등쪽 뿌리 신경절 통증의 압축이 있는 쥐 모델에 대한 Tuina의 진통 효과

요약

이 논문은 Tuina 요법을 사용하여 쥐의 등쪽 뿌리 신경절의 만성 압박을 치료하기 위한 조작과 통증 행동 및 조직 병리학적 결과를 기반으로 효과를 평가하는 방법을 제시합니다.

초록

신경병증성 통증은 인구의 6.9%-10%에 영향을 미치는 흔한 상태이며 요추 추간판 탈출증, 척추관 협착증 및 추간공 협착증과 같은 다양한 원인으로 인한 신경 손상으로 인해 발생합니다. 중국의 전통적인 도수치료인 투이나(Tuina)는 신경병증성 통증 치료를 위한 임상에서 진통 효과를 보였지만 근본적인 신경생물학적 메커니즘은 아직 불분명합니다. 동물 모델은 투이나의 기본 원리를 밝히는 데 필수적이다. 이 연구에서는 등근 신경절(DRG)을 압박한 쥐를 위한 표준화된 Tuina 프로토콜을 제안하며, 여기에는 추간공에 스테인리스 스틸 막대를 삽입하여 DRG 압박을 유도하고, 통제된 환경에서 위치, 강도 및 빈도의 특정 매개변수로 Tuina 조작을 수행하고, Tuina 치료의 행동 및 조직 병리학적 결과를 평가하는 것이 포함됩니다. 이 글은 또한 본 연구의 잠재적인 임상적 의미와 한계에 대해 논의하고 투이나에 대한 향후 연구의 방향을 제시한다.

서문

임상 환경에서 다양한 이유로 신경근 압박으로 인한 신경학적 병리학적 통증을 관찰하는 것이 일반적입니다. 이 신경병증성 통증의 가장 전형적인 형태는 요추 추간판 탈출증(LDH)으로, 종종 지속적이고 반복적이며 치료가 어렵습니다. 전 세계 인구의 약 9%가 LDH의 영향을 받고 있으며, 이는 상당한 사회적, 경제적 부담을 초래합니다¹. 이러한 유형의 신경병증성 통증의 발생률은 매년 증가하고 있으며, 인체 생산 및 생활 방식의 변화로 인해 젊은 환자로 증가하는 추세이다². 비스테로이드성 진통제를 사용해도 환자의 증상이 완전히 완화되지는 않습니다. 그 결과, LDH로 인한 통증을 치료하기 위한 투이나(Tuina)와 같은 대체 요법이 점점 더 주목을 받고 있습니다.

LDH에 대한 보존적 치료의 한 형태인 투이나 요법은 요통을 예방하고 치료하기 위해 전 세계의 다양한 임상 진료 지침에서 널리 권장되고^{있다 3,4}. 연구에 따르면 투이나는 LDH 환자의 혈청 IL-6 및 종양괴사인자-알파(TNF-α) 수치와 같은 염증 인자를 현저히 낮추는 동시에 환자의 통증과 요추 기능 장애를 개선할 수 있다⁵. 그러나 투이나 요법의 통증 완화 효과에 대한 구체적인 메커니즘은 아직 불분명하다.

동물 모델은 LDH⁶로 인한 신경병증성 통증을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 이를 통해 Tuina 요법의 효과를 평가하고 LDH의 병리학적 생리학적 샘플을 제공하기 위한 행동 측정을 할 수 있습니다. 예를 들어, 허벅지의 등근 신경절에서 채취한 샘플을 채취하여 등근 신경절 세포의 변화를 확인할 수 있습니다. 등근신경절(Dorsal Root Ganglion, CCD) 모델의 만성 압박은 LDH의 병리학적 생리학을 평가하는데 일반적으로 사용되는데, 이는 추간판 탈출증으로 인한 신경 압박의 임상적 사례에서 나타나는 병리학적 변화와 일치하는 등쪽 뿌리 신경절 세포의 형태에 손상을 주기 때문이다⁷.

