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요약

제시된 것은 노인 초파리 모델에서 초파리 의 수면 행동을 모니터링하여 수면을 개선하기 위한 고처리량 약물 스크리닝을 위한 프로토콜입니다.

초록

건강과 전반적인 웰빙의 필수 구성 요소인 수면은 수면 시간이 짧아지고 패턴이 단편화되는 수면 장애를 자주 경험하는 노인에게 종종 어려움을 초래합니다. 이러한 수면 장애는 또한 당뇨병, 심혈관 질환 및 심리 장애를 포함한 노인의 다양한 질병의 위험 증가와 관련이 있습니다. 안타깝게도 수면 장애에 대한 기존 약물은 인지 장애 및 중독과 같은 심각한 부작용과 관련이 있습니다. 따라서 새롭고 더 안전하며 효과적인 수면 장애 치료제의 개발이 시급합니다. 그러나 현재 약물 스크리닝 방법의 높은 비용과 긴 실험 기간은 여전히 제한 요인으로 남아 있습니다.

이 프로토콜은 포유류에 비해 수면 조절 메커니즘이 고도로 보존된 종인 Drosophila melanogaster를 활용하는 비용 효율적이고 처리량이 높은 스크리닝 방법을 설명하여 노인의 수면 장애 연구에 이상적인 모델입니다. 늙은 파리에게 다양한 작은 화합물을 투여함으로써 수면 장애에 미치는 영향을 평가할 수 있습니다. 이 파리의 수면 행동은 적외선 모니터링 장치를 사용하여 기록되고 오픈 소스 데이터 패키지인 Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020(SCAMP2020)으로 분석됩니다. 이 프로토콜은 수면 조절을 위한 저렴하고 재현 가능하며 효율적인 스크리닝 접근 방식을 제공합니다. 초파리는 수명주기가 짧고 사육 비용이 낮으며 취급이 쉽기 때문에이 방법의 훌륭한 주제입니다. 예를 들어, 테스트된 약물 중 하나인 Reserpine은 노령 파리의 수면 시간을 촉진하는 능력을 입증하여 이 프로토콜의 효과를 강조했습니다.

서문

인간의 생존에 필요한 필수 행동 중 하나인 수면은 크게 두 가지 상태, 즉 급속 안구 운동(REM) 수면과 비급속 안구 운동(NREM) 수면1로 나뉜다. NREM 수면은 N1(각성과 수면 사이의 전환), N2(얕은 수면), N3(깊은 수면, 서파 수면)의 세 단계로 구성되며, 각성에서 깊은 수면으로의 진행을 나타냅니다1. 수면은 신체적, 정신적 건강에 중요한 역할을 한다2. 그러나 노화는 성인의 총 수면 시간, 수면 효율, 서파 수면 비율, REM 수면 비율을 감소시킨다3. 나이가 많은 사람들은 서파 수면에 비해 얕은 수면에 더 많은 시간을 보내는 경향이 있어 야간 각성에 더 민감합니다. 각성 횟수가 증가함에 따라 평균 수면 시간이 감소하여 노인의 수면 패턴이 단편화되며, 이는 마우스에서 Hcrt 뉴런의 과도한 흥분과 관련될 수 있다4. 또한, 일주기 메커니즘의 노화 관련 감소는 수면 시간의 조기 변화에 기여합니다 5,6. 신체적 질병, 심리적 스트레스, 환경적 요인 및 약물 사용과 함께 이러한 요인은 노인을 불면증, REM 수면 행동 장애, 기면증, 주기적인 다리 움직임, 하지불안증후군, 수면 호흡 장애와 같은 수면 장애에 더 취약하게 만듭니다 7,8.

역학 연구에 따르면 수면 장애는 우울증10, 심혈관 질환11, 치매12 등 노인의 만성 질환9과 밀접한 관련이 있는 것으로 나타났다. 수면 장애를 해결하는 것은 만성 질환을 개선 및 치료하고 노인의 삶의 질을 향상시키는 데 중요한 역할을 합니다. 현재 환자들은 수면의 질을 향상시키기 위해 벤조디아제핀, 비벤조디아제핀, 멜라토닌 수용체 작용제와 같은 약물에 주로 의존하고 있다13. 그러나 벤조디아제핀은 장기 복용 후 수용체의 하향 조절과 의존성을 유발할 수 있으며, 복용 중단 시 심각한 금단 증상을 유발할 수 있다14,15. 비벤조디아제핀 약물은 치매16, 골절17, 암18 등의 위험을 수반한다. 일반적으로 사용되는 멜라토닌 수용체 작용제인 라멜테온(ramelteon)은 수면 잠복기를 감소시키지만 수면 시간을 늘리지 않으며 광범위한 1차 통과 제거로 인해 간 기능 관련 문제가 있다19. 멜라토닌 수용체 작용제이자 세로토닌 수용체 길항제인 아고멜라틴은 우울증 관련 불면증을 개선하지만 간 손상의 위험도 있다20. 따라서 수면 장애를 치료하거나 완화하기 위해 더 안전한 약물이 시급히 필요합니다. 그러나 자동화된 시스템 및 컴퓨터 분석과 결합된 분자 및 세포 실험을 기반으로 하는 현재의 약물 스크리닝 전략은 비용과 시간이 많이 소요된다21. 수용체 구조와 특성에 의존하는 구조 기반 약물 설계 전략은 수용체 3차원 구조에 대한 명확한 이해가 필요하며 약물 효과에 대한 예측 능력이 부족하다22.

