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요약

일반적인 호흡기 바이러스에 대한 두 가지 프로브 기반 원스텝 RT-qPCR 키트를 소개합니다. 첫 번째 분석은 SARS-CoV-2(N), 인플루엔자 A(H1N1 및 H3N2) 및 인플루엔자 B에 대한 것입니다. 두 번째는 SARS-Cov-2(N)와 메르스(UPE 및 ORF1a)에 대한 것입니다. 이러한 분석은 모든 전문 실험실에서 성공적으로 구현할 수 있습니다.

초록

코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)를 유발하는 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)는 일반 대중의 건강에 심각한 위협이 됩니다. 인플루엔자 시즌에는 SARS-CoV-2 및 기타 호흡기 바이러스의 확산으로 인해 관리하기 어려운 호흡기 질환에 대한 인구 전체의 부담이 발생할 수 있습니다. 이를 위해 다가오는 가을과 겨울철에 호흡기 바이러스인 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, 중동호흡기증후군(MERS-CoV)을 주의 깊게 관찰해야 하며, 특히 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B의 경우 감염 취약 인구, 전염 방식 및 임상 증후군과 같은 유사한 역학적 요인을 공유합니다. 표적 특이적 분석이 없으면 이러한 바이러스의 유사성으로 인해 사례를 구별하는 것이 어려울 수 있습니다. 따라서 이러한 바이러스 표적을 쉽게 구별할 수 있는 민감한 표적 다중 분석은 의료 종사자에게 유용할 것입니다. 본 연구에서는 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, SARS-CoV-2, MERS-CoV의 동시 검출을 위해 자체 개발한 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트를 활용하여 실시간 역전사효소-PCR 기반 분석을 개발했습니다. 10개의 합성 RNA 사본만으로도 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 MERS-CoV 표적을 100% 특이성으로 동시에 성공적으로 식별할 수 있습니다. 이 분석은 정확하고, 신뢰할 수 있으며, 간단하고, 민감하고, 특이적인 것으로 밝혀졌습니다. 개발된 방법은 병원, 의료센터, 진단 실험실에서 최적화된 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B, SARS-CoV-2, MERS-CoV 진단 분석법으로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 연구 목적으로도 사용할 수 있습니다.

서문

현재 진행 중인 코로나바이러스 질병 2019(COVID-19)의 팬데믹은 중증급성호흡기증후군 코로나바이러스 2(SARS-CoV-2)1로 알려진 신종 코로나바이러스에 의해 발생합니다. SAR-CoV-2의 강력한 전염성과 빠른 전파 능력으로 인해 COVID-19 전염병은 중국 우한시에서 발생하여 전 세계로 빠르게 확산되었습니다. 이것은 결국 호흡 곤란 징후의 시작과 심지어 죽음으로 이어졌다 2,3,4. COVID-19는 213개국 이상에서 팬데믹으로 선언되었으며, 다양한 연구 조사에서 발표된 논문에서 알 수 있듯이 확진 사례의 수가 급격히 증가할 것으로 예상됩니다 3,5. COVID-19는 주로 감염된 개인이 환경으로 방출한 다음 흡입 또는 오염된 표면과의 밀접한 접촉을 통해 취약한 개인에게 노출되는 작은 호흡기 비말에 의해 전염됩니다. 이러한 비말이 눈, 입 또는 코의 점막에 닿으면 감염될 수 있다6. 세계보건기구(WHO)가 발표한 통계에 따르면 전 세계적으로 7,600만 건 이상의 팬데믹 확진 사례가 발생했으며 사망자는 700만 명에 달합니다7. 따라서 UN은 COVID-19 질병으로 인한 전염병이 전 세계 수십억 명의 삶에 직접적인 영향을 미치고 광범위한 경제적, 환경적, 사회적 영향을 미쳤기 때문에 재난으로 분류했습니다.

