설치류 뼈의 전체 뼈 굽힘 시험과 관련된 연구의 설계, 실행 및 해석에 대한 실용적인 고려 사항

요약

설치류 뼈의 기계적 검사는 뼈의 골절 민감도에 관한 정보를 추출하는 데 유용한 방법입니다. 적절한 실제적 이해가 부족하면 결과가 과도하게 해석되거나 타당성이 부족할 수 있습니다. 이 프로토콜은 유효하고 기능적인 데이터를 제공하기 위해 기계적 테스트가 정확하게 수행되도록 하는 가이드 역할을 합니다.

초록

골절로 이어지는 골격계 취약성은 매년 150만 건의 골절과 180억 달러의 직접 치료 비용을 초래하는 미국의 공중 보건 위기입니다. 뼈 질환의 기저와 치료에 대한 반응을 이해하는 능력은 바람직할 뿐만 아니라 매우 중요합니다. 뼈의 기계적 검사는 골절에 대한 뼈의 민감도를 이해하고 정량화하는 데 유용한 기술입니다. 이 방법은 수행하기가 간단해 보이지만 사용자가 관리 가정과 주요 단계를 무시하는 경우 부적절하고 부정확한 결론에 도달할 수 있습니다. 이는 방법의 오용과 결과의 잘못된 해석으로 연구가 계속 발표됨에 따라 학문 전반에 걸쳐 관찰되었습니다. 이 프로토콜은 시료 크기 고려부터 조직 채취 및 저장, 데이터 분석 및 해석에 이르기까지 이러한 기술의 적용과 함께 기계적 테스트와 관련된 원칙에 대한 입문서 역할을 합니다. 이를 통해 뼈의 골절 민감성에 대한 귀중한 정보를 얻을 수 있어 학술 연구와 임상 솔루션 모두에 대한 이해를 높일 수 있습니다.

서문

뼈의 기계적 검사는 골절에 대한 뼈의 민감도와 관련된 기능적 정보를 추출하는 주요 방법입니다. 전임상 연구에서는 여러 가지 검사 방식을 사용할 수 있지만 가장 일반적인 것은 긴 뼈를 구부리는 것입니다. 이 검사는 수행하기 쉬우며 사람에서 쥐에 이르기까지 다양한 크기의 뼈에 사용할 수 있습니다. 마우스는 전임상 연구에서 가장 일반적으로 연구되는 동물 중 하나이기 때문에 이 프로토콜은 마우스의 대퇴골과 경골에 수행되는 굽힘 테스트에 중점을 둘 것입니다.

굽힘 테스트를 수행하기 전에 뼈를 적절하게 채취하고 보관해야 합니다. 가장 일반적인 보관 방법은 전통적으로 식염수에 적신 거즈에 뼈를 얼리거나, 식염수만 넣거나, 에탄올에서 뼈를 탈수하는 것입니다 ¹. 에탄올에 저장된 골은 냉동 보관된 골에 비해 강성과 탄성 계수가 증가하고 변형 매개변수가 감소하는 것으로 나타났습니다¹. 검사 전에 뼈에 수분을 보충해도 이러한 특성이 정상 수준 ¹로 회복되지 않습니다. 식염수에 담그면 식염수가 팽창할 때 압력이 가해지기 때문에 뼈가 손상될 수 있습니다. 또한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영(μCT) 스캔을 위해 뼈를 제거하기 위해 용액을 완전히 해동해야 합니다. 결과적으로, 갓 채취한 뼈를 식염수에 적신 거즈에 냉동하는 것이 표준 보관 방법이 되었으며 이 프로토콜 전체에서 권장됩니다.

뼈의 크기와 모양이 뼈의 부피 강도에 영향을 미치고 많은 질병 모델이 뼈의 크기와 형태를 크게 변화시키기 때문에 공학적 원리를 사용하여 크기의 영향을 정규화하여 조직의 거동을 추정하는 특성을 생성한다². 이 접근 방식에는 고장 위치의 단면 형상이 필요하며, 이는 테스트 전에 뼈를 스캔하기 위해 μCT를 사용하여 가장 일반적으로 획득됩니다. μCT는 가용성과 높은 이미지 해상도로 인해 널리 사용됩니다. 더욱이, 연조직의 기여는 포함되지 않으며, 스캐닝은 뼈에 대한 화학적 고정 또는 기타 변형을 필요로 하지 않는다 ^3,4. 모든 형태의 CT에서 X선 소스는 물체에 초점을 맞추고 물체의 반대쪽에 있는 검출기는 결과 X선 에너지를 측정합니다. 이것은 이미지 ^3,5로 변환될 수 있는 샘플의 X선 그림자를 생성합니다. 스캔되는 물체가 회전하여(또는 X선 소스와 검출기가 샘플 주위를 회전하여) 물체(⁵)를 나타내는 3차원 데이터 세트로 재구성될 수 있는 이미지를 생성합니다.