2000년, 1984년 캠벨(Campbell)과 토블러(Tobler)가 제안한 수면 기준에 기초하여23, 연구자들은 수면과 유사한 상태(25,26)를 나타내는 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)를 포함하여 수면24를 연구하기 위한 간단한 동물 모델을 확립했다. 초파리와 인간의 해부학적 차이에도 불구하고 초파리의 수면을 조절하는 많은 신경화학적 구성 요소와 신호 전달 경로가 포유류의 수면에서 보존되어 인간 신경 질환 연구를 용이하게 합니다27,28. 초파리는 또한 파리와 포유류 사이의 코어 발진기의 차이에도 불구하고 일주기 리듬 연구에서 광범위하게 사용됩니다 29,30,31. 따라서 초파리는 수면 행동을 연구하고 수면 관련 약물 스크리닝을 수행하는 데 귀중한 모델 유기체 역할을 합니다.

이 연구는 늙은 파리를 사용하여 수면 장애를 치료하기 위한 저분자 약물을 스크리닝하기 위한 비용 효율적이고 간단한 표현형 기반 접근 방식을 제안합니다. 초파리 의 수면 조절은 매우 잘 보존되어 있으며25 나이가 들면서 관찰되는 수면 감소는 약물 투여를 통해 되돌릴 수 있다. 따라서, 이러한 수면 표현형 기반 스크리닝 방법은 약물 효능을 직관적으로 반영할 수 있다. 조사 중인 약물과 먹이를 섞어 파리에게 먹이고, DAM(Drosophila Activity Monitor)32을 사용하여 수면 행동을 모니터링 및 기록하고, MATLAB의 오픈 소스 SCAMP2020 데이터 패키지를 사용하여 수집된 데이터를 분석합니다(그림 1). 통계 분석은 통계 및 그래프 소프트웨어를 사용하여 수행됩니다( 자료표 참조). 예를 들어, 수면을 증가시키는 것으로 보고된 소포성 모노아민 수송체의 저분자 억제제인 Reserpine에 대한 실험 데이터를 제시하여 이 프로토콜의 효과를 입증합니다33. 이 프로토콜은 노화 관련 수면 문제를 치료하기 위한 약물을 식별하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다.

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프로토콜

이 프로토콜은 블루밍턴 초파리 스톡 센터(Bloomington Drosophila Stock Center)에서 채취한 30일 된 w1118 파리를 사용합니다(BDSC_3605, 자료표 참조).

1. 숙성 초파리의 준비

  1. 음식 준비
    1. 콘플레이크 50g/L, 설탕 110g/L, 한천 5g, 효모 25g/L를 섞어 표준 옥수수 전분 배양 배지를 준비합니다. 콘플레이크와 이스트를 물로 가열하여 젤라틴화한 다음 모든 물질을 완전히 녹입니다.
    2. 배지가 50-60°C로 냉각되면 프로피온산 6mL/L를 추가하고 즉시 배양병에 포장합니다.
  2. 파리 사육 및 늙은 파리의 준비
    1. 표준 옥수수 전분 배양 배지가 들어있는 병에 파리 균주 w1118을 사육하고 25 ° C, 68 % 상대 습도, 500-1000 lux 조명 조건 및 12 시간 : 12 시간 빛 : 어두운 사이클의 항온 인큐베이터에 병을 넣습니다.
    2. 파리의 성장 주기에 따라 7일마다 새 병에 파리를 옮겨 넣어 같은 병에 든 개체의 나이를 일정하게 유지합니다.
    3. 옮긴 후 3일 후에 원래 병에서 부화하는 새 파리 배치를 수집하여 새 병에 넣습니다. 7일마다 젖병을 갈아주는 원칙에 따라 생후 30일 정도까지 배양합니다.

2. 모니터링을 위한 약용 식품 및 유리관 준비

참고: 유리관 제조 절차는 Jin et al.의 작업을 수정하여34로 따릅니다.