철저한 검사, 조기 발견, 접촉자 추적 및 사례 격리를 포함한 공중 보건 이니셔티브는 모두 이 전염병을 통제하는 데 중요한 것으로 나타났습니다 8,9,10,11. 겨울철에는 COVID-19와 유사한 증상을 보이는 인플루엔자 A 및 B와 같은 다른 호흡기 바이러스의 순환이 증가하여 COVID-19 사례를 조기에 식별, 추적 및 격리하기가 어렵습니다. 매년 A형 인플루엔자와 B형 인플루엔자는 늦가을이나 1월 초에 발생하며, 계절성을 예측할 수 있다12. SARS-CoV-2 및 인플루엔자 바이러스는 수많은 역학적 특성을 공유합니다. 또한 어린이, 노인, 면역 저하자, 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 심부전 및 신부전, 당뇨병과 같은 만성 동반 질환이 있는 개인을 포함하는 감수성 인구에서 유사성을 공유합니다12,13. 이러한 바이러스는 취약한 인구 집단을 공유할 뿐만 아니라 접촉 및 호흡기 비말의 전염 경로도 공유한다14. 독감 시즌이 다가옴에 따라 환자는 이러한 호흡기 바이러스 중 하나 이상에 감염될 가능성이 있을 것으로 예상됩니다14. 이를 위해서는 증상이 있는 환자를 격리하기 전에 SARS-CoV-2 및 인플루엔자 바이러스를 선별해야 합니다. 세 가지 바이러스(SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B)에 대해 별도의 테스트를 실행하는 것은 핵산 추출 및 진단을 위한 전 세계적인 리소스 부족으로 인해 불가능합니다. 한 번의 반응으로 모두 스크리닝하려면 방법 또는 테스트를 개발해야 합니다.

중동호흡기증후군(MERS)-CoV는 인간 코로나바이러스(CoV) 계열입니다. 최초의 MERS-CoV 바이러스 분리는 2012년 9월 급성 호흡기 질환으로 사망한 사우디아라비아의 입원 환자로부터 나왔다15. MERS-CoV의 두드러진 저수지 숙주가 단봉낙타임을 시사하는 증거가 있습니다. 감염된 단봉낙타의 바이러스는 인수공통감염병이므로 인간을 감염시킬 수 있음이 입증되었다16,17. 이 바이러스에 감염된 사람은 밀접 접촉을 통해 다른 사람에게 전염시킬 수 있다18. 2018년 1월 26일 현재, 전 세계적으로 750명의 사망자를 포함하여 2143명의 MERS-CoV 감염 사례가 확인되었습니다. 가장 전형적인 MERS-CoV 증상은 기침, 발열, 숨가쁨입니다. MERS-CoV 감염은 폐렴, 설사 및 위장 질환 증상을 나타내는 것으로 보고되었다20. 현재 MERS-CoV에 대한 상용 백신이나 특정 치료법은 없습니다. 따라서 MERS-CoV의 확산을 예방하고 SARS-CoV-2 질병과 MERS-CoV를 감별하기 위해서는 신속하고 정확한 진단이 필수적입니다.

현재까지 이러한 바이러스를 검출하기 위해 멀티플렉스 RT-PCR 21,22,23,24,25, CRISPR/Cas1226,27, CRISPR/Cas928 및 CRISPR/Cas329, 측면 유동 면역분석법(30), 종이 기반 생체 분자 센서(31), SHERLOCK 테스트 in one pot32, DNA aptamer 33, loop-mediated isothermal 증폭 (LAMP)19,34 등 앞서 언급한 각 방법은 민감도와 특이성 측면에서 고유한 장점과 단점이 있습니다. 이러한 방법 중 핵산 증폭 기반 검사인 멀티플렉스 qRT-PCR이 가장 일반적이며 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 MERS-CoV 진단을 위한 황금 표준으로 간주됩니다.