많은 학자들이 지압 진통제에 대한 몇 가지 동물 실험을 수행했습니다 ^8,9,10. 그러나 동물 모델에서 지압 작업을 구현할 때 종종 인간 지압을 모방합니다. 지압의 치료 효과는 가해진 힘의 크기, 빈도 및 방향과 같은 요인에 의해 영향을 받는다^11,12,13. 실험에 힘, 빈도 및 작동 기간과 같은 통일된 지압 표준이 없는 경우 실험 결과에 약간의 편차가 발생할 수 있습니다. 이 기사에서는 CCD 쥐의 특성을 기반으로 한 일련의 지압 치료 계획을 소개하고 동물 모델에서 표준화된 지압 작업의 개발을 촉진합니다.

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프로토콜

이 연구는 푸단 대학의 신경 생물학 연구소의 통증 실험실에서 수행되었습니다. 이 실험은 모든 수술 절차 및 동물 취급에 대해 국제 통증 연구 협회(LASP)에서 제정한 실험 동물 보호 지침을 승인하고 엄격하게 준수했습니다. 본 연구에는 생후 40-50일 사이의 수컷 32마리로 구성된 청정 등급의 Sprague-Dawley(SD) 쥐가 평균 체중 220± 1.38g으로 사용되었습니다. 이 쥐들은 중국과학원 상하이 생명과학원 실험동물센터에서 채취했다. 동물들은 적절한 보살핌을 받았고 독립적인 환기, 조절된 온도(22 ± 1 °C) 및 습도(40%-50%)가 있는 전용 방에 수용되었습니다. 쥐들은 우리에서 적절한 음식과 물을 먹을 수 있었다. 실험동물실은 쥐의 생체 리듬의 규칙성을 유지하기 위해 12시간의 명암 주기를 따랐고, 지정된 인원이 정기적으로 패딩을 교체했다. X-ray는 Shanghai University of Traditional Chinese Medicine 부속 Yueyang Hospital of Integrated Chinese and Western Medicine의 방사선과에서 수행되었습니다.

1. 연구 참가자 및 그룹화

1. 32마리의 쥐를 naive(대조군), sham(가짜 수술), CCD(만성 등쪽 뿌리 신경절 압박) 및 CCD + Tuina(8마리/그룹)의 네 그룹에 할당합니다. 쥐는 동물 시설에서 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있었습니다.
   참고: 순진한 쥐는 개입이 없었고, 가짜 그룹은 CCD 그룹 쥐와 동일한 수술 절차를 거쳤지만 L4 및 L5 추간공에 "L"자형 스테인리스 스틸 막대를 남기지 않았습니다. CCD 그룹의 쥐는 완전한 만성 배근 신경절 압박 모델 수술을 받았습니다. CCD + Tuina 그룹의 쥐는 CCD 수술 후 4일째부터 tuina 요법을 받았습니다.

