Lifespan Machine을 사용한 High-Throughput Behavioral Aging and Lifespan Assay

요약

이미징 플랫폼 "The Lifespan Machine"은 대규모 개체군의 평생 관찰을 자동화합니다. 수명, 스트레스 저항성, 발병 기전 및 행동 노화 분석을 수행하는 데 필요한 단계를 보여줍니다. 데이터의 품질과 범위를 통해 연구자들은 생물학적 및 환경적 변이가 존재함에도 불구하고 노화에 대한 개입을 연구할 수 있습니다.

초록

일정한 환경에서 사육되는 유전적으로 동일한 동물은 광범위한 수명 분포를 보이며, 이는 연구된 모든 유기체에 걸쳐 보존된 노화에 대한 큰 비유전적, 확률적 측면을 반영합니다. 이 확률적 구성 요소는 노화를 이해하고 수명을 연장하거나 건강을 개선하는 성공적인 개입을 식별하기 위해 연구자들이 대규모 실험 동물 집단을 동시에 모니터링해야 함을 의미합니다. 기존의 수동 사망 점수는 대규모 가설 테스트에 필요한 처리량과 규모를 제한하여 고처리량 수명 분석을 위한 자동화된 방법의 개발로 이어졌습니다. Lifespan Machine(LSM)은 선충의 평생 추적을 위해 개조된 평판 스캐너와 맞춤형 이미지 처리 및 데이터 검증 소프트웨어를 결합한 고처리량 이미징 플랫폼입니다. 이 플랫폼은 전례 없는 규모로 대규모 동물 집단에서 시간적으로 분해된 수명 데이터를 숙련된 연구원이 수행하는 수동 분석과 동일한 통계적 정밀도 및 정확도로 생성함으로써 중요한 기술 발전을 이루었습니다. 최근에는 노화 과정에서 관찰되는 행동 및 형태학적 변화를 정량화하고 이를 수명과 연관시키기 위해 LSM이 더욱 개발되었습니다. 여기서는 LSM을 사용하여 자동화된 수명 실험을 계획, 실행 및 분석하는 방법을 설명합니다. 또한 행동 데이터와 고품질 생존 곡선을 성공적으로 수집하는 데 필요한 중요한 단계를 강조합니다.

서문

노화는 유기체의 생리적 기능의 쇠퇴를 특징으로 하는 복잡하고 다면적인 과정으로, 시간이 지남에 따라 질병과 사망의 위험이 증가한다¹. 출생 또는 성인이 된 후 사망할 때까지의 시간으로 측정되는 수명^{은 노화} 에 대한 명확한 결과2를 제공하며, 인구 간의 상대적 노화율을 측정하기 위한 간접적이지만 엄격한 정량적 대용물을^{제공한다3.} 노화 연구는 종종 중재에 노출된 한 집단과 노출되지 않은 대조군 간의 결과를 비교하기 위해 임상 시험과 유사하게 수명의 정확한 측정에 의존합니다. 불행히도, 재현성 문제는 노화 연구에 만연해 있는데, 이는 때로는 통계적으로 검증되지 않은 실험⁴ 때문이기도 하고, 종종 환경의 미묘한 변화에 대한 수명 분석의 고유한 민감성 때문^{이기도 하다5}. 강력한 실험에는 대규모 모집단에 대한 다중 복제가 필요하며, 이 프로세스는 특히 자동화가 제공하는 실험 확장성의 이점을 누릴 수 있습니다⁶.

수명 분석의 엄격한 요구는 노화 과정 자체의 예측 불가능성에서 비롯됩니다. 동일한 환경에 수용된 동인성 개체들은 서로 다른 사망 시간과 생리^{적 쇠퇴율을} 보이며7 이는 수명이 높은 확률성(stochasticity)^7,8을 수반한다는 것을 시사한다. 따라서 평균 또는 최대 수명의 변화와 같은 노화 과정의 양적 변화를 측정하고 개인별 변동성으로 인한 편향을 극복하기 위해 대규모 인구가 필요합니다. 또한, 고처리량 수명 분석을 위한 능력은 생존 곡선 형태 및 노화 역학 모델에 대한 연구를 지원하는 데 매우 중요하다⁹.

예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans)은 짧은 수명, 유전적 다루기 쉬움 및 빠른 생성 시간으로 인해 노화 연구에 매우 중요한 모델이며, 이는 고처리량 노화 및 수명 분석에 대한 적합성을 강조합니다. 전통적으로 C의 수명. 예쁜꼬마선충은 시간이 지남에 따라 약 50-100마리의 동물로 구성된 동기화된 소규모 개체군을 고체 매체에 추적하고 개별 사망 시간을 기록하여 측정되었습니다. 동물이 나이가 들고 이동성을 잃으면 수동으로 사망 시간을 기록하려면 동물을 개별적으로 찌르고 머리나 꼬리의 작은 움직임을 확인해야 합니다. 이것은 일반적으로 지루하고 힘든 과정이지만 이를 가속화하기 위한 노력이 이루어졌습니다^10,11,12. 중요한 것은, 느린 실험 파이프라인이 노화에 대한 이해와 검증된 중재의 효과에 대한 진전을 방해한다는 것입니다.

정량적 데이터에 대한 노화 연구의 요구를 충족시키기 위해 미세유체 챔버에서 평판 스캐너 13,14,15,16,17,18에 이르는 다양한 접근 방식을 포함하여 데이터 수집을 자동화하기 위한 많은 기술이 개발되었습니다. LSM은 매우 정밀하고 정확한 수명 데이터 수집을 위한 광범위한 최적화에서 다른 방법과 다르며, 이는 사용자가 자동화된 분석을 검증, 수정 및 개선할 수 있는 광범위한 소프트웨어 제품군과 결합된 신중한 장비 교정 프로토콜의 개발을 통해 달성됩니다¹³. 이 소프트웨어는 원칙적으로 다양한 이미징 장비에 적용될 수 있지만, 실제로 대부분의 사용자는 수명에 큰 영향을 미치기 때문에 매우 중요한 요소인 환경 온도 및 습도를 미세 조정할 수 있도록 개조된 평판 스캐너를 사용합니다¹⁹. LSM은 환경 조건과 유전자형에 따라 며칠에서 몇 달 간격으로 20분마다 선충 이미지를 촬영합니다. 생성된 데이터는 수동 분석의 데이터에 비해 훨씬 더 높은 시간적 해상도를 가지며, 수집된 이미지는 수명 전반에 걸쳐 선충 위치에 대한 영구적인 시각적 기록을 제공합니다. 기계 학습 방법을 사용하여 사망 시간은 각 개인에게 자동으로 할당됩니다. 이러한 결과는 "Worm Browser"라는 클라이언트 소프트웨어를 사용하여 수동으로 신속하게 검증할 수 있습니다. 하드웨어와 소프트웨어의 결과로, LSM은 숙련된 연구자의 수동 사망 점수와 통계적으로 구별할 수 없는 생존 곡선을 생성할 수 있으며, 작업량 감소와 확장성 향상이라는 추가적인 이점이 있습니다¹³.