이 연구에서는 표준 트위스트 합성 바이러스 RNA를 활용하여 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 SARS-CoV-2, MERS-CoV의 효과적이고 정확하며 동시 검출을 위한 다양한 프라이머 조합 및 프로브를 설계하고 평가했습니다. MERS-CoV 또는 SARS-CoV-2 표적 유전자에 대해 개발된 다중 분석은 세계보건기구(WHO)에서 권장합니다. 이러한 유전자는 일반적으로 MERS-CoV 분석에 사용되는 개방 판독 프레임 1a(ORF1a) 내 영역과 같은 복제/전사 복합체(RTC)35 형성에 기여하는 단백질 및 복합체를 암호화합니다. 또한, 구조 단백질은 MERS-CoV 및 SARS-Cov-2 분석에 사용되는 외피 유전자(upE) 및 뉴클레오캡시드 유전자(N)의 업스트림 영역(upstream)과 같은 진단 분석에 사용되는 유전자에 의해 암호화됩니다(각각 35,36). 바이러스 검출을 위한 RT-qPCR을 구축하기 위해 자체 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트를 사용했다37. R3T 원스텝 RT-qPCR 키트 및 프라이머 세트의 바이러스 검출, 민감도, 특이성 및 동적 범위는 표준 트위스트 합성 RNA의 10배 연속 희석을 사용하여 테스트 및 평가되었습니다. 가장 낮은 실제 검출 한계는 반응당 약 10개의 전사체 사본이었습니다. 그 결과, SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 SARS-CoV-2, MERS-CoV의 일상적인 동시 진단에 자체 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트 및 프라이머/프로브 세트를 성공적으로 사용하고 구현할 수 있습니다.

프로토콜

1. Taq 중합효소 발현 및 정제

  1. 효소의 C-말단에 절단 가능한 hexa-histidine tag를 가진 플라스미드를 구축합니다.
  2. 발현 벡터의 50ng를 표준 프로토콜38에 따라 E. coli BL21-(DE3) 균주로 형질전환시킵니다.
  3. 형질전환된 세포를 각각 2L의 2YT 배지 육수를 포함하는 4개의 6L 플라스크에 37°C에서 170rpm으로 진수하여 0.8의 OD 600 또는 세포 번호 6.4 x 108 에 도달할 때까지 접종합니다.
  4. 0.5mM의 이소프로필-β-d-티오갈락토피라노사이드(IPTG)로 Taq 중합효소 발현을 유도하고 16°C에서 18시간 동안 진탕하여 추가로 배양합니다.
  5. 세포를 4°C, 7808 x g 에서 10분 동안 회전시켜 수확합니다. 얼음처럼 차가운 Taq 중합효소 용해 완충액(표 1) 200mL의 펠릿을 5mL/g의 세포 펠릿에 재현탁시킵니다.
  6. 라이소자임(2mg/mL의 용해 완충액)과 프로테아제 억제제로 세포를 45분 동안 배양한 다음 용해물을 30kPsi의 세포 교란기에 통과시키고 4°C에서 30분 동안 22,040 x g 의 원심분리기를 통해 세포 파편을 분리합니다.
  7. 상층액을 85°C에서 15분 동안 가열합니다. 4°C에서 1시간 동안 95,834 x g 에서 스핀 다운합니다. 상층액을 수집하고 0.45μm 필터를 사용하여 얼음에서 여과합니다.
  8. Taq 중합효소 완충액 A를 사용하여 4mL/분 유속으로 Ni-NTA HP 5mL 컬럼을 통해 시료를 먼저 통과시켜 고속 단백질 액체 크로마토그래피(FPLC)를 사용하여 단백질 정제를 수행합니다(표 2; 그림 1A).
  9. 10 컬럼 부피(CV)의 Taq 중합효소 완충액 A와 4%의 Taq 중합효소 완충액 B로 세척합니다(표 2). 100mL 병에서 20CV 이상의 Taq 중합효소 완충액 B를 사용하여 선형 그래디언트로 결합된 단백질을 용리합니다.
  10. Taq 중합효소 완충액 C를 사용하여 4mL/분에서 양이온 교환 5mL 컬럼을 통해 100mL 병의 용리액을 통과시킵니다(표 2; 그림 1A).
  11. 100% Taq 중합효소 완충액 C 및 5% Taq 중합효소 완충액 D 20CV로 세척합니다(표 2).
  12. Taq 중합효소 완충액 D(표 2)를 사용하여 5%에서 100%까지 선형 그래디언트로 용리합니다.
  13. 앞서 설명한 바와 같이 SDS-PAGE 겔 전기영동 39 후 겔 염색 40 을 수행하여 용출된 분획을 확인합니다. 간단히 말해서, 각 분획의 10 μL를 취하고 동일한 부피의 2x SDS 로딩 염료를 첨가합니다. 샘플을90oC에서 10분 동안 변성시킵니다. 샘플을 10% SDS-PAGE 겔에 로드하고 200V에서 25분 동안 겔을 실행합니다. Coomassie Brilliant Blue를 사용하여 겔을 염색한 다음 얼룩을 제거합니다.
  14. 정제된 Taq 중합효소를 함유한 모든 분획을 수집하고 4°C에서 taq 중합효소 저장 완충액(표 3)에 대해 투석합니다. 간단히 2L의 저장 버퍼를 준비하고 투석 카세트를 버퍼에 2분 동안 담가 수분을 공급합니다. 채취한 분획을 바늘을 사용하여 투석 카세트에 주입하고 교반기의 200rpm에서 투석 완충액에 밤새 그대로 둡니다.
  15. 투석 후 분광광도계를 사용하여 단백질 농도를 측정하고 10μL 부분 표본을 만들고 액체 질소에 스냅 얼린 후 -80°C에서 보관합니다.
    참고: FPLC 시스템에 로드하기 전에 0.45μm 필터를 사용하여 정제를 위해 모든 버퍼를 필터링합니다.