스캔 해상도 또는 두 물체가 얼마나 가까운지, 그리고 여전히 개별적으로 분해될 수 있는지는 공칭 복셀 크기 또는 결과 이미지의 픽셀 크기를 변경하여 제어됩니다. 일반적으로 객체^{는 단일 복}셀의 두 배 이상의 크기여야 식별될 수 있지만3 비율이 높을수록 정밀도가 향상됩니다. 또한, 더 큰 복셀은 부분적인 부피 효과를 더 잘 나타낸다: 단일 복셀이 다양한 밀도의 조직을 포함할 때, 단일 조직의 특정 밀도가 아닌 이러한 밀도의 평균이 할당되며, 이는 조직 면적과 미네랄 밀도의 과대 또는 과소 평가로 이어질 수 있다³. 이러한 문제는 더 작은 복셀 크기를 선택하여 완화할 수 있지만, 더 높은 해상도를 사용한다고 해서 부분적인 볼륨 효과가 제거되는 것은 아니며 스캔 시간이 더 길어질 수 있습니다³. 생체 외 뼈를 스캔할 때 일반적으로 쥐 뼈의 섬유주 구조를 정확하게 평가하기 위해 6-10μm의 복셀 크기가 권장됩니다. 피질 뼈에는 10-17μm의 더 큰 복셀 크기를 사용할 수 있지만 가장 작은 합리적인 복셀 크기를 사용해야 합니다. 이 프로토콜은 10μm 복셀 크기를 사용하며, 이는 주요 섬유주 특성을 구별하고 긴 스캔 시간 없이 부분 부피 효과를 최소화할 수 있을 만큼 충분히 작습니다.

뼈 조직의 높은 미네랄 밀도와 두께는 투과된 X선 에너지 스펙트럼을 크게 감쇠시키고 변화시키기 때문에 X선 에너지 및 에너지 필터 설정도 신중하게 선택해야 합니다. 일반적으로 방출된 X-선 스펙트럼은 물체(⁶)를 빠져나가는 스펙트럼과 동일하기 때문에, 뼈와 같은 밀도가 높은 물체에 저에너지 X-선을 사용하면 빔 경화(beam hardening⁾⁷로 알려진 인공물이 발생할 수 있다고 가정된다. 이러한 아티팩트의 발생률을 줄이기 위해 뼈 샘플을 스캔할 때 50-70kVp의 더 높은 전압이 권장됩니다⁵. 또한 알루미늄 또는 구리 에너지 필터를 삽입하면 보다 집중된 에너지 빔이 생성되어 아티팩트 ^4,7을 더욱 최소화할 수 있습니다. 이 프로토콜 전체에서 0.5mm 알루미늄 필터가 사용됩니다.

마지막으로, 스캔 회전 단계 및 회전 길이(예를 들어, 180°-360°)는 함께 캡처된 이미지의 수를 제어하며, 이는 최종 스캔(⁴)에서 노이즈의 양을 결정한다. 각 단계에서 여러 프레임의 평균을 내면 노이즈를 줄일 수 있지만 스캔 시간이 늘어날 수 있습니다⁴. 이 프로토콜은 0.7도의 회전 단계와 2의 프레임 평균을 사용합니다.

스캐닝에 대한 마지막 참고 사항: 하이드록시아파타이트 보정 팬텀은 감쇠 계수를 g^{/cm 35} 단위의 미네랄 밀도로 변환할 수 있도록 실험용 뼈와 동일한 스캔 설정을 사용하여 스캔해야 합니다. 이 프로토콜은 0.25 g/cm3 및 0.75 g/^cm3 의 하이드록시아파타이트의 팬텀을 사용하지만 다른 팬텀을 사용할 수 있습니다. 일부 스캐닝 시스템은 일상적인 시스템 보정의 일부로 내부 팬텀을 사용합니다.

스캔이 완료되면 각도 투영은 일반적으로 제조업체와 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여 물체의 단면 이미지로 재구성됩니다. 어떤 시스템을 사용하든 재구성 시 전체 골격을 캡처하고 골격과 비본을 인식할 수 있도록 임계값을 적절하게 설정하는 것이 중요합니다. 재구성 후에는 모든 스캔을 3차원으로 회전하여 뼈가 가로축과 일관되고 적절하게 정렬되도록 하는 것이 중요하며, 다시 제조업체의 소프트웨어를 사용해야 합니다.

회전 후, 기계적 정규화를 위한 피질 특성, 섬유주 특성 또는 파괴 형상이 필요한지 여부에 따라 분석을 위한 관심 영역(ROI)을 선택할 수 있습니다. 후자의 경우 골절 부위에서 뼈의 한쪽 끝까지의 거리를 측정하고 복셀 크기를 사용하여 스캔 파일에서 해당 슬라이스 위치를 결정하여 테스트 후 ROI를 선택해야 합니다. 선택한 영역의 길이는 100μm 이상이어야 하며, 파괴점은 ROI의 대략적인 중심에 있어야 적절한 추정치를 얻을 수 있습니다⁴.

ROI를 선택한 상태에서 기계적 정규화(굽힘 응력 및 변형률 계산)를 위해서는 중립 굽힘 축에서 파손이 시작된 표면까지의 최대 거리(시험 설정에 의해 결정된 장력이 가해진 표면으로 가정)와 중립축 주위의 면적 관성 모멘트(테스트 설정에 따라 다름)의 두 가지 속성이 필요합니다. 이 프로토콜은 사용자 지정 코드를 사용하여 이러한 값을 결정하는 것이 좋습니다. 코드에 액세스하려면 교신 저자에게 직접 문의하거나 https://bbml.et.iupui.edu/ 의 랩 웹 사이트를 방문하여 자세한 내용을 확인하십시오.