2. 동물모델 확립

1. 쥐를 마취하기 위해 이소플루오란을 투여합니다. 쥐가 의식을 잃으면(꼬리 튕기기 반사 또는 다리 굴곡 반사 없음) 면도기를 사용하여 수술 부위의 털을 면도합니다.
   참고: 진통제는 수술 15분 전에 적용되었으며 쥐는 트라마돌 20mg/kg을 피하 주사했습니다.
2. 폼 보드( 재료 표 참조)에 쥐를 고정하고 고무 밴드를 사용하여 팔다리와 앞니를 고정합니다. 알코올과 요오드를 번갈아 가며 멸균한 준비물로 최소 3주기 동안 준비된 부위를 닦습니다.
3. "L"자형 프로브를 삽입합니다( 재료 표 참조).
   1. 가위를 사용하여 피부, 표재성 근막, 심부 근막을 층별로 2-3cm 절개합니다. 먼저 다섯 번째 요추에 해당하는 전방 상장골 척추를 찾습니다. 그런 다음 세 번째와 네 번째 가시돌기를 순차적으로 찾습니다.
   2. 톱니가 있는 집게로 가시돌기를 고정하고 들어 올려 가위가 가시돌기의 오른쪽에 가까워지도록 하고 가시돌기의 오른쪽에 부착된 근육을 자릅니다.
   3. 그런 다음 척추판의 바깥쪽 표면에 붙어있는 근육을 오른쪽에 저항이 생길 때까지 뭉툭하게 해부합니다. 돌출부는 접합부 관절입니다. 마찬가지로 접합 관절의 근육과 근막을 무뚝뚝하게 절개합니다.
      참고: 쥐의 머리 방향을 가리키는 횡돌기는 접합부 관절의 아래쪽 바깥쪽 전면에서 먼저 터치됩니다. 횡돌기 아래에는 추간공이 있는데, 추간공은 신경근과 주변 연조직으로 채워져 있어 일반적으로 찾기가 쉽지 않습니다.
   4. 먼저 "L"자형 프로브를 사용하여 추간공의 위치를 확인한 다음 "L"자형 스테인리스 막대(직경 0.4mm, 길이 4mm로 만들어야 함)를 사용하여 추간공에 삽입합니다.
   5. 등뿌리 신경절이 성공적으로 압축되면 쥐는 꼬리 튕기기와 다리 굴곡 반사를 나타냅니다. 스테인리스 스틸 막대를 네 번째 및 다섯 번째 요추 추간공에 삽입합니다. 그런 다음 근육, 근막 및 피부를 층층이 봉합(3-0, 재료 표 참조)합니다.
4. 쥐가 깨어날 때까지 온도 조절 상자에 쥐를 넣으십시오. 잠에서 깬 후 쥐의 오른쪽 뒷다리 기능이 정상인지 관찰하십시오. 끌림이 있으면 수술로 인해 운동 신경이 손상되었음을 의미하므로 쥐를 버려야 합니다. 오른쪽 뒷다리의 기능이 정상이면 쥐를 사용하여 케이지에 넣어 먹이를 줄 수 있습니다.

3. 투이나 테라피

1. 편안한 환경 조성: Tuina 요법을 시작하기 전에 쥐가 적응할 수 있도록 30분 동안 구속 장치에 쥐를 적응시킵니다(그림 1). 이 장치는 쥐의 허벅지를 완전히 노출시키고 고정시켜 Tuina 기동을 용이하게 할 수 있습니다( 재료 표 참조).
   알림: 치료실의 온도는 22-26°C, 습도는 40%-50%로 유지되어야 합니다.
2. Tuina의 표준화: 치료사가 Tuina의 압력과 주파수를 모니터링하고 실시간 피드백 데이터를 제공할 수 있는 무선 손가락 슬리브를 착용하도록 합니다. 먼저 손가락 소매의 피드백 데이터로 Tuina를 연습하여 힘을 5N으로, 주파수를 2Hz로 조정합니다. 그런 다음 쥐에 대해 동일한 기동을 수행하여 절차 전반에 걸쳐 일관된 힘과 빈도를 유지합니다(그림 2).
   참고: 이전 작업을 기반으로 계산된 최적 가압력은 5N입니다(자세한 내용은 토론 섹션 참조).
3. 경혈 식별 : 오른쪽 뒷다리의 비복근을 비복근의 두 머리가 만나는 지점, 대략 BL57¹⁴의 위치에서 쥐의 투이나 영역으로 선택합니다.
4. 투이나 수행: 치료사가 쥐의 허벅지 뒤쪽을 향하고 오른쪽 상지와 함께 쥐의 오른쪽 뒷다리를 잡도록 합니다. 엄지손가락을 BL57 경혈에 수직으로 놓고 팔뚝과 손가락이 힘을 가하여 5N 압력을 가하면서 리드미컬한 소범위 회전 운동을 수행하도록 합니다(그림 3).
5. 치료하는 동안 조작 피드백의 힘과 주파수가 사전 설정 값과 일치하는지 확인하십시오. 수술 후 4일째부터 중재를 시작하여 Tuina는 하루에 한 번 15분 동안 18일 동안 지속적으로 시행합니다.

4. 통증에 대한 행동 검사

참고: 행동 테스트는 모델링 전, 모델링 후, 개입 1일차, 개입 3일차, 개입 7일차, 개입 14일차, 개입 17일차 및 개입 21일에 수행되었습니다.

