역전사 루프 매개 등온 증폭을 통한 SARS-CoV-2 바이러스 검출

요약

여기에서는 RT-LAMP(reverse transcription loop-mediated isothermal amplification)를 통해 인간 샘플에서 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 방법을 표준화하고 구현하기 위한 완전한 프로토콜을 제공합니다. 60분 이내에 완료되는 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 모든 실험실이나 현장 진료에 적용할 수 있습니다.

초록

중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2) 바이러스는 인간의 건강에 큰 영향을 미쳤습니다. 많은 사람들이 감염으로 사망하기 때문에 현대 사회에 계속 위협이 되고 있습니다. 이 질병은 황금 표준 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)과 같은 혈청학적 및 분자 검사를 사용하여 진단됩니다. 마지막은 전문 인프라, 값비싼 장비 및 숙련된 인력이 필요하기 때문에 몇 가지 단점이 있습니다. 여기에서는 인간 샘플에서 RT-LAMP(reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification)를 사용하여 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하는 데 필요한 단계를 설명하는 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜에는 silico에서 프라이머를 설계하고, 시약을 준비하고, 증폭 및 시각화하기 위한 지침이 포함되어 있습니다. 표준화되면 이 방법은 저렴한 비용과 저렴한 장비를 사용하여 60분 이내에 모든 실험실 또는 현장 진료에 쉽게 구현하고 적용할 수 있습니다. 다양한 병원체를 감지하는 데 적응할 수 있습니다. 따라서 현장 및 보건소에서 적시에 역학 감시를 수행하는 데 잠재적으로 사용될 수 있습니다.

서문

중증 급성 호흡기 증후군 코로나 바이러스 2 (SARS-CoV-2)는 코로나 바이러스 질병 2019 (COVID-19)를 유발합니다. 세계보건기구(WHO)는 2020년 1월 30일 국제적 공중보건 비상사태를, 2020년 3월 11일 팬데믹을 선포했습니다. 팬데믹으로 인해 이 기사가 작성된 시점을 기준으로 7억 6천만 명 이상의 확진자와 687만 명의 사망자가 발생했습니다¹.

이 바이러스의 영향은 전염병 탐지 및 통제를 개선하기 위해 더 우수하고, 더 정확하고, 더 빠르고, 더 널리 사용 가능한 감시 도구의 필요성을 강조했습니다 ^2,3. 팬데믹 기간 동안 SARS-CoV-2 진단 검사는 핵산, 항체 및 단백질 검출을 기반으로 했지만 핵산의 RT-PCR 검출이 황금 표준입니다⁴. 그러나 RT-PCR에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 분자 생물학 교육을 받은 특수 장비, 인프라 및 인력이 필요하므로 전문 실험실로 적용이 제한됩니다. 또한 표본을 실험실로 운반하는 데 걸리는 시간을 제외하고 시간이 많이 소요되며(4-6시간) 며칠이 걸릴 수 있습니다⁵. 이러한 제약으로 인해 효율적인 검체 처리와 비상 계획 및 역학 관리에 필요한 정보를 얻을 수 없습니다.

RT-LAMP(Reverse Transcription-Loop-Mediated Isothermal Amplification)는 RT-PCR에 비해 몇 가지 장점이 있어 특히 자원이 제한된 환경에서 미래의 POCT(point-of-care diagnostic test)를 설계하는 데 매력적인 전략이 된다⁶. 첫째, 표적 서열에서 6-8개의 영역, 즉 DNA^또는 RNA ^7,8을 인식하는 4-6개의 프라이머를 사용하기 때문에 매우 특이적입니다. 둘째, 일정한 온도에서 작동하기 때문에 증폭을 생성하기 위해 실시간 열 순환기와 같은 정교한 장비가 필요하지 않으며 이를 작동하기 위해 고도로 훈련된 인력이 필요하지 않습니다. 셋째, 반응 시간이 매우 짧고(~60분) 매우 전문화되지 않은 시약이 사용되어 비용 효율적인 도구입니다⁶. 앞서 언급한 바와 COVID-19 팬데믹으로 인한 보건 비상 사태를 감안할 때, 이 기법은 모든 연구 실험실에서 빠르고 저렴하며 간단하게 구현할 수 있는 대체 진단 방법으로 볼 수 있다⁹.

이 기사에서는 열순환기와 수조를 사용하여 비색 방법으로 SARS-CoV-2를 검출하기 위해 RT-LAMP를 표준화하고 구현하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다(그림 1). 임계점, 한계 및 이를 발전시키기 위한 대안에 대해 논의합니다.