  1. 유리관의 세척 및 건조
    1. 유리관(직경 5mm x 길이 65mm, 재료 표 참조)을 큰 비커에 넣고 담갔다가 이중 증류수로 20분 동안 끓입니다. 3회 반복합니다.
    2. 유리관을 꺼내 묶고 내부를 이중 증류수로 3-5회 헹구고 오븐에 넣어 건조시킵니다.
  2. 단순 배양 배지(100mL)의 제조
    1. 한천 1.5g과 자당 5g을 이중 증류수에 녹이고 가열한 후 100mL로 농축합니다.
    2. 매체가 약 70°C로 냉각될 때 600μL의 프로피온산을 첨가하여 항온 수조를 사용하여 응고되는 것을 방지합니다.
    3. 약물이 20μM 또는 50μM에 도달할 때까지 약 4mL의 단순 배지와 레세르핀( 재료 표 참조)을 10mL 작은 비커에 추가합니다. 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 음성 대조군의 0.2% 농도로 추가합니다.
  3. 의약품이 들어있는 유리관의 준비
    1. 매체의 흐름을 용이하게 하려면 적절한 길이의 유리관을 작은 비커에 조심스럽게 삽입하십시오. 매체는 대기압으로 인해 자연적으로 유리관으로 들어갑니다.
    2. 배양액이 완전히 응고되면 유리관을 빼내고 외벽을 닦아 한쪽 끝에 약물이 들어 있는 배양액이 있는 모니터링 유리관을 얻습니다.
    3. 고체 파라핀을 비이커에 넣고 70°C에서 녹을 때까지 가열하고 유리관 끝을 음식에 가깝게 파라핀 액체에 5mm 정도 넣고 재빨리 제거합니다. 파라핀이 응고되어 유리관의 음식 끝을 밀봉할 때까지 기다립니다.

3. 실험 설계 및 플라이 처리

  1. 파리 처리에 대한 실험을 표 1에 따라 설계합니다.

4. 초파리 집합과 수면 감시

참고 : 초파리 조립 절차는 Jin et al.34의 작업을 수정하여 따릅니다.

  1. CO2 가스로 파리를 마취하고 파라핀으로 밀봉된 유리관(튜브당 1개)에 넣고 흡수성 면봉으로 비식품 끝을 막아 파리가 빠져나가는 것을 방지하고 공기 순환을 보장합니다.
  2. 모니터링을 위해 적외선 모니터에 튜브를 로드합니다.
    1. 파리가 들어있는 유리관을 적외선 모니터에 같은 방향으로 조립하고 각 약물에 해당하는 모니터 번호와 구멍 번호를 기록합니다.
    2. 각 튜브의 정렬을 조정하고 적외선이 파리의 활동 범위 중심을 수직으로 통과하도록 합니다.
    3. 25°C 온도, Zeitgeber 12(ZT12)(현지 시간 오후 08:00에 해당) 및 ZT24(현지 시간 오전 08:00에 해당)의 지정된 설정에 따라 플라이 슬립 암실에 있는 25°C 인큐베이터 내부에 모니터를 놓습니다. 이 설정은 파리가 12시간의 빛과 어둠을 번갈아 경험하도록 합니다.
      알림: 모니터링 중 인큐베이터의 안정적인 환경을 유지하기 위해 모니터링 데이터 수집이 완료될 때까지 문을 열지 마십시오.
    4. DAM2 시스템을 사용하여 모니터링을 시작합니다( 재료 표 참조).
    5. 모니터링이 완료되면 시스템에서 수집된 데이터를 .txt 형식으로 다운로드합니다.

5. 데이터 처리

알림: DAM 시스템, DAMFileScan107 및 SCAMP를 사용한 데이터 처리는 공식 웹 사이트의 지침에 따라 수행되었습니다( 자료 표 참조).