1. 아래 단계에 따라 기계적 자극 반응 임계값(Paw Withdrawal Threshold, PWT)을 수행합니다(그림 4).
   1. von Frey 방법을 사용하여 쥐의 발에서 기계적 자극의 반응 역치를 테스트합니다. 쥐를 20cm × 10cm × 20cm 크기의 투명한 강화 유리 구획에 넣고 40cm 높이의 10mm × 10mm 구멍이 있는 금속 와이어 격자 스탠드에 놓습니다. 실내 온도를 23 ± 2 °C로 유지하고 주변 환경을 조용하게 유지하십시오.
   2. 전자 Von Frey 섬유로 기계적 인출 임계값을 측정합니다( 재료 표 참조). 다리를 올리거나 피하는 등 눈에 띄게 움직일 때까지 쥐의 발 중심을 자극합니다. 기계는 최대 압력 값(N)을 자동으로 기록합니다.
   3. 같은 쥐를 다시 자극하기 전에 15초 이상 기다리십시오. 쥐의 발에서 촉각 감작을 방지하기 위해 각 자극을 5초 미만으로 유지하십시오. 세 번의 연속 측정값이 10N 미만으로 차이가 날 때까지 테스트를 5회 반복합니다.
2. 열 자극에 대한 반응으로 PWL(Paw Withdrawal Latency)을 수행합니다(그림 5).
   1. Hargreaves 방법^15,16을 사용하여 PWL을 평가합니다. 통풍구가 있는 투명한 유리 뚜껑이 있는 20cm x 10cm x 20cm 크기의 투명 강화 유리로 만든 작은 방에 쥐를 넣습니다. 유리 뚜껑의 중앙 영역이 안정적인 온도에 도달할 때까지 가열판을 사용하여 45°C로 가열합니다.
   2. 행동 테스트 단계에서 실험 결과에 대한 환경적 요인의 영향을 최소화하기 위해 매일 최소 2시간 동안 쥐를 행동 실험실에 적응시킵니다.
   3. 공식 테스트 전에 쥐를 행동 실험실에 30분 동안 두어 환경에 적응하고 간섭을 줄일 수 있도록 합니다.
   4. 가열판을 45°C로 가열하고 쥐의 뒷다리를 가열판에 놓습니다.
   5. 발 철수 잠복기(PWL)는 가열 시작부터 열 자극에 대한 반응으로 발 철수 반사가 나타날 때까지의 시간으로 정의되었습니다. 각 테스트에서 동일한 뒷다리를 연속으로 세 번 테스트하고 평균값을 테스트하여 해당 뒷다리의 응답 대기 시간을 구합니다. 테스트 후 쥐를 우리로 돌려보내 먹이를 줍니다.

5. 관류

1. 준비: 0.9% 식염수와 4% 파라포름알데히드 용액을 미리 준비합니다. 식염수를 37°C의 일정한 온도로 설정된 오븐에 넣고 파라포름알데히드 용액을 나중에 사용할 수 있도록 4°C의 냉장고에 보관합니다.
2. 마취를 수행하고 접근을 설정합니다.
   1. 쥐의 복강에 25% 우레탄(0.6mL/100g, 재료 표 참조)을 주입하여 깊은 마취를 유도하는 것으로 시작합니다. 발가락, 각막 또는 회전 반사가 관찰되지 않을 때까지 기다리십시오. 폼 보드에 쥐를 고정하십시오.
   2. 가슴뼈를 가위로 잘라 피부와 근막을 층층이 벌립니다. 횡격막을 자르고 양쪽 갈비뼈를 잘라 심장을 완전히 노출시킵니다. 심낭을 조심스럽게 분리합니다. 폐와 심장을 분리합니다.
   3. 집게를 사용하여 심장을 자신 쪽으로 당겨 대동맥을 당기고 노출시킵니다. 바늘, 좌심실, 대동맥을 직선으로 같은 수평면에 맞춥니다. 그런 다음 대동맥 내부에 바늘이 보일 때까지 좌심실의 바늘을 대동맥에 삽입합니다.
   4. 집게를 사용하여 대동맥과 대동맥 내부의 바늘을 고정한 다음 가위로 왼쪽 심방을 자릅니다. 이때 좌심방에서 많은 양의 혈액이 분출됩니다. 식염수 밸브를 열고 식염수 주입을 관류된 37°C 식염수에 연결하여 총 약 150-200mL를 만듭니다.
3. 식염수 관류가 완료된 후 4% 파라포름알데히드 용액으로 전환하고 4% 파라포름알데히드 용액으로 4°C에서 총 약 400mL를 관류합니다. 파라포름알데히드 관류를 시작할 때 한 쌍의 집게로 쥐의 앞니를 잡고 앞으로 당기면서 한 손으로 꼬리를 잡고 뒤로 당기면 척추를 완전히 확장하고 추간공을 늘려 DRG 샘플링을 용이하게 하는 데 유리합니다.
4. 관류하는 동안 쥐의 간, 장간막 및 대망막은 간이 뻣뻣해질 때까지 점차 창백해집니다. 그런 다음 유속을 늦추고 모든 파라포름알데히드가 관류될 때까지 초당 약 2방울로 조정합니다.