μCT 스캔이 완료되면 기계적 테스트를 시작할 수 있습니다. 굽힘 시험은 4점 또는 3점 구성으로 수행할 수 있습니다. 4점 굽힘 시험은 하중 지점 사이의 뼈에서 전단 응력을 제거하여 이 영역에서 순수한 굽힘이 발생할 수 있도록 하기 때문에 선호됩니다³. 그러면 뼈는 장력으로 인해 골절되어 뼈의 진정한 굽힘 특성을 더 잘 나타내는 실패를 만듭니다³. 그러나 뼈는 두 로딩 지점에서 동일한 로드를 전달하는 방식으로 로드되어야 합니다(이는 피봇팅 로딩 헤드로 촉진될 수 있음). 3점 굽힘 시험에서 하중점이 뼈와 만나는 전단 응력에 큰 변화가 있으며, 이로 인해 이 지점에서 인장³이 아닌 전단으로 인해 뼈가 파손됩니다. ASTM 표준은 굽힘을 받는 재료의 길이 대 너비 비율이 16:1이어야 하며, 이는 전단 ^8,9의 영향을 최소화하기 위해 지지 스팬의 길이가 뼈 너비보다 16배 더 커야 함을 의미합니다. 이것은 작은 설치류 뼈를 테스트할 때 달성이 불가능한 경우가 많기 때문에 로딩 스팬은 가능한 한 크게 만들되 단면 모양의 변화는 최대한 작게 만듭니다. 또한 4점 굽힘을 수행할 때 하부 스팬과 상부 스팬의 길이 사이의 비율은 ~3:1⁸이어야 하며, 이는 일반적으로 경골에서 달성할 수 있지만 짧은 대퇴골에서는 어렵습니다. 또한 대퇴골의 피질 벽이 얇기 때문에 시험 중에 뼈 단면의 모양이 변하는 고리형 변형에 취약합니다(3점 굽힘에 비해 동일한 굽힘 모멘트를 유도하려면 더 큰 힘이 필요하기 때문에 4점 시험에서 강조될 수 있음). 따라서 이 프로토콜 전체에서 마우스 대퇴골에는 3점 굽힘이 사용되고 경골에는 4점 굽힘이 사용됩니다.

마지막으로, 통계 분석을 위해 연구를 적절하게 강화하는 것이 중요합니다. 기계적 테스트에 대한 일반적인 권장 사항은 일부 기계적 특성, 특히 항복 후 매개변수가 매우 가변적일 수 있으므로 차이를 감지할 수 있도록 실험 그룹당 10-12개의 뼈 표본 크기를 갖는 것입니다. 어떤 경우에는 연구 중에 발생할 수 있는 감소를 감안할 때 더 높은 동물 표본 크기로 시작하는 것을 의미할 수 있습니다. 연구를 시도하기 전에 기존 데이터를 사용한 표본 크기 분석을 완료해야 합니다.

많은 한계와 가정이 있지만, 굽힘 시험은 특히 그룹 간의 상대적 차이가 중요한 경우 매우 정확한 결과를 제공할 수 있습니다. 이러한 특성은 섬유주 구조 및 피질 형태 분석과 함께 질병 상태 및 치료 요법에 대한 더 나은 통찰력을 제공할 수 있습니다. 우리가 통제할 수 있는 실험의 측면(예: 수집, 저장, 스캔 및 테스트)에 주의를 기울이면 정확한 결과가 생성되었다는 확신을 가질 수 있습니다.

프로토콜

동물과 관련된 이 프로토콜 전체에 설명된 모든 절차는 절차 전에 Indiana University School of Science Institutional Animal and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 절차에 설명된 동물은_CO2흡입 후 안락사의 2차 수단으로 자궁경부 탈구를 통해 안락사되었습니다.

1. 뼈의 채취, 보관 및 해동

1. 수확 및 저장
   1. 마우스의 복부 쪽을 위로 향하게 놓습니다. 메스(또는 면도날이나 가위)를 사용하여 한쪽 대퇴골과 골반의 대략적인 접합부를 절개합니다.
   2. 고관절이 위치할 때까지 등쪽 초기 절개를 계속합니다. 골반에 붙어있는 작은 흰색 구체로 보이는 대퇴골두를 찾으십시오.
   3. 대퇴골두가 소켓에서 튀어나올 때까지 메스 가장자리로 대퇴골두의 근위 가장자리에 압력을 가합니다. 나머지 사체에서 뒷다리를 분리하기 위해 추가 조직을 절제합니다.
   4. 뒷다리를 분리한 상태에서 무릎 관절의 굴곡을 유도하여 경골과 대퇴골을 분리합니다. 무릎 앞쪽 표면에서 메스를 내측 방향으로 움직여 뼈 사이의 인대를 포함하여 인접한 조직을 절단합니다.
   5. 이렇게 해도 뼈가 분리되지 않으면 무릎 관절을 늘려 뒤쪽 표면에 접근할 수 있도록 합니다. 뼈를 자르거나 관절 연골을 긁지 않도록 주의하십시오.
   6. 대퇴골과 경골이 분리되면 관절을 구부리고 관절의 뒤쪽 표면에서 내측 톱질 동작을 사용하여 경골에서 뒷발을 제거합니다. 필요한 경우 관절을 확장하여 전방 표면을 노출시킵니다. 뼈가 잘리지 않도록 주의하십시오.
   7. 분리가 완료되면 부착된 모든 연조직의 뼈를 청소합니다. 경골에 대해 4점 굽힘 테스트를 수행하는 경우 비골도 제거합니다. 비골은 근위 끝에서 인대로 연결되어 있지만 뼈의 말단 근처의 경골에 융합되어 있습니다. 연결 지점 근처에서 날카로운 가위를 사용하여 비골을 분리합니다.
   8. 분리된 뼈와 세척한 뼈를 식염수에 적신 거즈로 따로 싸서 -20°C에서 보관합니다. 수확 직후에 이 작업을 수행하십시오.
   9. 시체의 다른 면에 대해 1.1.1-1.8단계를 반복합니다.
      참고: 1.1.4-1.1.6 단계에서 뼈를 분리하려고 할 때 저항이 있는 경우 뼈를 분리하는 것보다 단계를 반복하는 것이 가장 좋습니다. 무리한 움직임은 뼈의 손상이나 골절로 이어질 수 있습니다.
2. 녹고
   알림: 과도한 동결-해동 주기는 뼈의 기계적 특성에 해로운 영향을 미칠 수 있으므로 뼈가 겪는 동결-해동 주기의 횟수를 최소화해야 합니다. μCT 스캔을 위한 부분 해동은 뼈를 실온에 5-10분 동안 두면 가능합니다. 아래 설명된 대로 굽힘 테스트를 수행할 때만 뼈를 완전히 해동하십시오.
   1. 하룻밤 해동 선호
      1. 뼈를 -20°C 보관에서 냉장실이나 냉장고의 1-4°C로 옮깁니다. 테스트하기 전에 뼈가 완전히 해동될 때까지 8-12시간 동안 그대로 있는지 확인하십시오.
   2. 급속 해동
      1. 수조 온도를 약 37°C로 설정합니다. 이 온도가 되면 뼈를 욕조에 넣으십시오.
      2. 뼈를 약 1시간 동안 욕조에 그대로 두십시오.