그림 1: RT-LAMP 기법을 사용하여 SARS-CoV-2를 증폭하기 위한 프로토콜 체계. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

프로토콜

사용된 샘플은 Fundación Valle del Lili University 병원의 임상 실험실에서 제공되었으며 RT-qPCR 기술을 사용하여 COVID-19 양성 반응을 보인 환자의 정제된 RNA와 일치했습니다. 모든 환자는 연구에 대한 사전 동의를 제공했으며, 이 연구는 Fundación Valle del Lili University 병원의 인간 연구를 위한 생명윤리 위원회의 승인을 받았습니다.

1. RT-LAMP 프라이머 설계 및 준비

참고: LAMP 프라이머는 NEB(New England BioLabs) LAMP, Primer Explorer 및 LAMP assay versatile analysis(LAVA)를 포함한 다양한 플랫폼과 함께 사용할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜의 경우 NEB LAMP 도구가 사용되었습니다. 프라이머 설계는 NextStrain 데이터베이스¹⁰에서 얻은 SARS-CoV-2 게놈을 사용하여 수행할 수 있습니다. 표 1 은 이 프로토콜에 사용된 프라이머 세트를 보여줍니다.

1. LAMP용 프라이머 설계
   1. 바이러스 게놈 염기서열을 얻습니다.
   2. 시퀀스 정렬을 수행하여 합의 시퀀스를 얻습니다.
   3. NEB LAMP 프라이머 설계 도구 플랫폼¹¹로 이동하여 퀵 가이드의 지침을 따릅니다. 이 도구는 프라이머 탐색기 V5와 동일한 결과를 생성하지만 출력이 훨씬 사용자 친화적입니다. Primer Explorer 사용자 설명서를 Primer Design의 가이드로 사용하십시오.
2. 프라이머 세트의 열역학적 평가
   1. Primer-Dimer¹² 도구를 사용하여 얻은 프라이머에 대한 열역학 분석을 수행합니다.
   2. 프라이머 시퀀스를 도구에 넣습니다. 그런 다음 Multiplex Analysis and Dimer Structure Report 옵션을 선택합니다.
   3. ΔG가 -5 이상인 프라이머 세트를 선택합니다.
3. 설계된 프라이머의 특이성 평가
   1. BLAST¹³ 의 뉴클레오티드 수집(nt/nt) 데이터베이스를 사용하여 각 프라이머를 분석합니다.
   2. 첫 번째 BLAST 분석을 수행하려면 Refseq_rna 데이터베이스를 선택하고 Orthocoronavirinae 아과에 속하는 속 그룹으로 검색을 필터링합니다. 알파코로나바이러스(taxid:693996), 감마코로나바이러스(taxid:694013), 델타코로나바이러스(taxid:1159901)입니다. 또한 H1N1 아형(taxid:114727), 인플루엔자 A 바이러스(taxid:11320) 및 인플루엔자 B 바이러스(taxid:11520)로 동시 순환하는 다른 바이러스에 대해 염기서열을 평가합니다.
   3. 두 번째 BLAST 분석을 수행하려면 Betacoronavirus GenBank를 선택하고 Coronaviridae(taxid:11118) 및 SARS(taxid:694009)로 검색을 필터링합니다. 이 그룹에는 박쥐에서 발견되는 게놈, Betacoronavirus(taxid:694002)를 포함하여 확인된 모든 SARS 코로나바이러스 게놈의 염기서열이 포함되어 있습니다.
   4. 이 프로토콜의 경우 프라이머가 표적 게놈인 SARS-CoV-2 이외의 게놈과 일치하지 않도록 합니다.
4. 프라이머 준비
   1. 이요건조된 프라이머가 들어 있는 바이알을 마이크로 원심분리기(10,000 x g, 실온[RT]에서 1분)로 회전시켜 튜브 개방 중 손실을 방지합니다.
   2. 이요건조된 분말을 0.1% 디에틸 피로카보네이트(DEPC) 물 또는 뉴클레아제가 없는 물에 최종 농도 100μM(표 2)로 재수화하고 위아래 피펫팅으로 완전히 용해시킵니다. 그런 다음 마이크로 원심분리기에서 최대 속도(10,000 x g, RT에서 1분)로 회전하여 튜브 바닥에 있는 모든 프라이머 용액을 수집합니다.
   3. 표 2에 보고된 바와 같이 전방 내부 프라이머(FIP), 후방 내부 프라이머(BIP), 전방 외부 프라이머(F3), 후방 외부 프라이머(B3), 루프 백워드(LB) 및 루프 포워드(LF) 프라이머를 사용하여 생물안전 캐비닛 아래에 2x 프라이머 혼합물을 준비합니다. 손실을 방지하려면 마이크로 원심분리기로 빠른 회전(10,000 x g, RT에서 1분)을 수행하기 전에 프라이머 용액을 피펫팅하거나 부드럽게 소용돌이치십시오.
   4. 장기 보관을 위해 10x 프라이머 혼합물을 -20°C에서 보관하십시오. 그러나 너무 많은 동결-해동 주기를 피하기 위해 여러 샘플에 관계없이 최대 5개의 실험에 대해 충분히 준비하십시오.
      주의사항 더 작은 부피의 프라이머 혼합물이 필요한 경우 새 부피를 계산하여 값을 조정하십시오(표 2). 또한 RT-LAMP 반응에는 루프 프라이머가 필요하지 않기 때문에 RdRp 및 RdRp/Hel 세트에는 LF 프라이머가 포함되어 있지 않습니다. 결과적으로 LF 프라이머의 부피를 뉴클레아제가 없는 물 또는 0.1% DEPC 물로 교체합니다.

