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요약

이 논문에서는 렌티바이러스 벡터를 사용하여 공막의 과발현과 2D 바이오리액터를 통한 단축 스트레칭이 결합된 iPSC 유래 중간엽 기질 세포를 생성하여 iTenocyte를 생성하는 절차에 대해 설명합니다.

초록

힘줄과 인대 복구에 대한 오늘날의 과제는 힘줄 재생을 촉진하기 위한 세포 기반 치료에 적합하고 효과적인 후보를 식별해야 합니다. 중간엽 기질 세포(MSC)는 힘줄 복구를 위한 잠재적인 조직 공학 전략으로 연구되어 왔습니다. 그들은 다능하고 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있지만 자체 재생 능력이 제한되어 있으며 표현형 이질성을 나타냅니다. 유도만능줄기세포(iPSC)는 높은 자가 재생 능력과 탁월한 발달 가소성으로 인해 이러한 한계를 우회할 수 있습니다. 건세포 발달에서 공막(Scx)은 힘줄 분화의 중요한 직접 분자 조절자입니다. 또한 기계 조절은 배아 힘줄의 발달과 치유를 이끄는 핵심 요소인 것으로 나타났습니다. 따라서 우리는 힘줄 생성에 필수적일 수 있는 생물학적 및 기계적 자극의 시너지 효과를 캡슐화하는 프로토콜을 개발했습니다. iPSC는 중간엽 기질 세포(iMSC)가 되도록 유도되었으며 유세포 분석을 통해 고전적인 중간엽 기질 세포 마커로 특성화되었습니다. 다음으로, 렌티바이러스 벡터를 사용하여 iMSC를 안정적으로 과발현하도록 형질주입했습니다(iMSCSCX+). 이러한 iMSCSCX+ 세포는 2D 바이오리액터를 사용하여 단축 인장 하중을 통해 iTenocyte로 더 성숙할 수 있습니다. 결과 세포는 초기 및 후기 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰하는 것이 특징이었습니다. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 잠재적으로 무제한의 기성품 동종 세포 소스를 개발하는 연구원을 지원하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

힘줄과 인대 복구의 현대 문제를 해결하기 위해서는 세포 기반 치료에 적합한 적절한 세포 후보가 필요합니다. 힘줄 복구를 위한 조직 공학의 한 가지 연구 방법은 골수 유래 중간엽 기질 세포(BM-MSC) 및 지방 조직 유래 기질 세포(ASC)를 잠재적 전략으로 탐색하는 것입니다. 이 세포는 다능 능력, 매우 풍부하며 생체 내에서 재생 잠재력을 가지고 있습니다. 또한 동물 모델에서 향상된 치유 능력과 향상된 기능적 결과를 보여주었습니다1. 그럼에도 불구하고 이러한 세포는 제한된 자가 재생 능력, 표현형 다양성, 특히 힘줄 형성 능력이 제한되어 있습니다. 유도만능줄기세포(iPSC) 기술은 뛰어난 자가 재생 능력과 타의 추종을 불허하는 발달 적응성으로 인해 이러한 제약에 대한 솔루션을 제공합니다. 우리 연구팀과 다른 연구팀은 iPSC를 중간엽 기질 세포 유사 개체(iMSC)로 성공적으로 분화시켰습니다2,3. 따라서 iMSC는 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 동종 공급원이 될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

공막(SCX)은 힘줄 발달에 필수적인 전사 인자이며 분화된 건세포에 대해 가장 먼저 검출할 수 있는 마커로 간주됩니다. 또한 SCX는 유형 1a1 사슬 콜라겐 1(COL1a1), 모호크(MKX) 및 테노모듈린(TNMD)을 포함한 다운스트림 힘줄 분화 마커를 활성화합니다 4,5,6. 힘줄 성숙 중에 발현되는 다른 유전자로는 튜불린 중합 촉진 단백질 패밀리 멤버 3(TPPP3) 및 혈소판 유래 성장 인자 수용체 알파(PDGFRa)7가 있습니다. 이러한 유전자는 힘줄의 발달과 성숙에 필수적이지만, 불행히도 힘줄 조직에만 국한된 것은 아니며 뼈나 연골과 같은 다른 근골격계 조직에서 발현됩니다 5,7.

