중화 분석을 통해 SARS-CoV-2에 대한 체액성 면역 반응을 모니터링하기 위한 분자 도구로서의 유사형 바이러스

요약

유사형 바이러스(PV)는 실제 바이러스를 취급하는 것보다 더 안전한 조건에서 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 복제 결함 바이러스입니다. 여기에 제시된 자세한 프로토콜은 SARS-CoV-2 PV를 사용하여 COVID-19 백신 접종 후 환자 혈청의 중화 능력을 테스트하는 방법을 보여줍니다.

초록

유사형 바이러스(PV)는 관심 유전자 전달을 위한 유전자 치료에 더 잘 알려진 용도 외에도 숙주-바이러스 상호 작용을 연구하고 혈청 샘플의 중화 능력을 테스트하는 데 사용할 수 있는 분자 도구입니다. PV는 바이러스 게놈이 PV에 통합되지 않은 서로 다른 플라스미드로 나뉘기 때문에 복제 결함이 있습니다. 이 안전하고 다재다능한 시스템을 통해 생물 안전 레벨 2 실험실에서 PV를 사용할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 여기에 언급된 바와 같이 3개의 플라스미드를 기반으로 렌티바이러스 PV를 생산하기 위한 일반적인 방법론을 제시한다: (1) 감염을 모니터링하는 데 필요한 리포터 유전자를 운반하는 백본 플라스미드; (2) PV를 생성하는 데 필요한 모든 구조 단백질에 대한 유전자를 운반하는 패키징 플라스미드; (3) 바이러스 tropism을 결정하고 숙주 세포로의 바이러스 진입을 매개하는 envelope surface glycoprotein 발현 플라스미드. 이 연구에서 SARS-CoV-2 스파이크는 비복제성 SARS-CoV-2 유사형 렌티바이러스 생산에 사용되는 외피 당단백질입니다.

간단히 말해서, 패키징 셀(HEK293T)은 표준 방법을 사용하여 3개의 서로 다른 플라스미드와 co-transfection되었습니다. 48시간 후, PV를 함유하는 상층액을 수거, 여과하고, -80°C에서 보관하였다. SARS-CoV-2 PV의 감염성은 감염 후 48시간 후 표적 세포주에서 리포터 유전자(루시페라아제)의 발현을 연구하여 테스트되었습니다. 상대 발광 단위(RLU) 값이 높을수록 감염/전달률이 높아집니다. 또한, 감염성 PV를 연속적으로 희석된 혈청 샘플에 첨가하여 유사 바이러스가 표적 세포에 진입하는 중화 과정을 연구했으며, RLU 강도의 감소로 측정되었습니다: 높은 중화 활성에 해당하는 낮은 값.

서문

유사형 바이러스(PV)는 숙주-바이러스 및 병원체-병원체 상호 작용을 연구하기 위해 미생물학에서 사용되는 분자 도구입니다 1,2,3,4. PV는 바이러스 게놈을 보호하는 바이러스 코어인 내부 부분과 트로피즘을 정의하는 바이러스 표면의 외피 당단백질인 외부 부분으로 구성된다⁵. 유사 바이러스는 새로운 바이러스 입자를 생성하기 위한 모든 유전 정보를 포함하지 않기 때문에 표적 세포에서 복제가 불가능합니다. 이러한 특이한 특징의 조합으로 인해 PV는 야생형 바이러스에 대한 안전한 대안이 될 수 있습니다. 반면에 야생형 바이러스는 병원성이 높아 BSL 2 실험실에서 분석을 위해 사용할 수 없다⁶.

PV의 감염성은 일반적으로 형광 단백질(GFP, RFP, YFP) 또는 화학발광 산물(루시페라아제)을 생산하는 효소를 코딩하는 리포터 유전자에 의해 모니터링될 수 있습니다. 이것은 PV 생산에 사용되는 플라스미드 중 하나에 포함되어 있으며 유사 ....

프로토콜

본 의정서는 베로나 대학교 윤리 위원회(승인 의정서 번호 1538)의 승인을 받았으며 지침을 따릅니다. 연구에 참여한 인간 피험자로부터 정보에 입각한 서면 동의를 얻었습니다. 전혈 샘플은 항 SARS-CoV-2 백신을 접종하는 과정에 있는 의료 종사자(HCW) 자원 봉사자로부터 수집되었습니다. 이들 샘플은 혈청¹⁵의 후속 분리를 위해 항응고제를 함유하는 플라스틱 튜브에서 수집하였다.

다음 모든 공정은 멸균 조건에서 작동하는 Class-2 생물학적 후드에서 수행되어야 합니다. 바이러스 취급은 주의해서 수행해야 하며 모든 폐기물은 희석된 표백제 용액으로 중화해야 합니다. 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

그림 1: 중화 분....

토론

야생형 바이러스를 사용하면 실제 감염을 시뮬레이션할 수 있지만, 렌티바이러스 PV는 병원성 바이러스를 다루는 데 필요한 엄격한 안전 요건 없이 바이러스 유입 및 감염과 관련된 메커니즘을 연구하는 데 더 안전한 옵션입니다 ^4,20,21. PV는 연구의 목적인 병원성 바이러스의 표면 외피 당단백질로 둘러싸인 복제 결함 바이러?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.45 μm filter	SARSTEDT	83 1826
6-well plate	SARSTEDT	83 3920
96-well plate	SARSTEDT	8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units	Merck	10403892
Black Opaque 96-well Microplate	Perkin Elmer	60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium	SIGMA-ALDRICH	D6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)	AUROGENE	AU-L0615-500
Foetal Bovine Serum	AUROGENE	AU-S1810-500
Graphpad Prism version 7	graphpad dotmatics	NA	In the manuscript, we replace the commercial name with 'data analysis program'
HEK293T cells	ATCC	CRL-3216
HEK293T/ACE2 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T has been transduced to overexpress ACE2 with a lentiviral vector.
L-glutamine	AUROGENE	AU-X0550-100
Luminometer - Victor3	Perkin Elmer	HH35000500	In the manuscript, we replace the commercial name with  'luminometer'
Opti-MEM	Thermo Fisher Scientific	11058021	In the manuscript, we replace the commercial name with 'reduced serum medium'
p8.91 packaging plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmid	Di Genova et al., 2021		A kind gift from Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycin	AUROGENE	AU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)	SIGMA-ALDRICH	408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)	Addgene	145839	This plasmid was used to generate HEK293Tcells/ACE2
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmid	Addgene	pGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay System	Perkin Elmer	6066759	In the manuscript, we replaced the commercial name with 'luciferase reading reagent'
Trypsin EDTA 1x	AUROGENE	AU-L0949-100