최신 버전의 LSM은 또한 선충의 일생 동안 형태학적 및 행동 데이터를 수집하고 각 개체의 수명과 함께 보고함으로써 행동 노화를 연구할 수 있습니다. 특히, LSM은 각 동물의 활발한 움직임 중단(VMC) 시간을 캡처하는데, 이는 개체의 수명과 구별되는 개체의 "건강 수명"을 정량화하는 데 자주 사용되는 랜드마크입니다. 수명 및 행동 노화 데이터를 동시에 수집함으로써 LSM은^{노화 20}의 다양한 표현형 결과에 차별적인 영향을 미칠 수 있는 중재 연구를 지원합니다. 거시적으로 관찰 가능한 다양한 표현형은 신체 운동 또는 인두 펌핑(pharyngeal pumping⁾²¹, 조직 무결성^{(tissue integrity)22}, 운동 속도 또는 자극에 의한 회전(stimulus-induced turning^{) 17}과 같은 행동 노화를 연구하는 데 사용될 수 있다. 서로 다른 노화 표현형 간의 비교는 노화 과정의 인과 구조 분석을 지원할 수 있습니다. 예를 들어, VMC와 수명의 비교는 최근 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 두 가지 뚜렷한 노화 과정을 특성화하는 데 사용되었다 ²³.

처음에는 예쁜꼬마선충(C. elegans)의 수명을 측정하기 위해 개발되었지만, LSM은 예쁜꼬마선충(C. elegans)을 포함한 다양한 선충 종의 생존 및 행동 데이터 수집을 지원합니다. 브릭새, C. 트로피칼리스, C. 자포니카, C. 브레네리, 그리고 P. 퍼시피쿠스²³. 이 기술은 수명, 스트레스 저항성 및 병원체 저항성에 대한 생물학적 및 환경적 개입의 효과에 대한 연구를 용이하게 하며 RNA 간섭 또는 옥신 유도 단백질 분해 시스템의 표적 분석과 같은 실험 도구와 결합할 수 있습니다. 현재까지, 그것은 광범위한 응용 분야에 대한 과학 문헌에서 사용되었습니다 6,24,25,26,27,28,29,30.

여기에서는 실험 설정의 초기 단계부터 결과 생존 곡선의 출력에 이르기까지 한천 플레이트를 사용하여 수명 기계 실험을 수행하기 위한 단계별 프로토콜을 간략하게 설명합니다. LSM의 두드러진 특징은 이러한 노력이 매우 우선적으로 진행된다는 것인데, 이는 연구자의 시간 대부분이 실험 설정 중에, 그리고 어느 정도는 사후 이미지 획득에 소비된다는 것을 의미합니다. 데이터 수집은 전체 실험 기간 동안 완전히 자동화되어 연구자가 "핸즈프리" 경험을 할 수 있도록 합니다. 여기에 설명된 단계는 다양한 유형의 생존 분석에서 공통적으로 사용되며, 수명, 내열성, 산화 스트레스 및 발병 기전 분석에 대해 동일한 실험 설정이 수행됩니다. 대표 결과 섹션에서는 분석 파이프라인의 효과를 설명하고 이미지 분석²³ 중 가장 중요한 단계를 강조하기 위해 최근에 출판된 원고의 데이터 하위 집합에 대해 논의합니다.

프로토콜

1. 소프트웨어 및 하드웨어 요구 사항

1. 평판 스캐너: 원칙적으로 LSM은 다양한 이미징 장치를 사용하여 구현할 수 있습니다. 스캐너 수정 및 초점에 대한 자세한 지침은 다른 곳에서 확인할 수 있습니다¹³. LSM 하드웨어는 보충 그림 1에 나와 있습니다.
2. 데이터 분석 도구: LSM 소프트웨어에는 Linux 기반 스캐너 제어 소프트웨어 패키지, 웹 브라우저 기반 메타데이터 관리 패키지, Windows 및 Linux 클라이언트 이미지 분석 소프트웨어 패키지의 세 가지 상호 작용 구성 요소가 있습니다. GitHub 리포지토리(https://github.com/nstroustrup/lifespan)에 게시된 소프트웨어 도구 설치 지침을 참조하세요.
3. 데이터 시각화 및 검증 소프트웨어: 클라이언트 프로그램인 Worm Browser를 사용하여 실험을 예약하고, 이미지 분석을 검증하고, 선충 이동에 대한 수동 주석을 수행하고, 생존 데이터를 출력합니다. 바이너리 실행 파일은 Windows 7, Windows 8 및 Windows 10의 웜 브라우저용으로 제공되며 웜 브라우저는 Linux 또는 Apple iOS의 소스 코드에서 컴파일됩니다. 설치 가이드는 위에서 언급한 GitHub 리포지토리에서 사용할 수 있습니다.

보충 그림 1: Lifespan Machine 하드웨어. 고무 매트에 절단된 16개의 구멍에 아래를 향하게 배치된 로드된 플레이트를 보여주기 위해 뚜껑이 열려 있는 평판 스캐너 장치 1개. 고무 매트는 유리 스캐너 표면에 놓입니다. 조건에 대한 레이블은 이미지 분석 중 문제를 방지하기 위해 플레이트의 측면에 기록됩니다. 테이프에 번호("1") 및/또는 장치 이름("Jabba")을 표시하면 나중에 여러 스캐너 장치로 작업할 때 샘플 위치를 쉽게 확인할 수 있습니다. LSM 하드웨어 구성 요소에 대한 자세한 내용은 다른 곳에서 찾을 수 있습니다¹³. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