힘줄 발달 중 마커의 발현 외에도 기계 자극은 배아 힘줄 발달 및 치유에 필수적인 요소입니다 4,5,6. 힘줄은 기계적으로 반응하며 성장 패턴은 환경에 따라 변화합니다. 분자 수준에서, 생체역학적 단서는 건세포의 발달, 성숙, 유지 및 치유 반응에 영향을 미친다8. 다양한 바이오리액터 시스템이 생리학적 부하와 생체역학적 단서를 모델링하는 데 활용되었습니다. 이러한 모델 시스템 중 일부에는 생체 외 조직 로딩, 이축 또는 단축 장력을 적용하는 2D 세포 로딩 시스템, 스캐폴드 및 하이드로겔을 사용하는 3D 시스템이 포함됩니다 9,10. 2D 시스템은 힘줄 특이적 유전자 또는 세포 운명의 맥락에서 세포의 형태에 대한 기계적 자극의 효과를 연구할 때 유리한 반면, 3D 시스템은 세포-ECM 상호 작용을 보다 정확하게 복제할 수 있습니다 9,10.

2D 로딩 시스템에서는 세포와 배양 기질 사이의 변형률이 균일하며, 이는 세포의 세포골격에 가해지는 하중을 완전히 제어할 수 있음을 의미합니다. 이축 로딩(bi-axial loading)과 비교하여, 일축 로딩(uniaxial loading)은 생리학적으로 더 관련성이 높은데, 이는 텐노사이트(tenocyte)가 생체 내 콜라겐 다발(collagen bundle)로부터 일축 로딩(uniaxial loading)을 주로 받기 때문이다 9. 일상 활동 중에 힘줄은 최대 6%의 변형률(11)까지 단축 인장 하중을 받는 것으로 나타났다. 특히, 이전 연구에서는 4%-5%의 생리학적 범위 내에서 로딩이 SCX 및 TNMD와 같은 힘줄 관련 마커 발현을 보존하고 콜라겐 생산을 증가시켜 테노겐 분화를 촉진하는 것으로 나타났습니다 9,10. 10% 이상의 균주는 외상적으로는 관련이 있지만 생리적으로는 관련이 없을 수 있다12,13.

여기에서는 건세포 생성에 필수적일 수 있는 기계적 및 생물학적 자극의 시너지 효과를 고려한 프로토콜이 제시됩니다. 먼저 유세포 분석을 사용하여 MSC 표면 마커로 확인된 배아체를 성장 인자에 단기간 노출 시켜 iPSC를 iMSC로 유도하는 재현 가능한 방법을 설명합니다. 그런 다음 SCX(iMSCSCX+)의 안정적인 과발현을 갖도록 iMSC를 엔지니어링하는 렌티바이러스 형질도입 방법을 자세히 설명합니다. 추가 세포 성숙을 위해 iMSCSCX+ 는 피브로넥틴 코팅 실리콘 플레이트에 파종되고 CellScale MCFX 바이오리액터를 사용하여 최적화된 단축 장력 프로토콜을 거칩니다. tenogenic 잠재력은 이른 힘줄 마커와 늦은 힘줄 마커의 상향 조절과 콜라겐 침착을 관찰함으로써 확인되었다14. 이 iTenocytes 생성 방법은 힘줄 세포 치료 응용 분야를 위한 무제한 기성품 동종 소스를 제공할 수 있는 개념 증명입니다.

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프로토콜

iTenocyte를 생산하기 위한 이 프로토콜은 iPSC에서 iMSCs(10일), iMSC에서 iMSCSCX+ (2주), iMSCSCX+ 에서 iTenocytes(최소 4일)의 세 가지 주요 단계로 수행할 수 있습니다. 프로토콜의 각 주요 단계는 실험 일정에 따라 일시 중지했다가 나중에 다시 시작할 수 있습니다. 세포 배양과 관련된 방법의 경우 멸균 기술을 사용해야 합니다. 이 프로토콜의 모든 세포는 37°C, 5% CO2 및 95% 습도에서 성장해야 합니다.