2. 곤충 세포 발현 시스템에서의 MMLV-RT 발현 및 정제

  1. Bacmid DNA 생성 및 분리
    1. 앞서 기술한 바와 같이 C-말단 절단 가능한 TEV-8xHis-Strep 태그로 MMLV-RT의 서열을 클로닝한다41.
    2. 발현 벡터 100ng을 50μL의 DH10Bac 세포에 혼합하고 튜브를 두드려 부드럽게 혼합합니다.
    3. 얼음 위에서 15분 동안 세포를 배양합니다. 42°C에서 1분 동안 셀에 열 충격을 가합니다.
    4. 즉시 얼음 위에 옮기고 400μL의 SOC 배지를 추가합니다. 37 °C에서 4 시간 동안 흔들어 배양합니다.
    5. 3 개의 항생제를 함유하는 LB 한천 플레이트에 혼합물 10 μL 및 15 μL를 플레이트하고; 50 μg/mL 카나마이신, 10 μg/mL 테트라사이클린, 7 μg/mL 겐타마이신, 40 μg/mL IPTG 및 100 μg/mL X-Gal 청백색 선택용.
    6. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 배양합니다. 여러 개의 흰색 군체와 하나의 파란색 군체를 대조군으로 선택하고 위의 항생제가 포함된 신선한 LB 한천 플레이트에 다시 줄무늬를 만듭니다. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다.
    7. 백색 표현형을 확인한 후 두 개의 콜로니를 선택하여 50mL 튜브에 50μg/mL 카나마이신, 10μg/mL 테트라사이클린, 7μg/mL 겐타마이신을 함유한 10mL의 LB 배지에 접종합니다.
    8. 37°C에서 배양액을 배양하고 170rpm에서 밤새 진탕합니다. 세포를 22,040 x g 에서 10분 동안 회전시켜 펠릿 아래로 떨어뜨립니다.
    9. 상층액을 디캔팅하고 미니프렙 키트에서 250μL의 재현탁액에 펠릿을 재현탁시킨 다음(이 용액은 제조업체의 지침에 따라 취급해야 함) 용액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
    10. 용해 용액 250μL를 넣고 부드럽게 혼합하여 3분 동안 배양합니다. 350μL의 중화 용액을 넣고 2x-3x를 뒤집고 22,040xg에서 10분 동안 원 심분리합니다.
    11. 상층액을 새 튜브로 옮기고 얼음처럼 차가운 이소프로판올을 동일한 부피로 넣고 -20°C에서 30분 동안 배양합니다.
    12. 침전된 DNA를 22,040 x g 에서 10분 동안 회전시켜 펠릿 아래로 펠릿화합니다. 상층액을 버리고 700 μL의 70 % 얼음처럼 차가운 에탄올로 펠릿을 2 배 세척합니다.
    13. 펠릿을 건드리지 않고 피펫으로 상층액을 제거합니다. 펠릿을 층류 후드에서 5-10분 동안 또는 튜브에 액체가 보이지 않을 때까지 공기 건조시킵니다. 펠릿을 100μL의 EB 완충액에 녹입니다.
  2. Bacmid transfection 및 바이러스 증폭
    1. P1 바이러스 준비
      1. 6웰 조직 배양 플레이트에서 곤충 세포 배양 배지 2mL에 ~ 9 x 105 세포/웰을 파종합니다.
      2. 세포가 부착될 수 있도록 실온에서 ~30분 동안 플레이트를 배양합니다.
      3. Bacmid/Fugene 혼합물을 다음과 같이 준비합니다: 하나의 튜브에 Bacmid DNA 1μg과 곤충 세포 배지 300μL를 혼합합니다. 다른 튜브에서 8μL의 transfection 시약과 300μL의 곤충 세포 배지를 혼합합니다. 두 혼합물을 부드러운 피펫팅으로 혼합하고 bacmid/transfection 시약 복합체가 형성될 때까지 실온에서 ~30분 동안 그대로 둡니다.
      4. bacmid 복합체 혼합물(~210μL)을 각 웰에 적가하고 투명 필름으로 플레이트를 밀봉합니다.
