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요약

상호 작용 경험 설계 및 사용자 요구 사항 분석의 통합을 통해 재현성, 신뢰성, 실용성, 세포 무결성 및 사용자 경험 측면에서 세포 상처 치유 분석을 향상시키는 혁신적인 세포 스크레이퍼를 소개합니다.

초록

상처 치유 분석에서 세포 이동 측정의 신뢰성은 널리 퍼진 방법론적 불안정성, 즉 팁 기반 분석법으로 인해 자주 훼손됩니다. 이러한 한계를 해결하도록 설계된 혁신적인 기기를 소개합니다. 당사의 새로운 셀 스크레이퍼는 현재 접근 방식을 능가하여 보다 일관되고 안정적인 cell-free 갭을 생성합니다. 반복된 생물학적 실험을 통해 셀 스크레이퍼에 의해 생성된 cell-free gap이 팁 기반 기술에 비해 더 직선적인 가장자리와 균일한 크기 및 모양을 나타낸다는 것이 밝혀졌습니다(p < 0.05). 제품 설계 측면에서 셀 스크레이퍼는 실험실 환경에 적합한 세련된 색상 구성표를 자랑하며 실험 결과의 모니터링을 강화하고 재사용을 위한 오토클레이브를 통한 멸균을 허용합니다. 특히, 처리 후 세포 스크레이퍼는 세포 생존율과 증식에 미치는 영향이 미미하다는 것을 보여줍니다(각각 97.31% 및 24.41%). 반대로, 팁 기반 방법은 세포 생존율(91.37%)과 증식률(18.79%)이 낮습니다. 이 연구는 세포 스크레이퍼를 세포 생존력을 보존하면서 재현 가능한 cell-free gaps를 생성할 수 있는 새롭고 재사용 가능한 장치로 제시하여 기존 기술에 비해 상처 치유 분석의 신뢰성을 높입니다.

서문

종양은 선택적 성장 이점, 대사 재배선 및 면역 조절과 같은 뚜렷한 특징이 있으며, 이 모든 특징은 종양 세포의 중요한 악성 행동인 세포 이동을 향상시키는 데 흥미롭게 기여합니다. 이 특징은 원발성 종양의 원격 전이에 직접적인 영향을 미쳐 환자 1,2,3의 장기 생존을 손상시킵니다. 선택적 성장의 이점은 암세포가 정상 세포를 능가할 수 있도록 하며, 대사 재배선은 에너지 경로를 변경하여 이러한 빠른 증식을 지원합니다. 동시에 면역 조절은 종양이 신체의 방어를 회피할 수 있도록 합니다. 여러 연구에 따르면 세포 이동이 활발하게 진행된 결과인 폐 전이가 다양한 암 환자의 사망으로 이어지는 말기 질환임을 보여주며 이 문제의 심각성을 강조하고 있다4. 예를 들어, 유방암5, 자궁경부암4, 골육종6이 각각 20%, 9%, 30%를 차지한다. 따라서 종양 세포 이동을 평가하는 것은 현재 종양학 연구의 필수 요소가 되었으며, 종양 진행의 다면적 특성을 더욱 강조합니다.

세포 상처 치유 분석은 체외 세포 이동을 측정하기 위한 사용하기 쉬운 방법으로, 종양학 연구에서 자주 사용됩니다7. 대부분의 실험자는 피펫 팁을 사용하여 수동으로 세포 상처를 만듭니다8. 이러한 방법은 세포 상처를 빠르고 편리하게 형성할 수 있지만, 세포 이동을 평가하기 위한 재현성 및 정확성에 영향을 미치는 많은 제한 사항이 여전히 있습니다. 첫째, 피펫 팁을 사용하여 수동으로 스크래치를 만드는 것은 작업자의 작동 각도, 힘 및 속도에 큰 영향을 받아 분석법의 반복성에 영향을 미칩니다8. 둘째, 팁에서 생성된 셀 결함은 일반적으로 가장자리가 직선이 아닌 들쭉날쭉한 가장자리를 가지는데, 이는 피펫 팁이 특정 탄성을 가진 플라스틱 제품이기 때문입니다9. 일부 연구에서는 세포 증식 범위를 제한하기 위해 조립식 배양 삽입물을 세포 배양 플레이트에 직접 배치하여 상처를 발생시킨다10. 이 접근 방식은 들쭉날쭉한 가장자리 및 재현성과 같은 팁 기반 방법의 제한을 우회합니다. 그러나 생체적합성 물질을 사용하더라도 세포와의 임베딩의 장기적인 공존은 여전히 세포 성장에 영향을 미칩니다11. 더욱이, 임베딩은 또한 접촉 제한(12)으로 인해 변연 영역에서 세포 후성유전학적 변화를 일으킬 수 있다. 또한 생체적합성 재료로 생산된 접점 삽입물은 비용이 많이 들고 재사용이 어려워 실현 가능성이 제한적이다13. 따라서 in vitro 세포 이동을 쉽게 정량화하기 위해 새롭고 재현 가능하며 실용적인 도구가 필요합니다.

