. 지금까지 여러 접촉 사이트가 확인되었습니다. 여기에 설명된 방법에서, 맥주효모균 미 토콘드리아는 접촉 부위를 분리하고, 따라서 접촉 부위 단백질에 적합한 후보를 식별하는 데 사용됩니다. 우리는 이 방법을 사용하여 미토콘드리아 내막의 주요 접촉 부위 형성 복합체 중 하나인 미토콘드리아 접촉 부위 및 크리스타 조직 시스템(MICOS) 복합체를 식별했으며, 이는 효모에서 인간으로 보존됩니다. 최근에는 이 방법을 더욱 개선하여 Cqd1 및 Por1-Om14 복합체로 구성된 새로운 접촉 부위를 식별했습니다.

서문

미토콘드리아는 진핵생물에서 다양한 기능을 수행하며, 가장 잘 알려진 것은 산화적 인산화를 통한 ATP 생성입니다. 다른 기능으로는 철-황 클러스터의 생성, 지질 합성 및 고등 진핵 생물에서 Ca 2 + 신호 전달 및 세포 사멸^유도 1,2,3,4가 있습니다. 이러한 기능은 복잡한 초미세 구조와 불가분의 관계에 있습니다.

미토콘드리아 초미세구조는 전자현미경⁵에 의해 처음 기술되었다. 미토콘드리아는 미토콘드리아 외막과 미토콘드리아 내막이라는 두 개의 막으로 구성된 다소 복잡한 세포 기관인 것으로 나타났습니다. 따라서 두 개의 수성 구획이 이러한 막에 의해 형성됩니다 : 막간 공간과 매트릭스. 미토콘드리아 내막은 더 많은 부분으로 나눌 수 있습니다. 내경막은 외막에 근접하여 유지되며 크리스타는 침범을 형성합니다. 소위 크리스타 접합부(crista junctions)는 내경막(inner boundary membrane)과 크리스타(cristae)를 연결합니다(

프로토콜

1. 완충액과 원액

1. 탈이온수, pH 7.4에서 1M 3-모르폴리노프로판-1-술폰산(MOPS) 용액을 만듭니다. 4 °C에서 보관하십시오.
2. 탈이온수(pH 8.0)에서 500mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 준비합니다. 실온에서 보관하십시오.
3. 탈이온수에 2.4M 소르비톨을 준비합니다. 오토클레이브 후 실온에서 보관하십시오.
4. 탈이온수에 2.5M 자당을 준비합니다. 오토클레이브 후 실온에서 보관하십시오.
5. 이소프로판올에 200mM 페닐메틸설포닐플루오라이드(PMSF)를 준비합니다. -20 °C에서 보관하십시오.
   주의: PMSF는 삼키면 독성이 있으며 심각한 피부 화상과 눈 손상을 일으킵니다. 먼지를 흡입하지 말고 보호 장갑과 고글을 착용하십시오.
6. 탈이온수에 72% 트리클로로아세트산(TCA)을 준비합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   주의: TCA는 호흡기 자극, 심한 피부 화상 및 눈 손상을 유발할 수 있습니다. 먼지를 흡입하지 말고 보호 장갑과 고글을 착용하십시오.
7. SM 완충액을 준비합니다: 20mM MOPS 및 0.6M 소르비톨, pH 7.4.
8. 팽윤 완충액을 준비합니다: 20mM MOPS, 0.5mM EDTA,....

토론

미토콘드리아 분획은 여러 매우 복잡한 단계를 거쳐야 하는 복잡한 실험입니다. 따라서 우리는 확립된 방법³²를 더욱 개선하고 어느 정도 단순화하는 것을 목표로 했습니다. 여기서 문제는 종종 개별 구조인 복잡하고 고도로 전문화된 장비에 대한 요구 사항과 막대한 시간과 에너지 소비였습니다. 이를 위해 선형 그래디언트를 주조 및 수확하는 데 사용되는 펌프와 개별 구조를 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mm	Beckman Instruments, Germany	344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mm	Beckman Instruments, Germany	363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x g	Beckman Instruments, Germany	363055
Abbe refractometer	Zeiss, Germany		discontinued, any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet Controller	Brandtech, USA	BR26320	discontinued, any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mL	DWK Life Science, Germany	C118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 D	Branson Ultrasonics, USA	FIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIP	Branson Ultrasonics, USA	101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling Cell	Branson Ultrasonics, USA	15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26	Beckman Instruments, Germany	B37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultra	Beckman Instruments, Germany	8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-Cocktail	Roche, Switzerland	11697498001
D-Sorbit	Roth, Germany	6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)	Roth, Germany	8043
Erlenmeyer flask, 100 mL	Roth, Germany	X747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1	Hirschmann, Germany	1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05	Hirschmann, Germany	1180153
ice bath	neoLab, Germany	S12651
Magnetic stirrer RCT basic	IKA-Werke GmbH, Germany	Z645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)	Gerbu, Germany	1081
MyPipetman Select P1000	Gilson, USA	FP10006S
MyPipetman Select P20	Gilson, USA	FP10003S
MyPipetman Select P200	Gilson, USA	FP10005S
Omnifix 1 mL	Braun, Germany	4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)	Serva, Germany	32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mm	Braun, Germany	4022495052414
stirring bar, 15 mm	VWR, USA	442-0366
Sucrose	Merck, Germany	S8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Instruments, Germany	331362
Test tubes	Eppendorf, Germany	3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vessel	VWR, USA	432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tip	VWR, USA	432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)	Sigma Aldrich, Germany	33731	discontinued, any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRIS	Roth, Germany	4855