2. 실험일 전 설정

1. 인큐베이터의 온도 보정: 환경 온도는 C의 주요 결정 요인입니다. 예쁜꼬마선충 수명¹⁹. 정확한 결과를 얻으려면 실험 내내 일정하게 유지된 세심하게 보정된 온도에서 이미지 획득을 수행하십시오. 이를 위해 실험을 시작하기 며칠 전에 작동 중에 각 스캐너 표면의 온도를 측정하고 보정합니다. 다른 곳(³¹ )에 설명된 대로 고정밀 열전대를 사용하십시오( 재료 표 참조).
2. 스캐너 플레이트 레이아웃: 실험을 시작하기 전에 각 스캐너에 대한 배양 플레이트의 최적 레이아웃을 계획합니다.
   알림: 이것의 목적은 스캐너 사이와 각 스캐너 표면의 온도 변화로 인한 교란 요인의 도입을 방지하는 것입니다. 스캐너는 평균 표면 온도에서 미묘하게 다르며, 더욱이 표면 전체에 걸쳐 미묘한 온도 편향을 나타낸다(³¹).
   1. 스캐너 플레이트 위치: 후속 데이터 분석에서 이러한 열 효과를 제어하려면 스캐너 위치와 관련된 생물학적 공변량을 무작위화하고 모든 스캐너에서 플레이트 위치를 표준화합니다.
   2. 스캐너의 샘플 수: 16개의 고무 매트 레이아웃( 재료 표 참조)을 사용하는 경우 각 스캐너에 조건당 4개의 플레이트를 배치하고 총 4개 이상의 스캐너를 배치합니다. 이렇게 하면 각 조건이 여러 스캐너에 분산되어 스캐너 온도의 교란 효과가 데이터 분석¹³ 중에 식별되고 제거될 수 있습니다. 이 분석을 보다 간단하게 하려면 각 스캐너에 공유 기준 조건(예: 야생형 샘플)을 포함하십시오.
      참고: 일반적으로 스캐너 팬의 배치로 인해 고무 매트의 오른쪽 상단 모서리에 있는 플레이트가 건조되기 쉽습니다. 필요한 경우 이 위치를 비워 둡니다.
3. 플레이트 및 시료 전처리
   1. 배양 플레이트 주입: 스캐너 배양 플레이트를 최적으로 건조하려면( 재료 표 참조) 선충을 넣기 4일 전에 한천 배지를 붓습니다. 플레이트에 다양한 용량의 한천을 추가할 수 있도록 스캐너 초점을 조정할 수 있지만 표준 플레이트 용량은 8mL입니다.
      알림: 특히 대규모 실험의 경우 연동 펌프로 플레이트를 붓는 것이 도움이 될 수 있습니다.
   2. 플레이트 파종: 박테리아 잔디의 적절한 건조 및 성장을 허용하기 위해 실험 시작 최소 2일 전에 원하는 박테리아 배양액으로 플레이트를 파종합니다. 일반적으로 200μL의 박테리아 배양은 몇 주 동안 40마리의 선충을 먹일 잔디밭을 형성하기에 충분합니다.
      알림: 이미징에 일반적으로 사용되는 플레이트는 표준 배양 페트리 접시보다 더 단단히 밀봉되어 있습니다. 따라서 실험실 후드 내부의 플레이트를 일반적으로 약 1시간 동안 또는 적절하게 건조될 때까지 씨를 뿌리고 건조하는 것이 좋습니다.
4. 선충 취급
   1. 개체군 크기: 단일 플레이트에서 안정적으로 이미지화할 수 있는 선충의 수는 유전자형, 선충이 플레이팅되는 연령 및 각 플레이트에 추가되는 음식의 양에 따라 다릅니다. 초기 성체에 시작하는 수명 실험의 경우 접시당 약 40마리의 동물을 적재합니다. 이 숫자는 충분한 음식을 보장하고 혼잡을 방지합니다.
   2. 대규모 개체군 증가: 개체군 확장 및 동기화에 대비하려면 선택한 동기화 방법에 적합한 선충 개체군으로 시작합니다(아래 참조). 야생형 N2 동물의 경우 성체 2일째인^최대 알 생산 연령에 동물에 대한 동기화를 수행하는 것을 목표로 합니다.
      참고: 성충 둘째 날에 동물을 사용하여 개체군을 동기화하는 또 다른 이유는 인구 이질성에 기여하는 요인으로 모계 연령을 제거하기 위해서입니다. C의 산모 연령. 예쁜꼬마선충(elegans )은 자손의 여러 적합성 형질에 영향을 미치는 것으로 나타났으며, 2일차 야생형 동물은 "최고 품질"의 자손을 생산한다³³.
   3. 연령 동기화 수행: 정확한 결과를 얻으려면 동물의 나이를 가능한 한 정확하게 동기화하십시오. 이 프로토콜에서, 연령 동기화는 변형된 차아염소산염 처리(³⁴)를 사용하여 수행된다. 다른 방법으로는 알 낳기, L1 유충 체포 또는 L4 유충을 수동으로 따는 동기화가 포함될 수 있습니다.
      참고: 차아염소산염 처리에 의한 연령 동기화를 위해 각 성인 자웅동체에서 3-4개의 알을 얻을 것으로 예상합니다.
   4. 자손이 없는 개체군 유지: L4 후기 단계에서 선충을 5-플루오로-2'-데옥시우리딘(FUdR)에 노출시켜 자손이 없는 개체군을 유지합니다.³⁵.
      참고: 저용량에서 FuDR은 생식세포에 거시적으로 눈에 띄는 변화를 일으키거나 난모세포 생성 속도를 변경하지 않고 배아 발달에 치명적입니다. 다른 방법으로는 온도 멸균 돌연변이체를 사용하거나, 멸균 RNAi 구조를 사용하거나, 단순히 생식 후 노화까지 기다렸다가 이미징을 위해 선충을 플레이트로 옮기는 방법이 있습니다.
   5. 개체군 이동: 수천 마리의 동물을 플레이트 간에 이동할 때 백금/이리듐 와이어와 관련된 표준 프로토콜은 힘들 수 있습니다. 선충의 액체 현탁액과 관련된 방법은 이동을 용이하게 하고 더 효율적으로 만듭니다. M9 + Mg 완충액(_Na2HPO4 42.27mM, KH2PO42.05mM, NaCl85.56mM, MgSO41mM)으로 선충을 채취하고, 선충이 중력에 의해 가라앉으면 총 부피를 줄인 다음 선충을 이미징에 사용되는 플레이트로 빠르게 옮깁니다.
      참고: 액체 현탁액으로 선충을 옮기면 각 플레이트로 옮겨지는 동물의 수가 달라질 수 있습니다. 실험적 변동성을 피하기 위해 각 플레이트의 선충 수와 일치하도록 노력하십시오.
   6. 중재 적용: 실험 중에 이미지 획득을 중지했다가 다시 시작하면 이미지 분석이 복잡해집니다(토론 참조). 따라서 필요한 모든 선충 처리가 완료된 후에만 LSM 실험을 시작하십시오.
5. 고무 매트 살균: 많은 수의 매트를 알루미늄 호일로 개별적으로 포장하여 동시에 오토클레이브합니다.
   알림: 고무 매트는 곰팡이 또는 박테리아 오염 물질이 축적되는 것을 방지하기 위해 사용 사이에 멸균해야 합니다. 일반적으로 사용되는 대부분의 고무 유형은 공격적인 에탄올 처리에 의해 분해됩니다.

3. 실험 당일 설정

1. 플레이트 지지대 및 스캐너 유리 준비: 플레이트 취급을 단순화하려면 페트리 접시를 스캐너 표면에 직접 로드하지 말고 유리판으로 지지되는 고무 매트를 사용하여 제자리에 고정하십시오( 재료 표 참조). 개체군은 이 유리를 통해 이미지화되므로 유리를 깨끗하게 유지하고 김서림 방지, 소수성 및 살균 코팅으로 처리하십시오( 재료 표 참조).
   1. 플레이트를 인큐베이터에 넣기 전에 김서림 방지 유리 클리너로 양쪽의 플레이트 지지 유리 표면을 청소하십시오.
   2. 플레이트를 지지 유리에 장착하기 전에 보호용 소수성 유리 처리( 재료 표 참조)를 적용하여 고무 매트와 접촉할 유리 측면의 김서림을 최소화합니다. 이 트리트먼트를 잘 펴 바르고 다음 단계로 진행하기 전에 5-10분 동안 유리 위에 그대로 두십시오. 잔여물을 제거하기 위해 도포 후 세게 청소하십시오.
   3. 70% 에탄올을 도포하여 고무 매트와 접촉할 유리 표면을 소독합니다. 1분 또는 2분 정도 그대로 두었다가 천이나 종이 타월로 닦아냅니다.
2. 스캐너에 플레이트 적재
   1. 먼저 처리된 플레이트 지지 유리 위에 오토클레이브 고무 매트를 놓습니다.
   2. 장전된 선충으로 이미징하는 데 사용되는 플레이트에서 뚜껑을 제거하고 유리 표면을 향하는 고무 매트 위치에 놓습니다. 예를 들어 고무 매트가 모든 판 주위에 단단히 밀봉되어 있는지 확인하십시오.ample, 위에 다른 유리 시트를 추가하고 평평하게 놓이도록 하거나 각 판의 상단을 두드려서(느슨한 판은 약간 움직여 유리에 부딪혀 소리를 내는 반면 단단히 고정된 판은 두드려도 움직이지 않습니다).
      알림: 플레이트 내용물과 의도한 스캐너에 대한 정보가 포함된 마킹 테이프로 플레이트 지지 유리의 각 시트에 개별적으로 라벨을 붙이는 것이 유용합니다. 이 데이터는 실험 후 플레이트 위치와 관련된 잠재적인 모호성을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.
   3. 플레이트를 스캐너에 로드하기 전에 스캐너 팬의 플러그를 뽑아 플레이트를 로드하는 동안 실험자의 손가락을 보호하십시오.
   4. 플레이트와 이를 지지하는 유리판을 스캐너 표면에 부드럽게 밀어 넣습니다.
      알림: 고무 매트에 직접 압력을 가하면 매트가 플레이트 지지 유리를 가로질러 미끄러지므로 피하십시오. 매트가 미끄러지면 플레이트가 매트에서 느슨해지는 경우가 많습니다.
   5. 스캐너 팬을 다시 활성화하고 앞면 및 측면 팬에 전원이 공급되는지 육안으로 확인합니다. 스캐너의 전원이 꺼져 있으면 이 시점에서 스캐너를 켭니다.