이 방법의 주요 목표는 종양학 연구에서 체외 세포 이동을 정량화하기 위한 혁신적인 도구를 도입하여 기존 기술의 한계를 해결하고 세포 이동 평가의 재현성과 정확성을 향상시키는 것입니다.

이 기술 개발의 근거는 종양학에서 종양 세포 이동을 평가하는 것이 매우 중요하다는 데 있습니다. 종양은 선택적 성장 이점, 대사 재배선 및 면역 조절을 포함한 독특한 특징을 나타내며, 모두 암 악성 종양의 근본적인 측면인 세포 이동을 향상시키는 데 기여합니다. 이 방법은 세포 이동을 연구하는 보다 신뢰할 수 있는 수단을 제공하여 종양 행동에 대한 더 깊은 이해에 기여하는 것을 목표로 합니다.

이 방법은 기존 기술에 비해 상당한 이점을 제공합니다. 수동 스크래치 분석은 작업자에 따른 간섭으로 어려움을 겪을 수 있으며, 배양 삽입물은 세포 성장과 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있습니다. 대조적으로, 이 방법은 향상된 반복성, 정확성 및 실용성을 제공하여 종양학 연구에서 체외 세포 이동을 측정하기 위한 비용 효율적인 솔루션을 제공합니다. 이는 다양한 암 유형에서 세포 이동을 연구하기 위한 신뢰할 수 있고 접근 가능한 도구에 대한 중요한 필요성을 해결하여 이 분야에 귀중한 추가 기능을 제공합니다.

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프로토콜

모든 참가자가 충분한 서면 동의서를 제공했습니다. 본 연구에는 동물 또는 인간 조직 샘플이 포함되지 않았기 때문에 윤리 승인이 적용되지 않았습니다.

1. 사용자 커뮤니티의 요구 사항 조사

  1. 세포 상처 치유 분석을 연구하는 생물학자/실험자에게 설문지를 전달합니다. 완성된 설문지를 수집하여 연구에 사용합니다. 이 연구를 위해 2021년 10월 12일부터 2022년 2월 3일까지 100명의 생물학자에게 100개의 설문지가 전달되었습니다. 응답률은 97%였습니다.
  2. 응답자들에게 세포 긁기 실험 중 어떤 것이 가장 신경이 쓰였는지 묻는 질문에 답하도록 요청하세요. 그리고 셀 스크래칭을 수행하는 데 어떤 도구가 사용되었습니까? 하위 질문과 함께 다음 질문을 따라 원인을 추적하십시오.
  3. 세포 상처 치유 실험에서 피펫 팁 및 세포 배양 삽입물과 같은 도구에 대한 실험자의 인식을 조사합니다. 설문지 섹션14,15의 래더링 기법을 기반으로 한 평균-끝-사슬 이론을 사용하여 다른 도구보다 한 도구를 선택하는 이유를 이해하고 수집합니다.
    참고: 사다리 방법은 두 가지 유형으로 나뉩니다: 심층 인터뷰가 있는 부드러운 사다리 방법과 설문지 또는 종이와 연필 퀴즈를 포함하는 하드 사다리 방법16. 하드 래더링 방법은 이 연구에서 사용된 주요 기술이었습니다. 평균-최종사슬 이론(Means-end-chain theory)은 대상 사용자가 보유한 명시적 지식은 피상적이고 구체적인 반면, 암묵적 지식은 깊고 추상적이라고 제안한다 17,18,19.