2. μCT 스캔

1. 수분을 유지하기 위해 스캔하기 전에 파라필름으로 뼈를 감쌉니다. 스캔을 기다리는 동안 다른 모든 뼈를 얼음 위에 두십시오.
2. 파라필름으로 감싼 후 뼈를 홀더에 넣어 스캐너와 인터페이스합니다. 스캔한 모든 골격이 동일한 방향으로 정렬되었는지 확인하며, 일관된 정렬은 나중에 분석에서 회전을 단순화합니다.
3. 스캔 응용 프로그램에 따라 스캔 설정을 조정합니다. 마우스 뼈에 권장되는 일반 스캔 설정은 다음과 같습니다: 해상도/복셀 크기: 10 μm; 픽셀 크기 : 중간, 2000 x 1048; 필터: 0.5mm 알루미늄; 회전 단계: 0.7; 프레임 평균: 2.
   참고: 이러한 설정은 스캔에 사용되는 시스템에 따라 다를 수 있으며 필요에 따라 제조업체 및 사용 설명서를 참조해야 합니다.
4. X선 소스가 켜지면 플랫 필드 보정을 수행하여 아티팩트를 최소화합니다. 이렇게하려면 먼저 챔버가 비어 있는지 확인하고 평평한 필드를 끕니다.
5. 필드의 평균 강도를 측정하고 60%로 조정합니다. 60%가 되면 플랫 필드를 업데이트하고 다시 켭니다.
6. 평균 강도가 지금(86-88%)인지 확인합니다.
   참고: 이 프로세스는 사용하는 μCT 시스템에 따라 다를 수 있습니다. 프로세스를 시도하기 전에 사용 설명서를 참조하십시오.
7. 플랫 필드 보정이 성공적으로 수행되면 홀더를 챔버에 놓습니다. 샘플이 챔버에 받침대를 놓기 전에 중앙에 있고 수평인지 확인하십시오.
8. 받침대가 고정되면 챔버를 닫고 전체 뼈가 스캔에 캡처되는지 확인하고(스카우트 보기가 필요할 수 있음) 스캔을 시작합니다.
9. 스캔 후 -20°C의 식염수에 적신 거즈에 뼈를 다시 보관합니다.

3. μCT 재구성

1. 재구성 시 전체 뼈를 캡처할 ROI를 선택합니다. 이렇게 하려면 뼈의 가장 큰 단면을 보고 이 단면을 기준으로 ROI의 크기를 조정합니다.
2. 뼈가 아닌 뼈와 비교하여 뼈를 적절하게 인식할 수 있도록 소프트웨어의 임계값을 설정합니다. 이렇게 하려면 하한 제약 조건이 0으로 설정되고 상한 제약 조건이 피크 히스토그램 데이터의 끝에 설정되는 히스토그램을 사용합니다.
3. 링 아티팩트 감소 및 빔 강화를 포함한 추가 설정을 각각 5% 및 20%로 조정합니다. 정렬 불량 보정이 -7에서 7 사이인지 확인합니다. 이 값은 소프트웨어에 따라 다를 수 있습니다. 재구성을 시작하기 전에 사용 설명서와 제조업체 기반 지침으로 확인되었는지 확인하십시오.
   참고: 아티팩트는 빔 경화, 링 아티팩트 및 정렬 불량 보정에 대한 보정을 사용하여 재구성하는 동안 최소화할 수 있습니다. 정렬 불량 보정은 스캔 품질의 지표 역할을 할 수 있으며 제조업체에서 지정한 범위를 벗어나면 스캔을 반복해야 합니다. 그러나 재구성 설정은 소프트웨어에 따라 다르며 사용 설명서를 참조해야 합니다.

4. μCT 회전

참고: 재구성한 후에는 스캔을 회전하여 모든 골격에 걸쳐 일관된 방향을 설정하고 결과 골격의 가로 단면이 가능한 한 오프셋 각도를 최소화하면서 세로 축에 수직으로 취하도록 해야 합니다. 이 작업은 사용자가 선택한 소프트웨어로 수행해야 합니다.