2. RT-LAMP 반응

1. 제조업체의 지침에 따라 층류 캐비닛을 켜고 공기 흐름이 안정화될 때까지 최소 3분 동안 기다립니다.
2. 공기 흐름이 안정되면 무균 기술을 사용하여 캐비닛의 내부 표면을 청소하고 살균합니다. 이를 위해 1000ppm 4차 암모늄(염화벤잘코늄), 2% 차아염소산염, 3% 과산화수소 및 70% 에탄올 순서로 소독제를 사용하십시오.
   알림: 이 경우 무균 기술은 소독제를 도포하고 이전에 청소한 표면을 거치지 않고 냅킨으로 객실 내부에서 외부로 제거하는 것을 수반합니다.
3. 2.2 단계의 소독제를 사용하여 동일한 순서로 객실에 들어갈 재료를 청소하십시오.
   참고: 마이크로피펫, 필터 팁 박스, 1.5mL 및 0.6mL 튜브가 있는 플라스크, 0.2mL PCR 튜브, 랙 및 400mL 비커를 캐비닛에 가져와야 합니다.
4. 냅킨과 니트릴 장갑을 기내에 반입하십시오. 그런 다음 캐비닛을 끄고 15분 동안 자외선(UV)에 노출시킵니다.
   주의: 장기간 방사선 노출로 인한 조직 및 DNA 손상을 방지하려면 2.4단계에서 설정한 시간이 만료될 때까지 자외선을 피하십시오.
   주의사항 프로토콜을 시작하기 전에 그림 2 에 표시된 조립을 수행하고 2.4단계를 완료한 후 수조를 시작하십시오. 금속 용기에 식수를 거의 가득 채우고 철제 실험실 가열판의 온도를 90 ° C로 설정하는 것이 중요한데, 이는 시스템의 온도가 ~ 66.3 ° C가 될 수 있으므로 수은 온도계로 모니터링됩니다.
5. 조사 기간이 끝나면 캐비닛을 다시 시작하고 1.1단계의 권장 사항을 따르십시오.
6. 시약(표 3, 표 4 및 표 5)을 얼음이 채워진 냉각기 또는 작은 폴리스티렌 냉장고에 넣습니다. 70% 에탄올로 세척한 후 용기를 캐비닛에 넣습니다.
7. 0.6mL 미세 원심분리기 튜브에서 증폭할 유전자의 LAMP 혼합물(RdRp, N-A 및 RdRp/Hel)을 준비하고 다음 구성 요소만 추가합니다: 10x 완충액, MgSO₄, dNTPs, 1x 프라이머 믹스 및 뉴클레아제가 없는 물 또는 0.1% DEPC 물; 균질화하기 위해 피펫팅으로 잘 섞습니다.
   주의: 캐비닛 내부의 부적절한 취급 및 동작으로 인해 시약 오염의 위험이 높습니다. 이 문제를 완화하기 위해 다음 규칙을 따라야 합니다: (i) 멸균 및 필터 팁을 사용하십시오. (ii) 각 시약에 대해 하나의 팁을 사용하십시오. (iii) 층류를 방해하지 않도록 천천히 조심스럽게 움직입니다. (iv) 질서를 유지하고 최소한의 재료를 사용합니다. (v) 다른 장갑을 사용하여 혼합물을 준비하고 유전 물질을 첨가하십시오.
   알림: 모든 시약, 특히 효소는 온도 변화로 인해 변성되고 중합효소 활성이 변경될 수 있으므로 얼음에 보관하십시오.
8. 캡을 닫은 상태로 0.6mL 튜브를 가열 블록에 넣고 95°C에서 5분 동안 배양합니다.
   알림: l을 시작하기 전에 최소 30분 동안 캐비닛 외부에 있는 1.5-2.0mL 튜브의 가열 블록을 켜십시오.amp 혼합물 준비를 하고 수은 또는 알코올 온도계로 온도(95°C)를 모니터링합니다.