2. 설계 및 3차원 모델링

  1. 이전 설문지 설문조사에서 수집한 인사이트를 바탕으로 스케치를 그리고 디자인 프로세스를 시작합니다. 이 예비 스케치를 기본 청사진으로 사용합니다.
    1. 모델링 소프트웨어에서 Dim, DimRadius 및 DimDiameter 기능을 적용하여 각 구성요소의 치수와 레이아웃을 자세히 설명합니다.
    2. 실제 6웰 플레이트에서 0.02mm의 정밀도로 버니어 캘리퍼로 측정을 수행하여 셀 스크레이퍼의 최종 치수를 확인합니다. 길이 42.1mm, 너비 42.1mm, 높이 18.5mm인지 확인합니다. 설계 단계의 세부 사항, 특히 제품 높이와 웰의 적합성에 주의를 기울여 보다 원활한 조립을 용이하게 하십시오.
  2. 3차원 모델을 구성하고 렌더링합니다.
    1. 기본 모델을 생성하여 소프트웨어에서 3D 설계를 시작합니다. 스트레칭을 위한 ExtrudeCrv 및 디자인 형성을 위한 Loft 와 같은 버튼을 클릭합니다. 모델을 정련한 다음 FilletEdge 를 클릭하여 가장자리를 매끄럽게 만듭니다.
      참고: 사용된 다른 기능 버튼은 다음과 같습니다. Lines - 직선 세그먼트를 그리려면, Polylines - 여러 세그먼트로 구성된 연속선을 만들려면, Rectangles - 직사각형 모양을 그리려면, Circles - 원형 모양을 그리려면, Arcs - 호 또는 타원형 모양을 그리려면, Points - 단일 포인트 마커를 배치하기 위해, Text - 텍스트 레이블을 추가하려면, Dimensions - 측정 된 치수를 모델에 추가하려면, Array - 객체의 복사된 패턴을 생성하려면, 회전 - 객체를 원하는 각도로 회전합니다. 이동 - 객체를 새 위치로 이동합니다. Scale - 개체의 크기를 더 크거나 작게 조정합니다. Trim/Extend - 다른 형상에 맞게 개체를 자르거나 확장합니다. Boolean Union/Difference/Intersection - 객체의 교차점을 결합하거나 빼거나 찾습니다. Layers - 다른 레이어에 객체를 구성하려면, 렌더(Render ) - 재질 및 조명과 함께 렌더링된 뷰를 생성하고 내보내기(Export ) - 모델 형상을 다른 파일 형식으로 내보냅니다.
    2. 모델을 3D 렌더링 소프트웨어로 가져옵니다. 플라스틱, 스펀지, 강철을 포함한 재료를 적용한 다음 사실적인 렌더링을 위해 조명을 조정합니다.
      참고: 기능 버튼의 일반화된 목록에는 다음이 포함됩니다. Drag & Drop - 라이브러리에서 재료를 끌어다 실시간 보기에서 원하는 구성 요소에 놓아 부품 또는 모델에 직접 재료를 적용하려면, Right-click - 라이브러리에서 재료를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하면 일반적으로 다음과 같은 옵션이 표시됩니다. Apply to Selection - 실시간 보기에서 선택한 부품에 재료를 적용합니다. 재질 편집 - 재질 속성을 조정합니다. Material Properties (After selecting a material) - 색상, 거칠기, 굴절률 및 기타 속성과 같은 재료의 특정 속성에 액세스하고 수정합니다. Search Bar(검색 창) - 라이브러리에서 재료의 이름 또는 관련 키워드를 입력하여 자료를 빠르게 찾습니다. Categories/Folders 카테고리/폴더 - 금속, 플라스틱, 유리 등과 같은 재료의 다양한 카테고리 또는 폴더를 탐색합니다. Add to Favorites(즐겨찾기에 추가 ) - 향후 세션에서 쉽게 접근할 수 있도록 특정 자료를 즐겨찾기로 표시합니다. 단축키 - 일부 작업은 단축키를 통해 액세스할 수 있습니다. 예를 들어, M은 일반적으로 선택한 부품의 재질 속성을 빠르게 불러오는 단축키입니다.
    3. 마지막으로, 사진 및 디자인 소프트웨어에서 이미지의 대비(+56)와 채도(생동감 +19, 채도 +7)를 향상시키고, 컨텍스트에 맞는 배경 요소(텍스트 정보 및 흰색에서 밝은 회색 그라데이션 배경까지의 색상)를 추가하여 고품질의 사실적인 제품 표현을 보장합니다.
      1. Image > Adjustments, Brightness/Contrast를 사용하여 이미지의 대비를 조정합니다. Image > Hue/Saturation을 사용하여 이미지의 채도 수준을 수정합니다. 텍스트 도구(T 아이콘)를 사용하여 이미지에 텍스트 정보를 추가합니다.
        참고: 기능 버튼의 일반화된 목록에는 Ellipse Tool (U) - To draw dots/circles(타원 도구(U) - 점/원을 그리려면)이 포함됩니다. 도구를 설정하여 도형을 그리고, 원하는 채우기 색상을 선택한 다음, 클릭하고 드래그하여(완벽한 원을 유지하려면 Shift 키를 누른 상태) 점을 만듭니다. Line Tool (U) - 이미지에 직선을 그립니다. 도구를 선택하고 원하는 선 너비를 설정한 다음 클릭하고 드래그하여 선을 그립니다. 브러시 도구 (B) - 점과 선을 그리는 다른 방법입니다. 브러시 크기와 모양을 선택한 다음 클릭(점의 경우)하거나 클릭하고 드래그(선의 경우)합니다.
  3. 3차원 모델을 완성한 후, 연삭 및 조립 방법(20,21,22)을 통해 셀 스크레이퍼의 제조를 진행한다.