1. 대퇴골 회전
   1. 대퇴골을 회전하여 모든 뼈의 세로 방향이 같도록 합니다. 예를 들어, 모든 뼈의 방향을 뼈의 근위 끝이 스캔 상단에 오도록 합니다.
   2. 모든 골격의 횡단면 방향이 같도록 골격을 회전합니다. 예를 들어, 앞쪽이 항상 스캔의 오른쪽에 오도록 뼈를 회전합니다.
   3. 이러한 조정이 완료되면 스캔을 곧게 펴서 중심축에 대해 대칭이 유지되도록 합니다.
   4. 회전된 데이터 세트를 저장합니다.
2. 경골 회전
   1. 경골에 대해 4.1.1-4.1.4단계를 반복합니다.

5. 기계적 테스트 절차

1. 준비
   1. 기계적 테스트 전에 6-10μm 분해능 μCT 스캔을 획득하고 재구성하여 각 샘플에 대해 고품질 스캔을 획득하여 파괴 부위의 단면 형상을 계산했는지 확인합니다(섹션 2-3).
   2. 스캔을 얻고 확인한 후 테스트 전에 모든 뼈를 해동합니다(섹션 1). 같은 날 한 실험의 모든 뼈를 테스트하고 테스트 순서를 무작위화하여 샘플 및 실험 그룹 간에 사용자 편향과 시스템 변동성을 최소화합니다. 테스트 과정 내내 뼈가 수분을 유지하는지 확인하십시오.
2. 기기 셋업
   1. 시편에 적합한 감도와 용량을 가진 로드셀을 찾으십시오. 시편에 대한 예상 파손 범위를 고려하고 감도를 최대화하면서 약 50% 더 많은 용량을 가진 로드셀을 선택하십시오(예: 0-25N 파손 범위의 마우스 뼈에 대해 45N 용량의 10lbf 로드셀).
   2. 하중 및 지지 스팬 고정구를 찾습니다.
   3. 그림 1과 같이 로드셀을 테스터의 상단 또는 하단 지지대에, 상단 로딩 고정구를 로드셀에, 하단 고정구를 테스터의 하단 지지대에 나사로 고정하여 로드셀과 고정구를 설치합니다. 안전한 착용감을 보장합니다.
      알림: 로드셀과 유체의 접촉을 피하기 위해 굽힘 테스트를 수행할 때 일반적으로 로드셀을 상단 고정 장치에 부착하는 것이 좋지만 필요한 경우 하단을 사용할 수 있습니다.
   4. 로드셀과 고정 장치가 설치되면 지지 범위 길이를 선택하고 테스트 중인 모든 샘플에 대해 일정하게 유지되는지 확인합니다. 지지 범위 거리를 선택하려면 먼저 샘플 세트에서 가장 짧은 본을 찾습니다.
   5. 그림 2와 같이 픽스처 사이에 뼈의 방향을 지정합니다.
   6. 대퇴골의 3점 굽힘에 대해서는 그림 2A를 따르십시오. 뼈의 앞쪽 표면이 지지 스팬에 닿아 있고 스팬 영역이 샘플의 단피 내에 있는지 확인합니다. 근위 끝에 세 번째 trochanter를 포함하지 말고 뼈가 원위 끝에 metaphysis 및 condyles로 넓어지는 전이 지점을 포함하지 마십시오.
   7. 4점 굽힘의 경우 지지대와 하중 범위가 서로 정렬되고 중앙에 있는지 확인하십시오. 그림 2B 를 따라 픽스처에 본을 로드합니다.
      1. 지지대 및 하중 범위 길이가 3:1 비율⁸을 따르도록 설정합니다(예: 지지 범위 9mm 및 하중 범위 3mm).
      2. 경골의 경우, 경골/비골 접합부에서 하나의 지지대를 사용하여 뼈의 내측 표면을 지지 스팬에 가합니다. 다른 지지대는 경골 능선 바로 뒤에 위치할 가능성이 높습니다. 로딩 스팬이 지지 스팬 내 중앙에 배치되고 골격의 균일한 영역이 포함되는지 확인합니다.
   8. 3점 굽힘을 수행하는 경우 지지 범위 거리를 측정하고 4점 굽힘을 수행하는 경우 하중 및 지지 범위 거리를 모두 측정하고 이 거리를 기록합니다. 이 값이 하중 및 지지 범위 측정 모두에 대해 하중 지점의 중심에서 기록되는지 확인하십시오.
   9. 뼈를 식염수에 다시 넣거나 식염수 덩어리로 수분을 보충하십시오.
      참고: 하중 범위에 대한 점을 선택할 때 원형 점을 사용하는 것이 좋습니다(0.75mm 반경이면 하중을 분산하는 동시에 원의 탄젠트에서 골격과 접촉하므로 충분함). 이론에서는 점 하중을 나타내기 위해 나이프 에지를 권장하지만, 이는 하중 적용 지점에서 뼈를 부수어 변형률을 과대 평가하고 모듈러스를 과소 평가하게 합니다.
   10. 고정 장치의 모든 부품이 단단하고 움직이지 않는지 확인하십시오.
3. 소프트웨어 설정
   1. 테스터가 모듈 상자, 로드셀 채널 및 시스템 설명서에 따른 기타 요구 사항을 통해 컴퓨터에 제대로 연결되어 있는지 확인하십시오.
   2. 기계식 테스터와 연결된 소프트웨어에서 골격을 파손할 수 있는 점탄성 효과(0.025mm/s가 자주 사용됨)를 유발하지 않을 만큼 변위 속도가 느린 램프를 사용하여 굽힘 테스트 프로파일을 생성합니다.
   3. 테스트 프로필을 만들 때 최소 샘플 주파수 25Hz도 권장되지만 더 높은 샘플링 속도가 선호됩니다.
   4. 스터디 그룹당 하나의 폴더를 만들고 각 테스트를 해당 폴더 내에 개별 파일로 저장합니다.
4. 샘플 로딩 및 테스트
   1. 적절하게 동결해제된 골격을 선택합니다(1.2단계 참조). 캘리퍼스로 전체 길이를 측정하고 기록하십시오.
   2. 3점 굽힘에서 대퇴골을 테스트하는 경우 그림 2A, 4점 굽힘에서 경골을 테스트하는 경우 그림 2B와 같이 샘플을 고정 장치에 로드합니다.
   3. 테스트 중인 샘플을 반영하도록 파일 이름을 변경합니다.
   4. 하중을 0으로 설정합니다(변위가 아님). 시스템의 무버를 켜십시오. 하중 또는 변위 제어에 있지 않은지 확인하십시오.
   5. 주의해서 뼈에 최소한의 사전 하중을 가하여 뼈의 위치를 고정하고 뼈가 굴러가는 것을 방지하되 샘플이 손상되지 않도록 합니다. 약 0.25N의 예압을 목표로 합니다. 계속하기 전에 원하는 뼈 방향이 유지되는지 확인하십시오.
   6. 식염수를 넉넉하게 적셔 샘플을 수화하십시오.
   7. 소프트웨어에서 시작(Start ) 또는 실행(Run )을 선택하여 굽힘 테스트를 시작합니다. 중요: 전체 테스트에 대한 샘플을 주의 깊게 관찰하고 문제가 발생한 테스트(예: 롤링, 미끄러짐)를 기록하십시오.
      참고: 이러한 문제는 데이터를 손상시킬 수 있으며 이러한 테스트에 대한 참고 사항은 분석 중에 참조하는 데 도움이 됩니다.
   8. 뼈가 골절되기 시작하는 것을 지켜보십시오(인장 쪽). 대부분의 테스트는 오류가 발생할 때까지 진행됩니다. 이 시점에서 테스트는 프로그래밍된 한계를 통해 종료됩니다. 고장이 발생하지만 테스터가 계속 변위되는 경우 로드셀의 손상을 방지하기 위해 수동으로 테스트를 중지하십시오.
   9. 테스트가 완료되면 캘리퍼스를 사용하여 말단부에서 중단점까지의 길이를 측정하고 기록합니다.
   10. 각 샘플에 대해 5.4.1 – 5.4.9단계를 반복합니다.