4. 사전 이미지 획득

참고: 이미지 획득 중 모든 소프트웨어 기반 단계를 요약한 포괄적인 순서도는 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1: Lifespan Machine 이미지 분석 파이프라인의 그래픽 개요. 이미지 획득 전, 도중, 사후 이미지 획득 단계는 주로 웹 인터페이스(WI, 빨간색)와 웜 브라우저(WB, 녹색)에서 수행됩니다. 일부 단계는 3a단계의 TXT 문서, 4b단계의 Photoshop 또는 이에 상응하는 문서, 13단계의 JMP 또는 이에 상응하는 문서와 같은 다른 플랫폼(O, 파란색)에서 수행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 이미지 획득 설정: 실험 일정과 각 스캐너의 플레이트 위치를 지정하는 파일을 생성하여 이미지 획득을 구성합니다.
   참고: 이 파일에는 실험 제목, 이미지 캡처 빈도 및 총 실험 기간과 같은 중요한 메타데이터가 포함되어 있습니다. 일반적으로 이 파일은 생성되지 않습니다 de novo 각 실험에 대해 이전 실험의 실험 파일이 템플릿으로 재사용됩니다. 사용자의 첫 번째 실험의 경우 템플릿 파일(보충 파일 1).
   1. 미리 보기 캡처 요청: 각 스캐너에 있는 모든 플레이트의 위치를 제공합니다. 이 프로세스의 속도를 높이기 위해 몇 가지 도구가 제공됩니다. 먼저 스캐너를 사용하여 "미리보기 캡처"라고 하는 전체 스캐너 표면의 이미지를 얻습니다. 미리보기 캡처 이미지가 줄무늬나 플레이트 가장자리 자르기 없이 이미징할 각 플레이트의 전체 표면을 명확하게 표시하는지 확인합니다(그림 2A).
      1. 웹 인터페이스를 사용하여 메인 페이지의 Image Acquisition 섹션을 찾아 Capture Devices and Image Servers라는 링크를 따라갑니다. 해당 페이지에서 Image Capture and Processing Servers(이미지 캡처 및 처리 서버) 상자에서 Search for New Devices (i.e, scanners)(새 장치(예: 스캐너) 검색)이라고 표시된 버튼을 클릭합니다. 서버 옆에 있는 [log] 링크를 클릭하여 서버의 스캐너 탐지 진행 상황을 모니터링합니다.
         알림: 이 단계를 수행하기 전에 원하는 스캐너의 전원이 "켜져 있고" 서버에 연결되어 있는지 확인하십시오.
      2. 웹 인터페이스의 동일한 페이지에서 서버에 연결된 각 스캐너가 이미지 캡처 장치 상자에 나타나는지 확인합니다. 장치가 성공적으로 감지되면 "현재 상태" 아래의 "누락" 레이블이 더 이상 표시되지 않습니다. 새로 로드된 플레이트가 들어 있는 각 스캐너에 해당하는 확인란을 선택합니다.
      3. Image Capture Devices(이미지 캡처 장치) 섹션 하단에서 Request Preview Capture(미리보기 캡처 요청) 버튼을 클릭합니다. 1분 또는 2분 이내에 스캐너에 불이 들어오고 스캔이 시작됩니다.
         알림: 유리 지지 시트의 초기 위치는 모든 플레이트를 볼 수 있는 범위로 가져오기 위해 자주 조정해야 합니다. 미리보기 캡처 이미지를 검사하고 플레이트 위치를 조정한 다음 새 미리보기 캡처 이미지를 다시 촬영하여 위치를 수정할 수 있습니다. 스캔이 매우 느리게 진행되거나(한 번의 캡처 스캔에 몇 분) 미리 보기 캡처 이미지에 긴 흰색 줄무늬가 있는 경우 이는 플레이트, 고무 매트 또는 기타 물체가 스캐너의 보정 영역(스캐너 표면에 흰색 화살표로 표시) 내에서 빛을 차단하고 있다는 신호입니다. 유리 지지 유리만 이 영역을 차지하도록 모든 물체를 재배치해야 합니다.
   2. 스캔 영역 정의: 웜 브라우저에서 다음 단계에 따라 미리 보기 캡처 이미지를 분석하고 데이터 분석을 위한 각 플레이트의 위치를 지정하는 데 사용되는 단일 합성 이미지로 조합합니다. 결과 이미지가 그림 2B와 유사한지 확인합니다.
      1. 먼저 웜 브라우저를 사용하여 파일 > 이미지 열기 메뉴 옵션을 선택하여 각 미리보기 캡처 이미지를 열고 원하는 이미지를 선택합니다.
      2. 각 이미지에서 플레이트가 있는 영역의 열을 클릭하여 선택합니다(고무 매트에 플레이트 위치가 16개인 경우 열 4개 선택).
         참고: 스캔 영역은 넓은 영역에 대해 스캐너 캡처가 느려져 선충의 움직임으로 인해 이미지가 흐려지므로 긴 열(넓은 행이 아님)로 지정해야 합니다.
      3. 모든 이미지가 정의되면 이미지 획득 > 스캔 영역 정의 > 선택한 스캔 영역을 디스크에 저장 메뉴 항목을 선택하고 원하는 위치를 선택하여 영역 사양을 디스크로 내보냅니다.
   3. 실험 일정을 생성합니다.
      1. 보충 파일 1의 형식에 따라 실험 이름, 스캐너에 있는 각 열의 물리적 위치(4.1.2.3단계에서 생성된 스캔 영역 파일에서 복사됨), 실험의 총 기간 및 이미지 캡처 빈도가 포함된 파일을 조합하고 이를 TXT 및 XML 파일로 저장합니다.
      2. 그런 다음 Worm Browser(웜 브라우저)에서 Image Acquisition(이미지 획득) > Submit Experiment Schedule(실험 일정 제출)을 클릭하고 생성된 XML 파일을 선택합니다. 웜 브라우저는 일정 요약을 출력할지 아니면 실험을 실행할지 묻습니다. Generate a summary file(요약 파일 생성)을 클릭합니다.
   4. 요약 파일 확인: 실험 일정을 제출하면 웜 브라우저가 일정 요약을 출력합니다. 이 요약은 화면에 표시되고 디스크에 기록됩니다. 이를 읽고 예약된 캡처 날짜와 스캐너의 위치, 이름 및 수를 확인합니다.
   5. 실험 일정 제출: 요약 파일이 만족스러우면 Image Acquisition > Submit Experiment Schedule 메뉴 옵션을 선택하여 실험 일정에 대한 XML 파일을 Worm 브라우저에 다시 로드합니다. 웜 브라우저는 일정 요약을 출력할지 또는 실험을 실행할지 여부를 두 번째로 묻습니다. 이번에는 실행! .
      참고: 실험을 제출한 후 몇 분 후에 웹 인터페이스를 사용하여 실험이 성공적으로 제출되었고 모든 스캐너에서 스캔이 수집되고 있는지 확인하는 것이 좋습니다. 특히 대규모 실험에서 처음 몇 번의 스캔을 놓치는 것이 일반적입니다.
   6. 웹 인터페이스에서 실험 구성: 사용량이 많은 스캐너 클러스터는 다양한 사용자가 수집한 수백 개의 실험 데이터 세트를 생성할 수 있습니다. 이 목록을 구성하려면 실험을 별도의 그룹(예: 실험을 담당하는 사용자의 이름)에 할당합니다.
      1. 새 그룹 만들기 또는 기존 그룹 수정: 웹 인터페이스에서 Image Acquisition이라는 상자 아래에 있는 실험 그룹 관리를 클릭하여 새 그룹을 만듭니다. 표시되는 새 페이지에서 새 그룹 만들기에 원하는 이름을 추가하고 만들기를 클릭합니다. 기존 그룹의 이름을 수정하려면 같은 상자에서 기존 그룹 수정 옆에 있는 원하는 그룹을 선택한 다음 수정을 선택합니다.
      2. 그룹에 실험 할당: 특정 그룹에 새 실험을 할당하려면 웹 인터페이스로 이동하여 원하는 실험을 찾으면 기본적으로 실험 목록 하단의 그룹 없음 그룹에 할당됩니다. 실험 섹션 오른쪽에 있는 수정이라고 표시된 링크를 클릭하고 드롭다운 목록을 사용하여 사용할 그룹의 이름을 선택합니다. 그런 다음, 저장을 선택합니다.
   7. 실험 취소:
      참고: LSM은 실험 일정에 최종 스캔이 지정될 때까지 자율적으로 계속 작동합니다. 실험 일정이 완료된 후 LSM은 기본적으로 스캔을 계속 수집하지만 자동 스캔이라는 프로세스에서 이미지 데이터를 즉시 삭제합니다. 이러한 자동 스캔은 스캐너가 꺼지고 냉각되는 것을 방지하고 동일한 공간에서 실행되지만 다른 실험에서 실행되는 다른 실험이 다른 스캐너의 종료에 영향을 받지 않도록 표준 온도 프로필을 유지하기 위해 수행됩니다.
      1. 자동 검사 중지: 웹 인터페이스에서 진행 중인 실험에서 자동 검사를 중지하려면 원하는 실험 옆에 있는 편집 을 클릭한 다음 보류 중인 검사 취소를 클릭하고 예약된 캡처 취소를 선택합니다.