      5. 플레이트를 27°C에서 3-4일 동안 배양합니다.
      6. 바이러스가 포함된 배지를 가져다가 FBS(최종 농도 2%)를 추가하고 0.45μm 필터를 사용하여 여과한 다음 P1 바이러스 스톡으로 어두운 곳에서 4°C에서 보관합니다.
    2. P2 바이러스 전처리
      1. 배양 플라스크에서 2 x 106 cells/mL의 곤충 세포 50mL를 P1 바이러스 3mL와 함께 transfection합니다.
      2. 죽은 세포의 비율이 27%-6%에 도달할 때까지 100rpm에서 4-6일 동안 흔들면서 25°C에서 배양합니다.
      3. 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다.
      4. FBS를 최종 농도 2%로 첨가하고 0.45μm 필터와 분취액 각각 1mL를 여과하여 -80°C에서 P2 바이러스 스톡으로 보관합니다.
    3. P3 바이러스 준비
      1. 배양 플라스크에서 2 x 106 cells/mL의 곤충 세포 100mL를 P2 바이러스 2mL와 함께 transfection합니다.
      2. 죽은 세포의 비율이 15%-20%에 도달할 때까지 100rpm에서 3-4일 동안 흔들면서 27°C에서 배양합니다.
      3. 세포를 300 x g 에서 10분 동안 원심분리하고 바이러스가 포함된 상층액을 수집합니다.
      4. FBS를 최종 농도 2%로 추가합니다. 0.45μm 필터를 통해 필터링합니다. 4 °C의 어두운 곳에서 1개월 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 곤충 세포에서 MMLV-RT의 발현 및 정제
    1. 총 6개의 플라스크에 2 x 106 cells/mL(700mL/2L 플라스크) 밀도의 신선한 곤충 세포에 5mL의 P3 바이러스를 추가합니다.
    2. transfection 후 55-60시간 후에 7808 x g에서 10분 동안 회전하여 세포를 수확합니다.
    3. 세포 펠릿을 200mL의 MMLV-RT 용해 완충액에 재현탁시킵니다(표 4). 용해물을 15kPsi의 세포 교란기에 통과시키고 4°C에서 30분 동안 22,040 x g 의 원심분리기를 통과시킵니다.
    4. 상층액을 새 튜브로 옮기고 4°C에서 95,834 x g 에서 1시간 동안 다시 스핀 다운합니다. 상층액을 수집하고 0.45μm 필터를 사용하여 얼음에서 여과합니다.
    5. 먼저 MMLV-RT 버퍼 A를 사용하여 4mL/분 유속으로 Ni-NTA Excel 5mL 컬럼(그림 1B)을 통해 샘플을 통과시켜 FPLC를 사용하여 단백질 정제를 시작합니다(표 5).
    6. MMLV-RT 완충액 A의 10CV와 MMLV-RT 완충액 B의 4%로 컬럼을 세척하고(표 5) 100mL 병에서 MMLV-RT 완충액 B의 선형 그래디언트를 20CV 이상으로 단백질을 용리합니다.
    7. 용리된 샘플을 MMLV-RT 완충액 C와 평형화된 Strep 5mL 컬럼(그림 1B)(표 5)에 통과시킵니다.
    8. 100% MMLV-RT 완충액 C의 10CV로 컬럼을 세척하고 20CV의 완충액 D를 사용하여 선형 그래디언트로 단백질을 용리합니다(표 5).
    9. 1.13.-1.14 단계와 같이 SDS-PAGE를 수행하여 용출 된 분획을 확인하십시오. 4°C에서 MMLV-RT 저장 완충액(표 6)에 대해 투석할 정제된 MMLV-RT를 포함하는 분획을 수집합니다.
    10. Nanodrop, 부분 표본, 액체 질소에 스냅 동결을 사용하여 단백질 농도를 측정하고 -80 °C에서 보관합니다.
      참고: FPLC 시스템에 로드하기 전에 0.45μm 필터를 사용하여 정제를 위해 모든 버퍼를 필터링합니다.