그림 1: 기계식 테스터 설정. (A) 3점 및 (B) 4점 굽힘 시험. 로드셀은 노란색으로, 로딩 고정 장치는 파란색으로, 지지 고정 장치는 녹색으로 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 픽스처 사이의 골 격 방향. (A) 올바르게 배치되었을 때 대퇴골의 내측, 전방 및 후방에서 (위에서 아래로) 보기를 보여주는 3점 굽힘 하중 고정 장치에서 대퇴골의 올바른 방향. 적재 고정 장치는 주황색으로 표시되고 지지 고정 장치는 파란색으로 표시됩니다. 하단 스팬은 diaphysis의 가장 직선 부분을 가능한 한 많이 포함하도록 조정해야 하며 상단 고정 장치는 해당 스팬 사이의 중앙에 있어야 합니다. (B) 경골의 전방, 측면 및 내측에서 (위에서 아래로) 보기를 보여주는 4점 굽힘을 위한 경골의 올바른 방향. 내측 표면이 하단 고정구와 접촉하고 측면 표면이 상단 고정구와 접촉하도록 뼈를 로드해야 합니다. 경골-비골 접합부는 하중 범위 바로 바깥쪽에 위치해야 합니다. 스팬은 1:3의 하중 대 지지 스팬 비율을 가장 잘 충족하도록 조정해야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

6. ROI 선택

1. 브레이크 길이를 기록한 상태에서 회전된 이미지를 사용자가 선택한 소프트웨어에 로드합니다. 회전된 이미지가 로드되면 뼈의 위쪽 및 아래쪽 슬라이스를 찾아 기록합니다.
2. 위쪽 슬라이스와 아래쪽 슬라이스의 차이를 계산합니다. 이 값에 스캐닝 복셀 크기를 곱하여 뼈의 전체 길이(마이크로미터)를 결정합니다.
3. CT 스캔에서 파괴 위치를 찾으려면 기록된 파단 길이(마이크로미터)를 복셀 크기로 나누어 스캔의 말단에서 파단 지점까지의 μCT 슬라이스 수를 구합니다.
4. 이 위치를 중심으로 하는 ROI를 선택합니다. 먼저 원하는 ROI의 총 길이(최소 100μm)를 설정합니다. 마이크로미터 단위의 길이를 복셀 크기로 나누어 이 길이가 나타내는 슬라이스 개수를 구하면 ROI의 총 슬라이스 개수를 확인할 수 있습니다.
5. ROI의 하한을 구하려면 총 ROI 슬라이스 수를 2로 나누고 6.4단계에서 이전에 계산한 구분 위치에서 이 값을 뺍니다.
6. 이전에 계산된 값에 조각으로 된 ROI의 총 길이를 더하여 ROI의 상한을 구합니다.
7. 계산된 한계를 기반으로 적절한 ROI를 선택하고 저장합니다.