3. 생산

  1. 현재 연구에서 CMF(Color, Materials, Finish) 이론을 사용하여 셀 스크레이퍼의 프로토타입을 설계합니다. CMF 이론은 과학 연구에서 설계 방법론으로 사용됩니다. 제품 유용성을 향상시키고, 사용자 인식을 형성하며, 재료 선택을 지시합니다(23,24,25).
    1. Black 6 C, Cool Gray 6 C 및 11-0601TPG26,27을 포함한 표준 색상 시스템에서 셀 스크레이퍼에 사용할 색상을 선택합니다.
    2. 실험실 표준을 충족하는 셀 스크레이퍼를 제작하려면 폴리프로필렌(PP), 스폰지 및 고탄소강을 포함한 적절한 재료를 선택하십시오. 물리적 프로토 타입을 제작하려면 3D 프린터를 사용하여 구조적 프레임 워크를 제작하십시오. 그런 다음 커넥터 또는 접착제를 사용하여 스크레이퍼 조립을 완료합니다.
      알림: 셀 스크레이퍼의 물리적 제품을 준비하려면 필요한 재료를 갈고 조립하십시오. 안전하고 효과적인 최종 제품을 보장하기 위해 전체 공정에서 안전 프로토콜을 따라야 합니다.
    3. 절단, 연삭, 연마, 스탬핑 또는 기타 기술이 포함될 수 있는 마무리 공정으로 이동합니다. 중간 입자, 120방 사포를 사용하여 모델을 샌딩하여 거친 가장자리를 제거하는 것으로 시작합니다.
    4. 그런 다음 미세한 220방 사포로 매끄러운 표면을 얻습니다.
    5. 표면을 매끄럽게 하기 위한 포스트 샌딩, 플러그인 또는 내장 커넥터가 올바르게 일치하는지 확인합니다.
    6. 커넥터(고정 로드)를 사용하여 슬라이드 I과 II를 단단히 결합하여 셀 스크레이퍼의 견고하고 내구성 있는 조립을 보장합니다. 기계적 체결과 접착 본딩의 조합을 통해 셀 스크레이퍼의 최종 고정 형태를 달성합니다. 패스너, 특히 장붓 구멍 및 장부 구조를 사용하여 기계적 힘을 통해 부품을 함께 고정합니다. 또한 어셈블리의 강도를 향상시키려면 접착제(접착제)를 도포하여 구성 요소를 더 접착합니다.
    7. 스크레이퍼를 121.3°C에서 30분 동안 고압멸균하여 원래 모양과 물리적 특성을 유지하는지 확인합니다.