그림 2: 캡처 이미지 미리보기 및 스캔 영역 선택. (A) 실험의 각 스캐너에 대해 미리보기 캡처 이미지가 생성됩니다. (B) 한 번에 한 줄의 플레이트(빨간색 상자)를 선택하면 스캔 속도가 빨라지고 너무 넓은 영역을 스캔하여 웜 모션 블러가 발생하는 것을 방지할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

5. 이미지 취득

참고: 다음 단계는 실험이 실행되는 동안 또는 완료된 후에 모두 수행할 수 있습니다.

1. 실험의 마스크 파일 출력: 스캐너의 원시 이미지 데이터에는 처리할 필요가 없는 많은 영역(플레이트 외부 영역)이 포함되어 있습니다. 각 플레이트에 개별적으로 분석에 초점을 맞추기 위해 각 스캐너에서 각 플레이트가 차지하는 영역을 지정하는 "마스크"가 생성됩니다. 스캐너에서 수집한 이미지에 각 플레이트의 위치를 오버레이로 그려 이 마스크를 생성합니다.
   1. 웜 브라우저를 사용하여 파일 > 현재 실험 선택을 선택하여 원하는 실험을 선택한 다음 실험 이름을 클릭합니다.
   2. 다시 웜 브라우저(Worm Browser)에서 이미지 획득(Image Acquisition) > 샘플 마스크 정의(Define Sample Masks) > 실험 마스크 합성 생성(Generate Experiment Mask Composite)을 선택하고 원하는 위치에 마스크를 저장합니다. 결과 파일이 그림 3A와 유사한지 확인합니다.

그림 3: 샘플 마스크를 사용한 각 스캐너의 플레이트 위치 사양. 그림 1에 표시된 컬럼 선택 내에서 플레이트를 독립적으로 분석하려면 이미지 마스크 복합재를 생성하여 개별 플레이트를 식별해야 합니다. (A) 스캐너 스캔 캡처는 이미지 조작 소프트웨어로 열립니다(스캔한 선택 항목 위의 스캐너 이름 "han"과 각 열을 나타내는 "a-d"에 유의). (B) 마스크 합성에서 각 플레이트의 위치를 표시하기 위한 마스크 생성의 개별 단계에서는 배경을 검은색으로 설정하고, (C) 배경을 확대했다가 축소하여 선택되지 않은 플레이트의 들쭉날쭉한 가장자리와 가장자리를 제거하고, (D) 전경 플레이트를 선택하고 영역을 완전히 흰색 픽셀로 채웁니다. (E) LSM이 스캔된 행의 개별 플레이트를 인식하기 위해 행의 각 흰색 영역은 일반적으로 밝기가 증가하는 서로 다른 회색 음영으로 채워집니다. (F) 이 단계에서 마스크가 저장됩니다(Photoshop에서 생성된 경우 레이어가 지정되지 않은 LZW 압축). 그런 다음 Worm Browser에서 마스크를 스캔하고 소프트웨어에서 마스크를 시각화합니다. 올바른 마스크 시각화는 중앙에 작은 십자 모양이 있고 각 행에 대해 다른 색상이 있는 플레이트당 하나의 정의된 사각형을 표시해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