1. 유도 중간엽 기질 세포(iMSC)로의 인간 iPSC 유도

  1. 실험 준비
    1. Iscove의 Modified Dulbecco's Medium - Embryoid Bodies(IMDM-EB) 배지를 준비합니다.
      1. 8.5mL의 녹아웃 혈청 치환, 500μL의 MEM(Minimal Essential Medium) 비필수 아미노산, 0.385μL(110mM 스톡) 베타-메르캅토에탄올 및 500μL 항생제-항진균제(AAS)로 IMDM 기저 배지 50mL를 보충합니다(최종 농도: 각각 17%, 1%, 110μM, 1%)( 재료 표 참조).
    2. 중간엽 기질 세포(MSC) 배지를 준비합니다.
      1. 저포도당 440mL의 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 소 태아 혈청(FBS) 50mL, 항생제-항진균액(AAS) 5mL, L-글루타민 5mL(최종 농도: 각각 10%, 1%, 2mM)를 보충합니다.
    3. 폴리(2-하이드록시에틸 메타크릴레이트)(폴리-HEMA) 코팅판을 준비합니다.
      1. 폴리-HEMA( 재료 표 참조) 10g을 멸균 병에 넣습니다.
      2. 병에 자석 교반기를 넣고 저으면서 500mL 95% EtOH를 천천히 추가합니다.
      3. 모든 EtOH가 추가되면 최소 1200시간 동안 추가로 낮은 열을 가하면서 교반 모드를 6rpm으로 켭니다. poly-HEMA 용액은 실온에서 최대 1년 동안 보관할 수 있습니다.
      4. 멸균 조건에서 T75 플라스크에 2.5μg/cm2 in 9 mL를 추가합니다. 배양 용기의 크기에 따라 부피를 조절하십시오.
      5. 멸균 상태를 유지하면서 사용하기 전에 EtOH가 완전히 증발할 수 있도록 용기를 공기 중에서 건조시킵니다. 일반적으로 24-72시간이 소요됩니다.
    4. 젤라틴 코팅 플라스크를 준비합니다.
      1. NaOH로 유리병을 씻고 젤라틴 준비에 바칩니다. 세제를 사용하지 마십시오.
      2. 1% 젤라틴 용액(젤라틴 5g과 내독소가 없는 물 500mL)을 준비합니다. 유리병을 젤라틴 용액으로 30분 동안 고압멸균합니다.
      3. 젤라틴 용액을 식히면 실온에서 보관할 수 있습니다.
      4. T75 플라스크 1개에 플라스크당 5mL의 젤라틴 용액을 코팅하고 세포를 파종하기 전에 최소 1시간 동안 배양합니다. 젤라틴 코팅 플라스크는 1일 전에 준비할 수 있습니다.
    5. 형광 활성화 세포 분류(FACS) 완충액을 준비합니다.
      1. PBS를 2% 소 혈청 알부민 및 0.1% 아지드화나트륨과 혼합합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 배아체(EB)의 생성
    참고: iPSC는 6웰 플레이트에서 배양해야 하며 사용 전에 70%-80% 밀도에 도달해야 합니다.
    1. 0일째에 384 투명 바닥 PCR 플레이트를 조직 배양 후드에 넣고 뚜껑 없이 15분 동안 UV를 제공합니다.
    2. iPSC에서 성장 배지를 제거하고( 재료 표 참조) PBS로 웰을 세척합니다.
    3. 0.5mL의 예열된 부드러운 세포 해리 시약( 재료 표 참조)을 각 웰에 추가하고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. iPSC가 단일 세포 또는 현탁액으로 들어 올려진 작은 응집체가 될 때까지 5분마다 세포를 관찰합니다.
    4. 단일 세포 현탁액을 보장하기 위해 1mL 피펫으로 세포 현탁액을 재현탁시켰습니다.
    5. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
    6. 상층액을 제거하고 IMDM-EB 배지에 재현탁하고(1.1.1단계) 혈구계 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
    7. 웰당 25μL의 셀 현탁액으로 384웰 플레이트의 웰당 5,000-25,000개의 셀을 달성하는 데 필요한 적절한 셀 현탁액을 계산합니다.
      알림: 일반적으로 2웰 플레이트의 70-3-6 합류점(80%-6%) 웰은 하나의 384웰 플레이트에서 EB를 만들 수 있습니다. EB당 세포의 크기는 경험적으로 결정됩니다. 전체 384웰 플레이트의 경우 9.6mL의 셀 현탁액을 사용해야 하며, 웰당 25μL를 사용해야 합니다.