  1. 스캔을 위해 위의 txt 파일을 DAMFileScan107 소프트웨어로 가져오고 필요에 따라 분할하여 절전 데이터를 얻습니다.
    1. 모니터를 시작한 후 세 번째 아침에 세그멘테이션 데이터의 시작 시간을 8:01(1분 세그멘테이션) 또는 8:00(30분 세그멘테이션)으로 설정하고 종료 시간은 시작 시간 3일 후 오전 8:00입니다(그림 2A1).
      알림: 파리는 최소 하루 동안 모니터링 환경에 적응해야 합니다. 따라서 분할 데이터 시작 시간을 모니터가 시작된 후 3일째 되는 날 오전 8시로 설정할 수 있습니다.
    2. 1분과 30분 간격으로 데이터를 분할합니다. "Bin Length" 옵션을 1분으로 변경하고 "Output File Type" 옵션을 Channel files로 변경하고 이름을 바꾸고 출력합니다. 30분 데이터 분할 방법은 위와 동일합니다(그림 2A2-5).
      참고: 1분 및 30분 간격으로 데이터 분할을 수행할 때 두 파일의 최종 이름 바꾸기가 일치해야 합니다. 그렇지 않으면 후속 Matlab 처리 중에 읽지 못할 수 있습니다. 필요한 경우 출력 후 파일 이름을 변경하여 쉽게 구분할 수 있습니다.
  2. SCAMP2020를 사용한 데이터 처리
    1. Matlab에서 SCAMP2020 프로그램 패키지를 열고 Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program(SCAMP)을 두 번 클릭합니다(그림 2B).
    2. 하위 폴더 "Vecsey SCAMP Scripts"를 경로에 추가하고 해당 폴더에서 "scamp.m" 파일을 찾아 실행합니다. 다음 팝업 창에서 프로세스 1 min 및 30 min 폴더를 순서대로 선택합니다(그림 2C,D).
    3. 모니터를 선택하고 Load individual See Plots to preview(미리 볼 플롯 참조)를 클릭한 다음 나타나는 이미지를 확인합니다. 죽은 파리의 해당 채널을 선택 취소합니다(그림 3A2, 그림 3B).
    4. 위의 단계를 반복하여 모든 모니터를 확인합니다.
    5. 검사할 해당 약물에 따라 각 모니터의 각 채널 이름을 바꾸고(그림 3A3) 모든 모니터를 선택한 다음 분석을 위해 선택한 데이터 분석을 클릭합니다(그림 3A4).
    6. 기본적으로 선택된 옵션을 선택하고 Analyze for Selected Bin을 클릭하고 Export Data를 선택한 다음 마지막으로 GRAPH 30 min Data Types for All Days for Selected Groups 및 EXPORT All Data를 클릭하여 결과를 출력합니다(그림 3C).
  3. CSV 파일에서 s30이라는 파일을 선택하고, 각 모니터에 해당하는 평균값과 표준 오류 데이터를 찾고, 수정 및 조정을 위해 Excel에 백업하고, GraphPad Prism(재료 표 참조)에 붙여넣어 절전 상태 다이어그램을 그립니다(그림 4A,B).
  4. "stdur"라는 파일을 찾아 3일 이내에 각 파리에 대한 주간, 야간 및 총 수면의 평균값을 계산합니다(그림 4A,C). 데이터를 Prism 소프트웨어에 붙여넣어 차이 테스트를 완료하고 그래프를 그립니다.

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결과

레세르핀(Reserpine)은 수포성 모노아민 수송체(vesicular monoamine transporter, VMAT)의 저분자 억제제로, 모노아민이 시냅스전 소포(presynaptic vesicles)로 재흡수되는 것을 억제하여 수면 증가를 유도한다33. 레세르핀의 수면 촉진 효과는 생후 30일 된 파리를 대상으로 조사되었으며, 대조군에는 용매인 디메틸설폭사이드(DMSO)만 먹였습니다. 레세르핀 그룹에서 나이 든 파리는 DMSO 그룹에 비해 ...

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토론

설명된 방법은 중소 규모의 수면제를 신속하게 스크리닝하는 데 적합합니다. 현재 대부분의 주류 고처리량 약물 스크리닝 방법은 생화학 및 세포 수준을 기반으로 합니다. 예를 들어, 수용체의 구조 및 특성을 검사하여 수용체에 결합할 수 있는 특정 리간드를 검색한다(22). 또 다른 접근법은 질량 분석법(35)과 함께 핵 자기 공명(NMR)을 사용하여 선택된 약물의 ?...

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공개

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

토론과 의견을 주신 한준하이 교수님의 연구실 구성원 여러분께 감사드립니다. 이 연구는 Y.T.에 32170970 중국 국립 자연 과학 재단과 Z.C.Z.에 장쑤성의 "시안 블루 프로젝트"의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AgerBIOFROXX8211KG001
Artificial Climate BoxPRANDTPRX-1000Aofficial website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity MonitorTriKineicsDAM2official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2systemTriKineicsversion:v3.03official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScanTriKineicsversion:1.0.7.0official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl SulfoxideSIGMA276855
Drosophila Activity Monitoring IncubatorTritech ResearchDT2-CIRC-TKofficial website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila BottlesBiologix51-17720official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118Bloomington Drosophila Stock Center BDSC_3605
ExcelMicrosoftversion:Excel 2016official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubesTriKineticsPPT5x65official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022bMathWorksversion:9.13.0.2049777official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
PrismGraphPadVersion:Prism 8.0.1official website:https://www.graphpad.com/features
ReserpineMACKLINR817202-1g
SaccharoseSIGMA1245GR500
SCAMPVecsey LabN/Aofficial website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

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