3. 사내 멀티플렉스 R3T 원스텝 RT-qPCR 키트 구성품 준비

  1. 완충액 혼합물 준비
    1. 이전에37에 표시된 시약을 포함하는 RT-qPCR 반응을 위한 2x 완충액을 준비합니다. DNase/RNase-Free 물과 완충액 혼합물을 -20°C 냉동고에 보관하여 모든 시약을 준비합니다.
  2. 프라이머 및 프로브 세트 및 프라이머 혼합물 준비
    참고: 사용된 프로브와 프라이머는 표 7에 나와 있습니다. 인플루엔자 및 SARS-CoV-2 멀티플렉스 키트에는 3개의 프로브와 4개의 전방 및 역방향 프라이머 세트가 포함되어 있습니다. 프로브는 InfA의 경우 리포터 6-카르복시플루오레세인(FAM), SARS-CoV-2(N 유전자)의 경우 Texas Red-XN, InfB의 경우 Yakima Yellow를 사용하여 5′ 말단에 라벨링됩니다. MERS-CoV 및 SARS-CoV-2 멀티플렉스 키트에는 3개의 프로브와 3개의 정방향 및 역방향 프라이머 세트가 포함되어 있습니다. 프로브는 또한 MERS-CoV(ORF1a 유전자)에 대한 reporters Texas Red-XN, MERS-CoV(UpE 유전자)에 대한 VIC 및 6-carboxyfluorescein(FAM) SARS-CoV-2(N 유전자)를 사용하여 5′ 말단에 라벨링됩니다.
    1. 표 7에 나열된 모든 프라이머 및 프로브를 포함하는 프라이머 혼합물을 1.5mL 튜브에서 각 정방향 및 역방향 프라이머에 대해 6.7μM, 각 프로브에 대해 1.25μM의 최종 농도로 준비합니다. 프라이머 혼합물을 -20°C 냉동실에 보관합니다. 용리 버퍼를 사용하여 필요한 부피를 구성합니다.
  3. 효소 믹스 준비
    1. Taq 중합효소(30U/μL) 및 MMLV-RT(60ng/μL) 효소 혼합물을 표 3 과 같이 Taq 중합효소 저장 완충액에 준비하여 필요한 부피를 구성합니다. 얼음 위에서 이 단계를 수행하고 효소 혼합물을 -20°C에서 보관합니다.
  4. RNA 템플릿
    1. SARS-CoV-2, 인플루엔자 A H1N1, 인플루엔자 A H3N2, 인플루엔자 B 및 MERS-CoV의 합성 RNA를 1x Tris-EDTA 완충액(10mM Tri-Cl 및 1mM EDTA(pH 8.0) 100μL에 별도로 재현탁시켜 1 x 106 RNA copies/μL의 재고를 만듭니다.
    2. 다음 구성으로 RT-qPCR용 합성 RNA를 혼합합니다: 1) SARS-CoV-2, 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B의 각 바이러스 스톡 5μL를 50μL 부피에 추가하여 1 x 105 RNA 카피/μL를 만듭니다. 2) SARS-CoV-2, MERS-CoV는 50 μL 부피에 각 바이러스 스톡 5 μL를 첨가하여 1 x 105 RNA copies/μL를 만듭니다. 1 x 105 RNA copies/μL에서 10 RNA copies/μL 범위의 각 합성 RNA 혼합물을 10배 연속 희석합니다.
      알림: 얼음처럼 차가운 DNase/RNase-Free 물을 사용하여 템플릿의 연속 희석을 준비하십시오.