6. 등쪽 뿌리 신경절 수집

알림: 관류 후 쥐 척추의 요추 부분을 빠르게 잘라냅니다. 이 포지셔닝 방법을 사용하여 양쪽 장골능선의 가장 높은 지점을 L5 요추 가시돌기에 연결하여 L5 및 L4 추간공을 찾고 추간공에서 등근 신경절을 제거합니다. 구체적인 수집 방법은 다음과 같습니다.

1. 척추관(흉추관) 입구에서 가위를 척추관에 삽입하고 모든 판판이 완전히 제거될 때까지 양쪽의 라미나를 잘라내어 척추관 전체가 노출됩니다.
   알림: 박판을 절단할 때 척수와 척추관 외부의 신경근이 손상되지 않도록 주의하십시오.
2. 척수와 후방 종인대를 조심스럽게 제거합니다. 추간공의 안쪽 구멍에 부착된 경막을 분리합니다.
3. 안과 집게를 사용하여 진주 모양이며 약간 노란색을 띤 등뿌리 신경절을 고정하고 빼냅니다.
   알림: 신경 조직의 취약성과 인성이 좋지 않기 때문에 등근 신경절을 뽑을 때 강도와 당기는 방향을 파악하고 무리한 힘을 사용하지 않아야 합니다.
4. 등근 신경절을 뽑을 때는 경막과 지주막을 포함한 주변의 연조직을 미리 청소하여 등근 신경절이 부드럽게 당겨지도록 합니다.
5. 등뿌리 신경절을 흡수성 종이에 놓고 칼날로 축삭을 잘라내고 등뿌리 신경절 표면의 혈관을 청소합니다.
6. 트리밍 후, 등뿌리 신경절의 무게를 측정하고 4%의 농도와 4°C의 온도로 4% 파라포름알데히드 용액에 충분한 시간, 보통 약 2-4시간 동안 담근 다음 등뿌리 신경절을 단계적 탈수를 위해 미리 준비된 10%, 20% 및 30% PB 자당 용액(4°C)으로 옮깁니다.

7. 냉동 절제

1. 등근 신경절을 0.01M PBS 용액에 넣는 것으로 시작합니다. 10분 동안 흔든 다음 자당 용액을 씻어냅니다. 등뿌리 신경절의 양쪽 부분의 축삭 섬유를 조심스럽게 다듬습니다. 냉동 절편 기계의 냉동 헤드를 청소하고 최적 절단 온도(OCT) 화합물을 추가합니다( 재료 표 참조).
2. 액체 질소가 들어 있는 금속 껍질 표면에 냉동 헤드를 놓고 조직이 얼 때까지 기다렸다가 제거하고 평평하게 다듬습니다. 그런 다음 냉동 헤드를 슬라이서 바닥에 놓습니다. 등뿌리 신경절 조각의 두께는 15mm여야 합니다. 얇게 썬 얇은 부분을 나무 상자에 순서대로 정리하고 빛을 피해 -20°C 냉장고에 보관합니다.