2. 실험 마스크에 주석 달기: 이미지 조작 프로그램(예: Photoshop 또는 GIMP)으로 이전 단계에서 생성된 파일을 열어 이미지에서 각 플레이트의 위치를 표시합니다. Photoshop을 사용한 모든 마스크 편집 단계에 대한 개요는 아래에 설명되어 있습니다.
   1. Photoshop에서 [ 칠] 도구를 선택하고 허용치를 0으로 설정하고 연속 옵션을 선택한 다음 앤티앨리어싱을 선택하지 않은 상태로 선택합니다. 회색 배경을 클릭하여 완전히 검은색으로 설정합니다. 결과 이미지가 그림 3B와 유사한지 확인합니다.
   2. 마술 지팡이 도구를 사용하여 앨리어싱을 끄고, 허용오차를 0으로 설정하고, 연속 옵션을 선택한 상태에서 검은색 배경을 선택합니다. 가장자리를 매끄럽게 하려면 선택 > 수정 > 확장을 클릭하여 선택한 배경을 30픽셀 확장합니다. 그런 다음 [선택 > 수정 > 계약]에서 선택 영역을 20픽셀씩 축소합니다. 결과 이미지가 그림 3C와 유사한지 확인합니다.
   3. 매끄럽게 다듬어진 배경을 검은색 픽셀로 완전히 채웁니다(예: [채우기 도구] 허용치를 255로 설정하고 선택한 영역을 채웁니다. 그런 다음 선택 > 반전 을 클릭하여 선택을 반전하고 전경을 선택합니다. 예를 들어, 채우기 도구 허용치를 255로 설정하고 영역을 흰색으로 채워 새 영역을 완전히 흰색 픽셀로 채웁니다. 결과 이미지가 그림 3D와 비슷한지 확인합니다.
   4. 단일 영역 내에서 각 플레이트를 분리하려면 밝기를 증가시키는 다른 회색 그라데이션으로 각 행을 채웁니다. 이 작업은 채우기 도구를 사용한 다음 허용 오차를 0으로 설정하여 원하는 색상을 선택하여 수행할 수 있습니다. 결과 이미지가 그림 3E와 유사한지 확인합니다. "레이어"를 지정하지 않고 LZW 압축으로 저장합니다.
      알림: 플레이트의 순서는 지정된 영역의 색상으로 설정됩니다. 플레이트 1-4의 이름을 위에서 아래로 순서로 지정하려면 각 행의 밝기를 증가시키는 색상을 지정합니다.
   5. 웜 브라우저에서 이미지 획득(Image Acquisition) > 샘플 마스크 정의(Define Sample Masks) > 실험 마스크 합성에 그려진 플레이트 위치 분석(Analyze Plate Locations Drawn on Experiment Mask Composite)을 선택하고 이전 단계에서 생성된 파일을 선택합니다. 이제 소프트웨어가 제출된 마스크를 분석하는 데 몇 분 정도 걸립니다.
   6. 웜 브라우저는 마스크 시각화를 표시합니다. 마스크에 파일의 잠재적 오류가 있는지 검사합니다. 플레이트의 각 행이 다른 색상으로 채워져 있고 색상이 지정된 직사각형으로 윤곽선이 표시되어 있는지 확인합니다. 결과 이미지가 그림 3F와 유사한지 확인합니다.
      참고: 하나의 플레이트에 두 개 이상의 원이 표시되거나 두 개의 원이 같은 색상을 공유하는 경우 5.2단계로 돌아가 마스크 파일을 수정한 다음 웜 브라우저에 다시 로드합니다.
   7. 마스크 시각화가 올바른지 확인한 후 웜 브라우저에서 Image Acquisition > Define Sample Masks > Submit Analyzed Experiment Mask Composite을 Submit Analyzed Experiment Mask Composite to Cluster를 선택합니다. 이제 이미지 분석 서버가 실험에서 모든 플레이트의 위치를 분석합니다.
3. 마스크 적용: LSM은 마스크를 사용하여 원시 이미지 데이터를 개별 플레이트로 분할합니다. 이 프로세스를 시작하려면 웹 인터페이스를 사용하여 마스크 적용 작업을 예약합니다.
   1. 작업을 제출하기 전에 모든 스캐너가 마스크의 영역을 식별했는지 확인합니다. 웹 인터페이스의 기본 페이지로 이동하여 실험 이름과 Image Analysis라는 열을 찾은 다음 Run Analysis(분석 실행)를 클릭합니다. 실험 샘플 의 모든 장치에 식별된 영역이 있는지 확인합니다.
   2. 마스크를 적용하려면 동일한 인터페이스에서 New Job for All Samples(모든 샘플에 대한 새 작업)를 클릭합니다. Schedule a Job for Individual Images(개별 이미지에 대한 작업 예약) 상자에서 Apply Mask(마스크 적용) 상자를 선택한 다음 Save Job(작업 저장) 상자를 선택합니다.
      참고: 마스크는 이미 캡처된 모든 이미지와 향후 캡처된 모든 이미지에 적용됩니다.
4. 플레이트 품질 관리 수행:
   참고: 오염, 건조 또는 김서림이 있는 플레이트는 이 이미지 분석 단계에서 관측 중단됩니다. 오염된 플레이트, 건조된 플레이트, 김서림 플레이트, 최적의 플레이트의 예가 그림 4에 나와 있습니다. 검열의 다른 이유로는 굶주림, 빈 접시 또는 불임 개체군의 유충이 있습니다. 유효하지 않은 판에는 종종 기계가 선충으로 해석하는 것을 목표로 하는 복잡한 모양이 포함되어 있습니다. 이미지 분석의 이후 단계에서 처리 시간이 길어지는 것을 방지하기 위해 이 단계에서 유효하지 않은 플레이트를 제외하는 것이 중요합니다.
   1. 웹 인터페이스를 사용하여 원하는 실험과 Annotate Plate Information(플레이트 정보 주석 달기) 열을 찾아 By Image(이미지별)를 선택하여 중도절단할 플레이트를 제외합니다.
   2. 플레이트를 검사하려면 디스플레이 이미지를 클릭합니다.
      참고: 이미지 표시 단계가 제대로 작동하지 않으면 Linux 서버가 제대로 구성되지 않았을 수 있습니다. 이 작업을 수행하는 방법에 대한 지침은 앞서 언급한 GitHub 리포지토리의 소프트웨어 설치 가이드에서 확인할 수 있습니다.
   3. 플레이트를 제외하려면 Censor 체크 박스를 선택하고 드롭다운 상자에서 Reason Censored라는 옵션을 선택한 다음 각 페이지에 대해 Save(저장)를 클릭합니다.
5. 메타데이터 정보 추가: 메타데이터는 실험에서 각 플레이트의 내용을 설명합니다. 그런 다음 이 정보는 이후에 생성되는 모든 통계 데이터 파일에 포함됩니다.
   1. 균주, 유전자형, 온도, 식품 등과 관련된 메타데이터 정보를 추가하려면 웹 인터페이스의 메인 페이지로 이동하여 원하는 실험과 Annotate Plate Information이라는 열을 찾은 다음 By Position을 선택합니다.
   2. 레이블을 입력하고 왼쪽 하단 모서리에 있는 장치에 저장 을 클릭하여 메타데이터를 저장할 스캐너를 선택합니다.
   3. 모든 레이블을 다시 입력할 필요 없이 서로 다른 스캐너 간에 메타데이터를 재사용하려면 오른쪽 상단 모서리에 있는 장치에서 로드 로 이동하여 메타데이터를 재사용할 스캐너를 선택하고 장치에서 로드를 클릭합니다.
6. "0-age" 시간 지정: 기본적으로 LSM은 UNIX epoch의 시작과 관련된 시간을 측정합니다. 이것은 거의 편리하지 않으므로 참조 시간의 지정이 필요합니다(예: 모든 개체가 부화하거나 성체에 도달한 날짜).
   1. 영점 시간 정보를 지정하려면 웹 인터페이스의 기본 페이지로 이동하여 원하는 실험과 Image Analysis라는 열을 찾은 다음 Run Analysis(분석 실행)를 선택합니다.
   2. 표시되는 새 페이지에서 모든 지역에 대한 새 작업을 선택합니다. Update Region Information(지역 정보 업데이트)이라는 상자에서 Time at which Animals had 0 Age(동물의 나이가 0인 시간)를 선택하고 정보를 추가한 다음 Update Selected Fields(선택한 필드 업데이트)를 클릭합니다.
      참고: 모든 동물이 동일한 제로 에이지 시간을 공유하지 않는 경우 대신 특정 동물 유형에 대해 새 작업을 선택하고 각 그룹에 대해 위의 단계를 반복합니다.
7. 웜 감지 예약: LSM은 플레이트의 위치에 따라 각 선충의 감지를 자동화할 수 있습니다.
   1. 각 이미지에 대한 선충 자동 감지를 시작하려면 웹 인터페이스의 기본 페이지로 이동하여 원하는 실험과 Image Analysis(이미지 분석)라는 열을 찾은 다음 Run Analysis(분석 실행)를 선택합니다.
   2. 표시되는 새 페이지에서 New Job for All Regions(모든 지역에 대한 새 작업)를 클릭한 다음 Schedule a Job for Individual Images(개별 이미지에 대한 작업 예약)라는 상자에서 Median Filter(중앙값 필터) > Threshold(임계값) > Worm Detection(웜 감지) > Save Job(작업 저장) 상자를 선택합니다. 이러한 작업은 캡처된 모든 과거 및 미래 이미지에 적용됩니다.
      참고: 특정 균주 또는 조건에 대해서만 작업을 예약하려면 대신 특정 동물 유형에 대한 작업을 클릭합니다. 객체 분류는 LSM의 장기 스토리지 디렉토리에 있는 Models 하위 폴더에 저장된 파일로 지정된 SVM 모델을 사용하여 수행됩니다. LSM에 대한 V2.0 선충 감지 매개 변수 집합은 GitHub 저장소에서 다운로드할 수 있습니다.