4. 사내 복합 SARS-CoV-2, 인플루엔자 A, 인플루엔자 B 및 SARS-CoV-2, MERS-CoV 원스텝 RT-qPCR 검사

참고: 워크스테이션 표면을 소독하고 96웰 플레이트 템플릿을 사용하여 PCR 플레이트 레이아웃을 계획합니다.

  1. 96웰 플레이트 준비
    1. 완충액과 프라이머 혼합물을 2배 해동합니다. 효소 혼합물을 얼음 위에 보관하십시오.
    2. 각 웰에 10μL의 2x 버퍼 혼합물, 1.5μL의 프라이머 혼합물, 1μL의 효소 혼합물, 6.5μL의 DNase/RNase-Free Water 및 테스트해야 하는 해당 RNA 혼합물 1μL를 추가합니다. 각 웰의 최종 부피는 20μL입니다. 이 단계에 대한 도움말은 준비된 레이아웃을 참조하십시오.
      참고: 피펫팅 편향을 피하기 위해 RNA 샘플을 제외한 모든 시약을 포함하는 반응 수를 기준으로 마스터 믹스를 만드는 것이 좋습니다. 또한 기술적 오류를 방지하기 위해 중복 또는 삼중 반응을 수행하십시오.
    3. 접착식 PCR 플레이트 씰로 플레이트를 밀봉하고 1분 동안 잠시 원심분리하여 플레이트 바닥에 있는 모든 액체를 수집합니다. 샘플을 qPCR 기계로 옮기기 전에 각 웰에 동일한 양의 액체가 있고 기포가 없는지 확인하십시오.
      참고: 모든 PCR 반응은 얼음 위에서 설정해야 합니다.
  2. PCR 프로그램
    1. Real-Time qPCR 머신 프로그램을 열고 다음 실험 속성을 선택합니다.
      블록 유형: 고속 96웰(0.1mL)
      실험 설정: 표준 곡선
      시약: TaqMan 시약
      실행 속성: 표준.
    2. 표 7에 제시된 바와 같이 모든 유전자 표적과 그 리포터 염료를 정의합니다. 또한 증폭 곡선을 보다 쉽게 분석할 수 있도록 테스트할 각 반응에 대한 샘플 이름을 정의합니다.
    3. 타겟과 샘플을 96웰 플레이트를 기반으로 프로그램의 플레이트 레이아웃에 할당합니다.
    4. PCR 기기에서 다음 주기 프로그램을 다음과 같이 설정합니다.
      55 °C에서 10분 동안
      40 사이클: 1분 동안 94°C
      94°C에서 10초
      68 °C에서 10초 동안
      20초 동안 68°C; 여기에서 형광을 얻습니다.
    5. 플레이트를 Real-Time qPCR 기계로 옮기고 플레이트의 올바른 방향을 보장하면서 홀더에 놓고 실행을 시작합니다.
    6. 실험 데이터를 저장할 파일 위치를 선택합니다.
  3. 데이터 분석
    1. 먼저 qPCR 프로그램에 의해 생성된 증폭 플롯을 검사하는 것이 중요합니다. 검출 한계를 분석하여 검출할 수 있는 최소 RNA 농도를 평가합니다.
    2. RNA 복제 수의 로그를 x축에 표시하고 해당 평균 Ct 값을 y축에 플로팅하여 분석의 민감도를 평가합니다. 기울기와 R2 는 반응의 신뢰성과 효율성을 나타냅니다.