7. 힘 및 변위 데이터의 정규화

알림: 기계식 테스터는 x 및 y 좌표(변위, 힘)가 있는 점만 생성합니다. 이러한 점은 오일러-베르누이 굽힘 응력 및 변형률 방정식을 사용하여 응력 및 변형률로 변환할 수 있지만 μCT 스캔에서 얻은 기하학적 특성이 필요합니다. 이러한 특성의 정량화는 사용자가 선호하는 소프트웨어를 사용하여 수행할 수 있습니다. 우리는 모든 입력, 계산 및 출력을 완벽하게 제어할 수 있는 사용자 지정 코드를 선호합니다. 앞서 언급했듯이 코드에 액세스하려면 교신 작성자에게 직접 문의하거나 https://bbml.et.iupui.edu/ 의 랩 웹 사이트를 방문하여 자세한 내용을 확인하십시오. 응력 및 변형률 방정식과 이를 계산하기 위해 μCT 스캔에서 얻어야 하는 필수 기하학적 특성은 아래에 설명되어 있습니다.

1. 3점 굽힘 정규화 방정식
   1. 3점 굽힘에서 응력을 계산하는 데 사용되는 방정식은 아래 방정식 1에 나와 있습니다. 이 방정식에서 "F"는 힘을 나타내고 "L"은 지지 범위의 길이를 나타냅니다. 힘 값은 시험 중에 기계식 테스터에 의해 기록됩니다. 테스트 전에 지지 범위의 길이가 기록되었는지 확인하십시오. "c"와 "I"는 μCT 스캔(섹션 7.3)을 사용하여 계산되는 기하학적 속성입니다.
      (1)
   2. 변형률을 계산하는 방정식은 아래 방정식 2에 나와 있습니다. "c"와 "L"은 응력 및 변형률 계산에 대해 동일한 속성을 나타냅니다. "d"는 시험 중 기계식 테스터가 기록한 변위 값을 나타냅니다.
      (2)
2. 4점 굽힘 정규화 방정식
   1. 4점 굽힘의 응력 방정식은 아래 방정식 3에 나와 있습니다. "F"와 "I"는 7.1.1단계에서 설명한 것과 동일한 변수로 유지됩니다. 테스트 전에 지지대 및 하중 범위 측정에서 "a"를 계산합니다. 4점 굽힘의 하중 스팬에 대한 지지대에 대해 3:1의 권장 비율을 따르는 경우 "a"는 지지 스팬 길이의 1/3이 됩니다.
      (3)
   2. 4점 굽힘의 변형률에 대한 방정식은 아래 방정식 4에 나와 있습니다. "C"와 "A"는 응력 및 변형률 계산에 대해 동일한 특성을 나타냅니다. "d"는 시험 중 기계식 테스터가 기록한 변위 값을 나타냅니다.
      (4)
3. μCT 스캔에서 기하학적 특성 계산
   1. 변수 "c"는 중립 축에서 장력이 가해진 골격 표면까지의 거리를 나타냅니다. 결과적으로, 중립 축이 중심을 통과하기 때문에 μCT 스캔에서 각 단면의 중심을 결정합니다.
      1. 5.2.6단계에서 설명한 3점 굽힘에서 대퇴골의 테스트 방향을 따르는 경우 전방 표면에 대해 "c"를 측정합니다.
      2. 5.2.7단계에서 설명한 경골의 테스트 방향을 따르는 경우 뼈의 내측 표면에 대해 "c"를 측정합니다.
   2. 변수 "I"는 굽힘 축(대퇴골의 경우 내측-외측 축, 경골의 경우 전방-후방 축)에 대한 면적 관성 모멘트를 나타냅니다. 수식 5를 사용하여 이 값을 계산합니다. 이 방정식에서 "dA"는 μCT 스캔에서 캡처된 각 픽셀의 면적이고 y는 중립 축에서 각 픽셀의 계산된 거리입니다.
      (5)