9. 배양이 완료되면 튜브를 얼음이 채워진 폴리스티렌 쿨러에 5분 동안 넣습니다.
10. 튜브를 층류 캐비닛으로 되돌리고 효소 DNA 중합효소(Bst 3.0), 역전사 효소 및 고충실도 DNA 중합효소(표 3, 표 4 및 표 5)를 추가하여 LAMP 혼합물 준비를 완료합니다. 비색 검출을 사용하는 경우 염료 하이드록시나프톨 블루(HNB)를 추가합니다.
11. 이 시약을 첨가한 후 LAMP 시약을 피펫팅하여 효소와 염료를 용해시켜 잘 혼합합니다.
12. 기포가 생기지 않도록 주의하면서 각 PCR 튜브에 22.0μL의 혼합물을 채웁니다. 그런 다음 3.0μL의 0.1% DEPC 물 또는 뉴클레아제가 없는 물을 음성 대조군 또는 템플릿 없는 튜브(NTC)에 추가하고 나머지 튜브는 추가(유전 물질)를 위해 따로 보관합니다.
    참고 : Bst 3.0 효소가 활성화되어 반응이 조기에 시작되지 않도록 샘플이 추가될 때까지 PCR 튜브를 얼음이 채워진 냉각기에 보관하십시오.
13. 캐비닛에서 모든 재료를 제거하고 70% 에탄올을 사용하여 표면을 청소합니다. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 전원을 끕니다.
14. 별도의 영역에서 각 PCR 튜브에 3μL의 샘플을 추가하고 완전히 균질화합니다. 이를 위해 20μL 마이크로피펫과 필터 팁을 사용하십시오.
    주의: 유전 물질을 첨가하는 데 사용되는 마이크로피펫은 이 목적으로만 사용해야 하며 혼합물을 준비하는 데 사용할 수 없습니다. 이러한 방식으로 시약의 오염을 방지할 수 있습니다. 또한 RNA 분해 가능성을 줄이기 위해 RNA 샘플을 항상 얼음 위에 보관하십시오. 샘플 추가를 위해 일회용 가운, 모자, N95 마스크, 레깅스, 실험실 고글 및 니트릴 장갑과 같은 개인 보호 장비(PPE)를 사용하십시오.
15. 비색 반응을 수행하기 전에 고품질 카메라로 PCR 튜브의 사진을 찍습니다. HNB의 시작 색상은 보라색입니다.
16. 다음 시스템 또는 장비에서 반응을 수행하십시오: (i) 열 순환기 및 (ii) 수조.
    1. 열 순환기: 튜브를 반응 블록에 증착하고 thermopro를 설정합니다.file ( 표 6 참조) 장비에.
    2. 수조: 튜브를 원형 용기에 넣고 튜브가 나오지 않도록 잘 조정하십시오. 그 후, 표 2에 나열된 온도에서 수조(그림 6A, B)에 용기를 넣습니다.
17. 수조의 경우 튜브가 시스템 내부에 들어가면 타이머를 60분 동안 시작합니다(표 6).
18. 반응 시간 후 열 순환기 또는 수조에서 튜브를 제거하고 전기 영동 실행을 위해 4 °C에서 또는 사용할 때까지 -20 °C에서 보관하십시오.
19. 비색 반응이 수행된 경우 고품질 카메라를 사용하여 PCR 튜브의 사진을 촬영합니다. HNB의 최종 색상은 하늘색입니다.

3. 아가로스 겔의 증폭 산물 분석

참고: 이러한 단계는 비색 반응을 위한 추가 검사 또는 표준화 단계 중 성능 제어로 제안됩니다. 이는 이 기술이 이러한 테스트를 수행하는 실험실에 큰 오염 위험을 초래할 수 있기 때문입니다.