결과

최근 몇 년 동안 PCR 접근법 21,22,23,24,25를 사용하여 일반적인 호흡기 바이러스를 검출하기 위한 진단 접근법이 크게 발전했습니다. 그러나 이러한 발전에도 불구하고 단일 테스트에서 여러 바이러스를 검출할 수 있는 다중화 접근 방식은 특히 RT-qPCR 플랫폼에서 널리 구현되?...

토론

SARS-CoV-2, 인플루엔자 A/B 및 MERS-CoV 변종과 같은 일반적인 호흡기 바이러스의 확산으로 인한 높은 감염률 및 사망률로 인해 전 세계 의료 시스템에 막대한 경제적 부담이 있습니다 12,19,20. 이러한 부담을 덜어주겠다는 책임감으로 우리는 RT-qPCR과 같은 빠르고 정확하며 접근 가능한 진단 분석법이 필요하다는 것을 깨달았습니다.?...

공개

저자는 경쟁하는 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 King Abdullah University of Science and Technology의 핵심 자금 지원과 NTGC(National Term Grand Challenge)를 통해 SMH에 지원되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.45 μm filter cupsThermo Scientific291-4545
10X Tris-Glycine SDS running bufferNovexLC2675
6-well tissue culturing platesCorning353046
Ammonium sulfateFisher ScientificA701-3
AmpicillinCorning61-238-RH
Cation exchange (HiTrap SP HP) 5 mLCytiva17-1152-01
D-(+)-Biotin, 98+%Thermo ScientificA14207.60
DH10Bac competent cellsFisher Scientific10361012
Dialysis bag (Snakeskin 10,000 MWC)Thermo Scientific68100
Dithiothreitol (DTT)Thermo ScientificR0862
Dnase/Rnase Free Distilled WaterAmbionAM9930
dNTPsThermo ScientificR0192
E. coli BL21(DE3) competent cellsInvitrogenC600003
EDTAFisher ScientificBP120-1
Elution BufferQiagen19086
ESF 921 insect cell culture medium (Insect cells media)Expression Systems96-001-01
FBS SolutionGibcoA38400-01
Fugene (transfection reagent)PromegaE2311
GentamicinFisher Scientific15750060
GlycerolSigma AldrichG5516-500
IGEPAL CA-630Sigma AldrichI8896-100ml
ImidazoleSigma Aldrich56750-1Kg
Influenza A (H1N1) synthetic RNATwist Bioscience103001
Influenza A (H3N2)  synthetic RNATwist Bioscience103002
Influenza B synthetic RNATwist Bioscience103003
IPTGGold BiotechnologyI3481C100
KanamycinGibco11815-032
LB AgarFisher ScientificBP1425-500
LB Broth mediaFisher ScientificBP1426-500
LysozymeSigma AldrichL6876-10G
Magnesium ChlorideSigma Aldrich13152-1Kg
MERS-CoV synthetic RNATwist Bioscience103015
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction plates with Barcode (0.1 mL)Applied Biosystems10310855
Mini- PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad456-1093
Miniprep kitQiagen27106
Ni-NTA Excel (HisTrap Excel) 5 mLCytiva17-3712-06
Ni-NTA HP (HisTrap HP) 5 mLCytiva17-5248-02
Optical Adhesice Covers (PCR Compatible,DNA/Rnase/PCR Inhibitors FreeApplied Biosystems4311971
Potassium ChlorideFisher BioreagentsBP366-1
Primers and ProbesIntegrated DNA Technologies, Inc.
Protease Inhibitor Mini tablets EDTA-FreeThermo ScientificA32955
Protein markerFermentas26616
RT-qPCR machine (QuantStudio 7 Flex)Applied Biosystems
S.O.C mediumFisher Scientific15544034
SARS-CoV-+A2:C442 synthetic RNATwist Bioscience102024
Sf9 insect cellsGibcoA35243
Sodium ChlorideSigma AldrichS3014-1Kg
StrepTrap XT 5 mLCytiva29401323
TetracyclineIBI ScientificIB02200
Tris Base Molecular Biology GradePromegaH5135
Tris-HClAffymetrix22676
Tween 20Sigma AldrichP1379-100ml
X-GalInvitrogenB1690

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