그림 4: 웹 인터페이스를 사용한 후판 품질 관리. 웜 이동 분석 전에 웹 인터페이스에서 최적화되지 않은 플레이트를 관측하는 것은 이미지 처리 파이프라인의 속도를 높이는 데 매우 중요합니다. 제거 대상 플레이트의 예로는 (A) 건조, (B) 오염 또는 (C) 김서림 조건이 있습니다. (D) 추가 분석에 포함될 최적의 플레이트. 10mm의 축척 막대가 미리보기 캡처 이미지에 겹쳐집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. 사후 이미지 획득

참고: 웜 감지가 완료된 후 실험에서 수집된 모든 데이터는 시간이 지남에 따라 집계되어 각 개인의 수명 주기를 추적하고 모든 개체의 사망 시간을 식별해야 합니다. 실험에 참여한 모든 동물이 죽을 때까지 기다렸다가 모든 웜 감지 작업이 완료될 때까지 기다린 후 다음 단계를 수행합니다.

1. 이동 분석을 예약합니다.
   1. 이동 분석은 시간 경과에 따른 모든 실험 데이터를 통합하여 사망 시간을 추정합니다. 이 작업을 시작하려면 웹 인터페이스의 기본 페이지로 이동하여 이미지 분석 열에서 원하는 실험을 찾습니다. 분석 실행 링크를 선택합니다.
   2. 새 페이지가 나타나면 New Job for All Regions(모든 지역에 대한 새 작업) 링크를 클릭하고 풀다운 메뉴인 Schedule a Job for an Entire Region(전체 지역에 대한 작업 예약)에서 Analyze Worm Movement(웜 이동 분석)를 선택한 다음 Save Job(작업 저장) 버튼을 클릭합니다.
   3. LSM 이미지 수집 서버는 모든 플레이트의 움직임을 자동으로 분석하기 시작합니다.
      참고: 움직임 분석은 가장 큰 단일 작업입니다. 최신 멀티 코어 프로세서에서는 1개월의 수명 실험에서 각 플레이트를 분석하는 데 20분 이상이 걸릴 수 있습니다.
2. 스토리보드 생성: 움직임 분석이 완료된 후 LSM 스토리보드를 통해 사용자는 자동화된 결과를 수동으로 검증하고 소프트웨어가 선충의 형태 및 행동에 대해 올바른 가정을 하고 있는지 확인할 수 있습니다.
   1. 웹 인터페이스의 기본 페이지에서 원하는 실험과 Image Analysis라는 열을 찾고 Run Analysis(분석 실행)를 선택합니다. 표시되는 새 페이지에서 새 실험 작업을 클릭합니다. 그런 다음 Schedule a Job for an Entire Region(전체 지역에 대한 작업 예약) 섹션에서 Generate Animal Storyboard(동물 스토리보드 생성)를 선택하고 Save Job(작업 저장)을 클릭합니다.
   2. LSM이 스토리보드 생성을 완료한 후 웜 브라우저로 이동하여 원하는 실험을 선택합니다. 주 메뉴로 돌아가 Validation > Browse Entire Experiment > Immediately after Each Worm's Death를 선택합니다.
3. Worm Browser의 스토리보드에 주석 달기: Worm Browser의 일반적인 스토리보드는 다음과 같습니다 그림 5.
   1. "non-worm" 개체에 주석 달기
      참고: 이동 중에 감지된 각 개체는 예상 사망 시간을 기준으로 순서대로 스토리보드에 표시됩니다. 사용자가 달리 지정하지 않는 한 각 객체는 결과 생존 곡선에 포함됩니다. LSM 객체 분류는 검출되지 않은 선충의 수를 최소화하기 위한 절충으로 높은 거짓 양성 비율을 갖도록 의도적으로 보정됩니다. 웜이 아닌 물체를 배제하는 것은 고품질 생존 곡선을 얻는 데 중요합니다(대표 결과 참조). 일반적으로 스토리보드의 첫 번째 페이지와 마지막 페이지에서 많은 수의 비웜 개체가 발견되며, 이러한 개체는 대량으로 빠르게 수동으로 제외할 수 있습니다.
      1. 스토리보드에서 웜이 아닌 개체를 제외하려면 개체의 이미지를 마우스 오른쪽 단추로 한 번 클릭합니다. 이제 제외된 개체의 윤곽선이 흰색 상자로 표시됩니다. 여러 개체를 동시에 제외하려면 Ctrl 키를 누른 상태에서 개체를 마우스 오른쪽 단추로 한 번 클릭하면 스토리보드 페이지의 모든 개체가 제외됩니다.
      2. 분석에서 객체를 제외시킨 후 다시 마우스 오른쪽 버튼을 두 번 클릭하여 해당 객체를 다시 포함할 수 있습니다.
      3. 스토리보드 주석 중에 만든 주석을 저장하려면 저장 버튼을 클릭합니다. 주석을 다는 동안 진행 상황을 자주 저장하는 것이 좋습니다.
   2. 사망 시간에 주석을 달다:
      참고: 사용자 개입 없이 LSM은 대부분의 모집단의 사망 시간을 정확하게 추정합니다. 그러나 각 실험에서 무작위 하위 집합을 수동으로 검증하여 자동화된 결과의 정확성을 정기적으로 확인하는 것이 좋습니다. 수명이 가장 짧은 개인과 가장 오래 사는 개인에 특별한 주의를 기울여야 하는데, 자동화된 분석의 모든 오류는 이러한 그룹에 군집되는 경향이 있기 때문입니다.
      1. 스토리보드의 개체를 마우스 왼쪽 단추로 한 번 클릭하면 해당 개체에 대한 자세한 시계열 정보를 표시하는 새 창이 열립니다. 이 창을 통해 실험 전반에 걸쳐 물체에 대해 수집된 모든 이미지를 검사할 수 있을 뿐만 아니라 물체의 움직임 역학 및 형태를 정량화할 수 있습니다. 동일한 인터페이스를 사용하여 사망 시간에 수동으로 주석을 추가합니다. 사망 시간 주석에 대한 인터페이스는 그림 6에 나와 있습니다.
      2. 사망 시간에 수동으로 주석을 달려면 사망 시간에 해당하는 지점의 하단 막대를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 스페이스 바와 키보드의 오른쪽 또는 왼쪽 화살표를 사용하여 시간 프레임을 이동하거나 원하는 시간 프레임에서 막대를 직접 클릭합니다.
         참고: 시각화는 x축 표시 시간이 있는 가로 막대 그래프와 같이 시간 경과에 따른 동물의 이동 상태를 나타냅니다. 분홍색/보라색 부분은 물체가 격렬하게 움직이는 기간을 나타내고, 노란색은 약한 움직임을 나타내고, 빨간색은 움직이지 않는 동물을 나타내고, 녹색은 죽음과 관련된 팽창 기간을 나타냅니다. 선충류는 특징적인 죽음 관련 형태학적 사건을 나타내는데, 일반적으로 사망 전에 발생하는 점진적인 신체 수축이 뒤따르고, 사망 중 또는 사망 직후에 급격한 신체 팽창이 뒤따른다(그림 6B). 먼지나 그림자와 같은 벌레가 아닌 물체는 몸체 크기에서 이러한 역학을 나타내지 않으며 대신 일반적으로 시간이 지남에 따라 크기와 강도의 선형적이고 점진적인 변화를 따릅니다. 이러한 다양한 신체 크기 역학은 신속한 분류 및 수동 배제를 위한 빠르고 간단한 방법을 제공합니다.
      3. 분석 접근 방식에 따라 사망 시간은 움직임 정지 시간(움직임 시각화에서 빨간색 막대의 시작) 또는 죽음 관련 확장 시간(움직임 시각화의 녹색 막대)으로 간주될 수 있습니다. 수축 및 확장 이벤트에 수동으로 주석을 달려면 원하는 시간 프레임에서 아래쪽 막대를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭합니다.
   3. 일부 기본적인 사망률 데이터 시각화는 웜 브라우저 클라이언트 내에서 기본적으로 제공됩니다. 생존 곡선 및 사망 시간 진단은 스토리보드에 있는 각 모집단에 대해 표시됩니다(그림 7). 왼쪽의 생존 곡선과 스토리보드의 오른쪽에 있는 각 개인의 VMC(Vigorous Movement Cessation) 시간과 사망 시간을 비교하는 산점도를 참조하십시오.
      참고: 특정 균주, 스캐너 또는 플레이트와 같은 조건에 대해 하단 막대의 하위 설정을 통해 다양한 실험 매개변수에 따라 이러한 결과를 그룹화할 수 있습니다. 개별 웜은 VMC 대 사망 시간 플롯에서 개별 지점을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 사망 시간을 기준으로 선택할 수 있습니다.
4. 디스크에 사망률 데이터 쓰기: LSM은 CSV 파일 형식으로 사망률 데이터를 생성합니다. 출력된 생존 곡선을 플로팅하고 R, SAS, STATA 또는 JMP와 같은 통계 소프트웨어에서 분석합니다.
   1. 이러한 파일을 생성하려면 웜 브라우저에서 실험을 선택하고 메뉴에서 Data Files(데이터 파일), Death Times(사망 시간)를 선택한 다음 Generate Death Times for Current Experiment(현재 실험에 대한 사망 시간 생성)를 클릭합니다. LSM은 실험의 생존 데이터가 포함된 출력 파일을 생성하며, 이 파일은 결과 디렉토리에 저장됩니다.
   2. 스토리보드에서 직접 주석을 수행한 경우 직접 주석을 처리하는 방법을 묻는 프롬프트가 웜 브라우저에 나타납니다. "즉시"를 클릭하면 출력된 사망 시간 파일에 직접 주석을 포함할 수 있습니다.
      참고: 사망률 데이터 파일은 imageserver.ini 파일에 지정된 결과 디렉토리에 기록됩니다. 다양한 파일이 작성되지만 가장 일반적으로 사용되는 버전은 스토리보드를 사용하여 만든 모든 수동 주석을 포함하는 "survival_simple/survival=machine_hand"입니다.
   3. 선택한 통계 소프트웨어에서 사망률 데이터를 분석합니다.