1. 가장자리 고무가 벽에 닿도록 베드를 전기영동 챔버 내부에 배치하여 아가로스(내부 챔버)를 추가할 수 있는 밀폐된 공간을 만듭니다(그림 3A, B).
2. 3.1단계를 완료한 후 500mL 비커에 필요한 양의 아가로스를 칭량하여 2% 겔을 얻습니다. 그 후, 필요한 부피의 0.5x 트리스 아세테이트 EDTA(TAE) 완충액을 추가하고 1-2분 동안 전자레인지에 넣습니다.
   알림: 아가로스는 오븐에서 꺼낼 때 덩어리가 없고 반투명하면 완전히 녹습니다. 이것이 확인되지 않으면 제대로 겔화되지 않은 영역이 남아 증폭 산물의 전기영동 실행 및 시각화가 변경될 수 있습니다.
3. 오븐에서 비커를 꺼내고 3.1단계에서 만든 내부 챔버에 아가로스를 붓습니다(그림 3C). 그런 다음 기포가 없는지 확인하고 기포가 있으면 마이크로피펫 팁을 사용하여 제거합니다.
4. 빗을 배열하여 웰을 형성하고 아가로스를 실온(RT)에서 약 30분 동안 겔에 둡니다.
5. 이 시간이 끝나면 5mL의 0.5x TAE 완충액을 추가하여 빗과 겔이 들어있는 베드를 쉽게 제거할 수 있습니다. 그런 다음 웰이 양극에 오도록 겔을 배치합니다(그림 3D).
6. 제조업체가 지정한 용량까지 0.5x TAE 버퍼로 전기영동 챔버를 채우고 전극이 버퍼와 접촉하도록 합니다.
7. 겔의 첫 번째 웰에 3μL의 분자량 마커를 추가하고 9μL의 NTC와 각 샘플을 다음 웰에 추가합니다. 7 μL의 증폭 산물과 3 μL의 로딩 버퍼를 결합하여 만듭니다. 그런 다음 이 혼합물 9μL를 겔의 웰에 로드합니다.
8. 전기영동 챔버를 뚜껑으로 덮고 케이블을 색상 패턴으로 전원 공급 장치 포트에 연결합니다. 전원을 다음 매개변수로 설정하십시오: 100V 및 일정한 암페어 120분 동안.
9. 전기영동 실행이 완료된 후 염색 용액(에티듐 브로마이드)이 있는 용기에 겔을 넣고 30분 동안 배양합니다.
10. 배양 후 염색 용액에서 젤을 제거하고 지퍼 잠금 백에 넣습니다. 이렇게 하면 앰플리콘을 시각화하는 데 사용될 장비의 오염을 방지할 수 있습니다.
11. Amersham Imager 600과 같은 트랜스일루미터 또는 이미저에서 겔을 시각화합니다.

결과

프로토콜의 구현은 위에서 설명한 프로토콜에 따라 각 타겟 유전자에 대한 프라이머 세트를 설계하는 것으로 시작됩니다. 2020년 6월, NextStrain 데이터베이스에서 5,000개의 SARS-CoV-2 게놈을 얻었으며 콜롬비아 게놈의 10%를 대표했습니다. 이러한 염기서열은 프라이머 설계 과정에서 사용된 합의 염기서열을 얻기 위해 정렬되었습니다. 표 1 은 프라이머 RdRp/Hel 및 RdRp에 대해 선택된 프라이?...

토론

RT-LAMP는 분자 진단을 수행하기 위한 보완적인 방법론으로 간주되지만, 프로토콜을 표준화하고 구현할 때 고려해야 하는 몇 가지 제한 사항과 중요한 단계도 있습니다.

SARS-CoV-2 검출을 위한 LAMP 표준화는 마스터 믹스에서 다음 매개변수와 구성 요소를 평가했습니다: (a) 프라이머의 농도 및 정렬 온도; (b) 효소의 농도; (c) 마그네슘 농도; (d) 반응 시간; (e) BSA, DMSO, 구아니디늄 클?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Store at -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Store at roome temperature
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	It can be used in case Q5 High-Fidelity DNA polymerase cannot be purchased. For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Store at -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Handle it with caution under an extraction cabinet
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Store at -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	For the enzyme, make aliquots of an appropriate volume and store at -20 °C until use.