8. 관심의 기계적 테스트 특성

1. 기계적 특성을 계산하기 전에 힘-변위 곡선과 응력-변형률 곡선(중요한 특성과 함께 아래 그림 3에 표시된 이상적인 곡선)을 생성합니다.
   참고: 생물학적 샘플 테스트가 항상 이러한 이상적인 예와 같은 곡선을 생성하는 것은 아니지만 여전히 유용한 가이드입니다.
2. 분석 전에 이러한 곡선을 검사하여 뼈가 구르거나 미끄러지는 것과 같은 테스트 오류를 찾아냅니다. 이러한 오류는 일반적으로 곡선의 초기 선형 부분에 범프 또는 평평한 영역을 발생시킵니다. 이 시점에서 테스터가 본에 접촉하기 전에 수집되었을 수 있는 데이터 또는 실패 후 데이터를 포함하여 초과 데이터를 제거합니다.
3. 표시된 곡선에 의해 품질 테스트가 보장되면 중요한 특성의 분석을 시작합니다.
   1. 뻣뻣함과 탄성 계수
      1. 힘-변위 곡선의 탄성 영역만 사용하여 강성을 계산합니다. 이 영역에서 곡선의 기울기는 강성입니다.
      2. 응력-변형률 곡선의 탄성 부분의 기울기만 사용하여 탄성 계수를 계산합니다.
   2. 항복점
      NOTE: 항복점은 두 개가 있는데, 하나는 힘-변위 곡선에 있고 다른 하나는 응력-변형률 곡선에 있습니다. 힘-변위 곡선에서 이 점에 대한 (x,y) 값은 항복 및 항복 힘에 대한 변위로 알려져 있으며, 응력-변형률 곡선의 값은 항복 응력 및 항복 응력에 대한 변형률로 알려져 있습니다. 이러한 점은 곡선의 탄성 영역의 끝을 나타내며 아래 나열된 방식으로 찾을 수 있습니다.
      1. 응력-변형률 곡선 방법: (0,0)에서 0.2% 변형률(2,000마이크로스트레인)로 선 오프셋을 계산하지만 탄성 계수와 동일한 기울기를 사용합니다. 이 선을 응력-변형률 그래프에 플로팅합니다. 이 선이 응력-변형률 곡선을 가로채는 위치는 항복점으로 정의됩니다. 이 항복 응력 및 변형 좌표를 사용하여 유사한 힘과 변위 값을 찾습니다. 이 값은 항복 값에 대한 항복력과 변위를 나타냅니다.
      2. 시컨트 방법: 힘-변위 곡선에서 강성을 계산하고 선택한 백분율(5-10%)만큼 강성을 줄입니다. 이 감소된 강성의 기울기로 (0,0)에서 시작하는 선을 플로팅하고 힘-변위 곡선과 교차하도록 합니다. 교차점에는 좌표(항복에 대한 변위, 항복력)가 있습니다.
         참고: 시컨트 방법을 사용하여 응력-변형률 데이터 없이 항복점을 찾을 수 있습니다.
   3. 궁극의 힘과 극한의 스트레스
      1. 각 데이터 세트에서 최대값을 찾아 극한 힘과 극한 응력을 계산합니다.
   4. 변위 및 변형률 특성
      1. 항복점에 대한 변위 및 변형은 항복점에 대한 변위 또는 변형을 나타내는 항복 값을 나타냅니다. 이를 찾으려면 8.3.2단계에서 설명한 대로 수율을 찾습니다.
      2. 총 변위(Total Displacement) 및 총 변형률(Total Strain) 값은 시험 전반에 걸쳐 샘플이 경험한 총 변위 또는 총 변형률을 나타내며 고장점에 해당합니다.
      3. 항복 후 변위 및 항복 후 변형률: 항복 후 변위는 일반적으로 보고되며 총 변위에서 항복을 위해 변위를 빼서 계산할 수 있습니다. 총 변형률에서 항복을 뺀 변형률을 빼서 항복 후 변형률을 계산하지만, 변형률은 재료가 선형 탄성(예비항복)이라는 가정 하에 먼저 파생되므로 주의해서 보고해야 합니다. 이로 인해 사후 yield 측정값이 무효화되기 쉽습니다.
   5. 에너지 특성
      1. 에너지를 힘-변위 또는 응력-변형률 곡선 아래의 영역으로 계산합니다.
      2. 힘-변위 곡선 아래의 영역을 작업이라고 합니다. 곡선의 사전 항복 부분 또는 탄성 영역에서 계산된 면적을 탄성 일 또는 에너지라고 합니다. 항복점 또는 소성 영역을 지나 곡선 아래에서 계산된 면적을 사후 항복점 또는 소성 작업 또는 에너지 손실이라고 합니다.
      3. 응력-변형률 곡선 아래에서 계산된 총 면적을 인성 또는 인성 계수라고 하며, 응력-변형률 곡선 아래에서 항복점까지 계산된 면적을 복원성이라고 합니다. 항복 후 변형률과 같은 항복 후 인성은 이 특성이 해당되지 않는 변형률 방정식의 가정으로 인해 보고되지 않는 경우가 많습니다.

그림 3: 힘-변위 및 응력-변형률 곡선. (A) 이상적인 힘-변위 곡선; (B) 빨간색으로 표시된 항복점을 계산하는 데 사용된 0.2% 오프셋 방법에서 파생된 선이 있는 이상적인 응력-변형률 곡선(이 선은 곡선의 탄성 영역의 기울기와 동일한 기울기를 가짐). 힘-변위 곡선에서 얻을 수 있는 주요 특성에는 항복력, 극한 힘, 항복에 대한 변위, 총 변위 및 작업이 포함됩니다. 응력-변형률 곡선에서 얻을 수 있는 조직 수준 특성에는 항복 응력, 극한 응력, 항복 변형률, 총 변형률, 탄력성 및 인성이 포함됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

CT 스캔이 완료되면 대부분의 부적절한 스캔이 재구성 중에 발견될 수 있습니다. 종종 불량한 스캔은 스캔 중 오류의 명확한 지표인 높은 정렬 불량 보정을 갖습니다. 그러나 다른 단계에서 오류가 발생할 수 있으며 데이터가 부정확해질 수도 있습니다. 이러한 오류는 계산된 개별 아키텍처 속성을 검사할 때 종종 발견될 수 있습니다. 값이 그룹의 다른 범위에서 멀리 벗어나면 스캔, ROI 및 속성 계...

토론

스캔 및 테스트 프로세스 전반에 걸쳐 문제 해결 및 최적화가 적절한 순간이 있습니다. 첫 번째는 μCT를 사용하여 뼈를 스캔할 때 발생합니다. 많은 시스템에는 하나의 물체를 잡고 스캔할 수 있는 홀더가 함께 제공되지만 맞춤형 홀더를 제작하여 동시에 여러 뼈를 스캔할 수 있습니다. 여러 뼈를 스캔하는 것은 최적화를 위한 훌륭한 포인트가 될 수 있지만, 아티팩트가 유발되지 않도록 스캔 및 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
CTAn	Bruker	NA	CT Scan Analysis Software
DataViewer	Bruker	NA	CT Scan Rotation Software
Matrix Laboratory (MATLAB) 2023a	MathWorks	NA	Coding platform used for data analysis
NRecon	Bruker	NA	CT Scan Reconstruction software
SKYSCAN 1272-100 kV w/ 16 MP CCD detector, incl 3D Suite Software	Micro Photonics Inc	SKY-016814	Micro-CT system that can non-destructively visualize up to 209 mPs in every virtual slice through an object