그림 5: 웜 브라우저의 동물 스토리보드 (A) 모든 정지 웜은 기계 주석이 달린 사망 시간의 시간순으로 표시됩니다. 스토리보드를 탐색하려면 (B) 오른쪽 하단 모서리에 있는 버튼을 누르고 (C) 주석을 자주 저장합니다. (D) 배경이 회색이 아닌 이미지는 두 개의 웜 사망 사건(초기에는 녹색으로, 나중에는 빨간색으로 사망)을 묘사하며, 이는 두 개의 웜이 서로 가까이에서 죽거나 지나가는 웜에 의해 죽은 웜이 이동하여 두 번 죽은 것으로 감지될 때 발생할 수 있습니다. (E) 이미지 하단 모서리에 있는 빨간색 태그는 감지된 사망 시간이 있는 웜을 식별합니다. (F) 녹색 태그는 물체가 사망 시간을 기록할 만큼 충분히 오래 움직이지 않은 곳을 나타냅니다. (G) 동일한 프레임에 있는 여러 웜은 Shift 키를 누르고 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 플래그를 지정할 수 있습니다. (H) 웜이 아닌 객체는 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 분석에서 제외됩니다. (I) 분해된 웜은 해당 이미지(직접 주석 창이 열림)를 클릭하고 Shift 키를 누른 상태에서 "동물 분해" 메시지가 나타날 때까지 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 분석에서 관측 중단됩니다. 0.5mm의 축척 막대와 레이블이 웜 브라우저 창의 스크린샷에 겹쳐져 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 6: Worm Browser에서 개체 및 사망 시간 주석 검사 웜 브라우저 스토리보드에서 개체를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하면 새 인터페이스가 열리고 사용자가 개체의 이동 역학을 검사할 수 있습니다. 오른쪽에는 물체의 움직임을 정량화하는 (A) 이동 점수가 표시됩니다. 이는 연속적인 관측치 사이의 픽셀 강도 변화로 추정됩니다. 또한 오른쪽에는 (B) 물체 크기의 변화를 정량화하는 총 물체 강도의 변화가 표시됩니다. 왼쪽의 위쪽 막대는 사망 시간에 대한 (C) 기계 추정치를 표시하고 아래쪽 막대는 (D) 인간 손으로 주석을 표시합니다. 막대의 아무 지점이나 클릭하고 스페이스 키를 누르면 사용자가 웜이 이미지화된 시간 프레임을 이동할 수 있습니다. 이 막대에서 분홍색은 격렬한 움직임에 소요된 시간을, 빨간색은 죽음에 소요된 시간을, 노란색은 그 사이의 모든 시간을 나타냅니다. 사망 시간 이후 팽창 및 수축에 소요된 시간은 녹색으로 표시됩니다. 레이블은 웜 브라우저 창의 스크린샷에 겹쳐집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 7: Worm Browser의 인구 요약 통계. 스캐너 장치 "obiwan"에 대한 인구 통계, 생존 플롯(왼쪽 패널) 및 VMC(Vigorous Movement Cessation) 시간 대 사망 시간(오른쪽 패널)의 산점도. 플롯은 (A) 하나의 조건에 대한 세부 정보이며, (B) 하나의 스캐너에서 얻은 하나의 스캐너는 먼저 (C) 균주에 의한 생존 그룹을 선택하여 달성됩니다. (D) 산점도의 정사각형 모양은 손으로 주석이 달린 이벤트를 나타내고, (E) 원형 모양은 기계로 주석이 달린 이벤트를 나타냅니다. (F) 초기에 발생하는 사망 사건 또는 (G) 격렬한 움직임 정지 시간이 사망 시간과 일치하는 사망 사건의 경우 수동 주석이 필요한 경우가 많습니다. 레이블은 웜 브라우저 창의 스크린샷에 겹쳐집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

수명 분석에서 실험 재현성은 까다로우며 충분한 통계적 분해능을 달성하기 위해 엄격하게 통제된 실험 조건과 대규모 모집단이 모두 필요합니다 ^4,36. LSM은 높은 시간 분해능으로 일정한 환경에서 대규모 동물 개체군을 조사하는 데 매우 적합합니다. LSM의 기능을 입증하고, 분석의 중요한 단계를 강조하고, 연구자가 노동 노력의 우선 순위를 정할 수 ?...

토론

여기에서는 최신 버전의 Lifespan Machine을 사용하여 실험을 수행하기 위한 상세하고 액세스 가능한 프로토콜을 제공합니다. 우리는 잘 분해된 생존 곡선을 달성하기 위한 중요한 단계는 사후 이미지 획득 중에 비웜 물체를 수동으로 배제하는 것임을 보여주었습니다. 수동 사망 시간 주석은 생존 곡선의 전체 모양에 작은 영향을 미치며, 수동 주석이 없어도 완전 자동화된 사망 시간 추정이 효율적임...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Naphtaleneacetic  acid (Auxin)	Sigma	N0640	Solubilize Auxin in 1M potassium hydroxide and add into molten agar
5-fluoro-2-deoxyuridine (FUDR)	Sigma	F0503	27.5 μg/mL of FUDR was used to eliminate progeny from populations on UV-inactivated bacteria
Glass cleaner	Kristal-M	QB-KRISTAL-M125ml
Hydrophobic anti-fog glass treatment	Rain-X Scheibenreiniger	C. 059140
Rubber matt	Local crafstman		Cut on a high-strength EPDM rubber sheet stock
Scanner glass	Local hardware supplier		9" x 11.5" inch glass sheet
Scanner plates	Life Sciences	351006	50 mm x 9 mm, polystyrene petri dish
USB Reference Thermometer	USB Brando	ULIFE055500	For calibrating temperature of scanners