4. 세포 배양

  1. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 최소 필수 배지에서 HOS 세포를 성장시킵니다. 37 ° C에서 5 % CO2로 배양합니다.
  2. 2일마다 배양 배지를 교체하십시오.
  3. 세포 성장이 80% 밀도를 초과하면 0.25% EDTA와 함께 1mL의 트립신을 추가하고 60초 동안 분해합니다. 그 후, 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리하여 계대 배양합니다. 상층액을 제거하고 배양 배지를 추가하여 웰당 5 x 104 세포의 최종 농도를 얻습니다. 세포 계수를 위해 자동화된 세포 카운터를 사용하십시오.

5. 셀 스크레이퍼의 셀 상처 가능성 평가 및 팁 기반 방법

  1. 상처에 대한 모든 재료를 준비하고 30 분 동안 노출시켜 자외선으로 살균하십시오.
  2. 멸균 후 셀 스크레이퍼 방법 또는 팁 기반 방법을 사용하여 웰당 5 x 104 셀의 농도로 6웰 플레이트에 100% 융합 HOS 세포를 감습니다.
    1. 팁 기반 방법의 경우 100μL 팁을 사용하여 수평 방향으로 1개의 스트로크와 수직 방향으로 다른 스트로크를 가진 매체가 포함된 셀을 가로질러 드래그합니다.
    2. 셀 스크레이퍼 방법의 경우 스크레이퍼 프로토 타입을 웰 중 하나에 넣고 핀셋을 사용하여 부드럽게 한 번 누릅니다. 세포가 상처를 입었습니다. 각 상처 입히기 실험을 세 번에 걸쳐 수행하십시오.
  3. 디지털 현미경 시스템과 이미징 소프트웨어를 사용하여 모든 세포 상처를 분석합니다.

6. 세포 생존력 및 세포 증식 측정

  1. CCK-8 Kit에 제공된 프로토콜에 따라 모든 세포 생존도 분석을 수행합니다.
  2. CCK-8 용액으로 37°C에서 2시간 동안 세포를 배양한 다음 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율을 정량화합니다.
  3. 5-ethynyl-20-deoxyuridine(EdU) 통합 분석을 설계하여 DNA 복제를 정확하게 정량화하고 세포 증식 비율을 직접 정량화할 수 있습니다. 이전 간행물28에 설명된 프로토콜에 따라 EdU 분석을 사용하여 세포 증식에 대한 세포 상처를 생성하는 다양한 방법의 영향을 결정합니다.
  4. 세포를 염색하고 디지털 현미경 시스템을 사용하여 이미지화합니다. 각 실험이 세 번에 걸쳐 수행되어야 합니다.

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결과

세포 상처를 생성하는 도구에 대한 사용자 요구 사항 분석
세포 상처를 생성하는 현재의 실험 방법은 생물학적 재현성, 견고성, 경제적 소비 및 세포 상처 치유 분석의 사용자 경험을 손상시키는 많은 문제를 해결하기 위해 추가적인 개선이 필요합니다. 우리는 설문지29 를 통해 생체 실험에 관련된 사용자의 요구 사항을 분석하기 위해 하...

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토론

본 연구는 세포 상처 치유 분석을 위한 자동 기계화 도구를 개발하는 것을 목표로 했습니다. 우리가 아는 한, 이것은 기계화 된 구동 구조를 적용하여 원 클릭 방식으로 세포 상처를 자동으로 생성하려는 첫 번째 시도를 나타냅니다. 이를 통해 낮은 재현성과 불안정한 스크래치 상태와 같은 전통적인 팁 기반 방법의 단점을 해결하는 것을 목표로 합니다. 긍정적인 결과와 ...

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공개

저자는 이해 상충이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 국가사회과학재단(22FYSB023), 후베이성 산업디자인센터연구재단(08hqt201412046), 후베이성 교육부 인문사회과학재단(15Y054)의 보조금으로 지원되었습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
CCK-8 KitBeyotime Company, ChinaC0037
digital microscope systemOlympusIX81
fetal bovine serumGibco, USA16000044
HOS Procell Life Science & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversion 6.0
KeyShotLuxionversion 11.03D rendering software
microplate readerBioTek, GermanELX808
Minimum Essential MediumGibco, USA11095080
Pantone matching systemPantonecommercial color matching
penicillin-streptomycinBeyotime Company, ChinaST488
PhotoshopAdobephoto and design software
Rhinoceros 3DRobert McNeel & Associatesversion 7.03D design software
TC20 Automated Cell CounterBio-RadTC20
TrypsinCytiva HyClone, United StateSH30042.01

참고문헌

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