8. Hematoxylin와 Eosin 염색

1. 절편을 크실렌에 2분 동안 넣고 각각 100분, 95%, 80%, 70%를 포함한 일련의 알코올로 2분 동안 탈수합니다. 그런 다음 절편을 증류수에 2분, 헤마톡실린에 1분, 수돗물 헹굼 5분을 수행하고 1% 식염수 알코올 용액에서 30초 동안 분화한 다음 포화 탄산 리튬에서 30초를 수행합니다.
2. 다음으로, 증류수와 수돗물에 각각 2 분, 에오신 용액 (0.5 %)에 5 분, 증류수에 1 분 빠른 헹굼, 95 % 및 100 % 알코올에 각각 2 분씩 2 회, 중탄산 나트륨이 첨가 된 100 % 크실렌에 30 초, 크실렌에 각각 3 분씩 3 회, 그리고 마지막으로 중성 발삼으로 밀봉하십시오( 재료 표 참조).

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결과

Tuina 요법은 CCD 모델링으로 인한 쥐의 기계적 및 열 자극 역치를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다.
투이나 요법 17일 후, 투이나 요법을 받은 CCD 쥐와 치료받지 않은 CCD 그룹 간의 PWT 역치에서 유의한 차이가 관찰되었다(P =0.021, <0.05)(그림 6 및 표 1).

투이나요법을 투여받은 CCD군의 랫트는 치료 시작부터 통증역치가 개선?...

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토론

우리 연구 그룹은 초기 단계에서 Tuina 조작의 매개 변수에 대한 관련 연구를 수행했습니다. 먼저 Tuina 조작을 위한 힘 강도를 설정하는 것이 중요합니다. 임상 Tuina에서 의사는 자신의 경험과 환자의 주관적인 감정에 따라 힘의 강도를 조정하여 의사 소통을 통해 최상의 Tuina 효과를 얻습니다. 그러나 이것은 동물 실험에서 실현 가능하지 않습니다. 동물 실험에서 "반응 역치"는 Tuina 조작의 강도를 ?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
"L" stainless steel rod (4 mm long and 0.4 mm in diameter)	hand-made	/	For CCD models making
ALMEMO admeasuring apparatus	ahlborn	2450-1	Mechanical Withdrawal Threshold test
Constant temperature slicer CM-1900	Leica	1491950C1US	For specimen production
Disinfectant (iodine) 100 mL/bottle	LIRCON/Shandong Lilkang	/	For disinfection
Disposable sterile syringe 5 mL	Shanghai Misha Wa Medical Industry	/	For injection
Electron microscope CX-31	Olympus, Japan	BJ002318	For specimen observation
Finger pressure recordings	Suzhou Changxian Optoelectronic Technology	CX1003w	For Tuina manipulation
Foam board (35 cm x 20 cm)	hand-made	/	It is our homemade apparatus for fixing rats
MERSILK W2512	Johnson & Johnson	/	For tissue suture
Neutral balsam	Sinopharm Chemical Reagent	10004160	For specimen production
paraformaldehyde	China National Chemical Reagent	/	For specimen production
Pentobarbital sodium	Sigma-Aldrich	P3761	For anesthesia of rat
Plantar Test Apparatus (Hargreaves Method) for Mice and Rats	IITC Life Science	/	Paw Withdrawal Latency
Precision electronic scale for experiment JY3002	Shanghai Precision Scientific Instrument	/	Weighing of rat
Rat hair clipper	Philips	HP6341/00	Shaving of rat fur
Restrainer for rats	Tongji University (self-made)	/	It is a homemade apparatus made by Tongji University, which can effectively immobilize the rats and fully expose their hind limbs.
Tissue-Tek O.C.T. Compound	SAKURA	4583	For specimen production
Uratan	China National Chemical Reagent	/	For anesthesia of rat
X-ray detector XR-600	Dongguan Kaso Electronic Technology	/	Examination of CCD models
xylene	Shanghai Sinopharm Group	100092	For specimen production