    8. 실온에서 300 x g 에서 5분 동안 세포를 다시 원심분리합니다.
    9. 상층액을 제거하고 미리 냉각된 15mL 코니컬 튜브에 적절한 부피의 IMDM-EB 배지와 10μM의 Y-27632 디하이드로클로라이드(스톡: 10mM, 1000x, 재료 표 참조)에 세포를 재현탁시킵니다.
    10. 원뿔형에 저온 용해성 기저막 매트릭스(384웰 플레이트 분량의 EB당 1mg)를 추가합니다( 재료 표 참조).
    11. 셀 현탁액 25μL를 각 웰에 분배합니다. 멸균 뚜껑을 플레이트에 놓고 450 x g , 4°C에서 7분 동안 회전합니다. 37 °C에서 48 시간 동안 배양합니다.
    12. 2일째에 3mL의 예열된 IMDM-EB 배지가 있는 100mm 플레이트로 세포를 옮깁니다.
    13. EB를 10mL의 IMDM-EB가 있는 전용 poly-HEMA 코팅 T75 플라스크로 옮깁니다. 배양 용기의 크기에 따라 부피를 조절하십시오. EB가 3일 동안 증가하도록 허용합니다.
    14. 5일째에 EB를 10mL의 IMDM-EB 배지와 함께 준비된 젤라틴 코팅 T75 플라스크로 옮깁니다. 배양 용기의 크기에 따라 부피를 조절하십시오. 일시 중단된 상태에서 3일 더 EB를 성장시킵니다.
    15. 8일째 되는 날에는 플라스크에 부착된 EB와 부착되지 않은 EB의 두 가지 유형의 EB가 관찰되는지 확인합니다. PBS로 플라스크에서 부착되지 않은 EB를 씻어냅니다.
    16. 부착된 EB에 TGFβ-1(10ng/mL)이 보충된 IMDM-EB 배지를 추가하고( 재료 표 참조) 2일 동안 성장시킵니다.
    17. 10일째에 배지를 MSC 배지로 변경합니다. 세포는 일주일에 두 번 먹여야 합니다. 70%가 합류하면 "표준 리프팅 셀 프로토콜"로 진행하여 세포를 다시 도금합니다. 젤라틴 코팅된 플레이트에 세포를 다시 플레이트합니다.
  3. 표준 리프팅 셀 프로토콜
    1. 부착 세포가 70% 합류에 도달하면 플레이트에서 성장 배지를 흡인하고 PBS로 세척합니다.
    2. 각 150mm 플레이트에 예열된 0.25% 트립신 5mL를 첨가하여 세포를 들어 올리고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 배양 용기의 크기에 따라 트립신 부피를 조정합니다.
    3. 현미경으로 대부분의 세포가 각 플레이트에서 들어 올려졌는지 확인합니다. 여전히 셀이 부착되어 있는 경우 플레이트의 측면을 가볍게 두드려 셀을 제거합니다.
    4. 예열된 성장 배지의 부피를 두 배로 추가하여 세포를 원뿔형 튜브에 수집합니다.
    5. 세포를 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고 다음 단계로 진행합니다.
  4. MSC 마커 발현을 위한 유세포 분석 평가
    참고: 골수 MSC와 같은 인간 MSC는 양성 대조군으로 사용해야 합니다.
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"(1.3단계)을 수행합니다.
    2. 3mL의 FACS 완충액으로 상층액을 재현탁하고 전체 부피를 FACS 튜브로 옮깁니다.
    3. 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. FACS 버퍼로 세척 단계를 두 번 더 반복합니다.
    4. 염색된 튜브에 2μL의 마우스 항인간 CD90-FITC, 마우스 항인간 CD44-APC 및 항인간 CD105-PE( 재료 표 참조)를 추가하고 4°C에서 45분 동안 배양합니다.
    5. 아이소타입 대조 튜브에 20μL의 마우스 IgG2a-FITC, 마우스 IgG1-PB 및 마우스 IgG1-PE를 추가합니다( 재료 표 참조).
    6. 어두운 곳에서 4°C에서 15분 동안 배양합니다. FACS 완충액 3mL를 추가하고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리하여 모든 튜브를 세척합니다. 각 튜브에 대해 250μL의 FACS 버퍼에 세포를 재현탁시킵니다.
    7. 유세포 분석14를 사용하여 MSC 표면 마커의 발현을 분석합니다. 여기 및 방출 파장은 CD90-FITC, 495nm에서 여기 피크 및 519nm에서 방출 피크여야 합니다. CD44-APC, 640에서 여기 피크 및 660nm에서 방출 피크; CD105-PE, 561nm에서 여기 피크 및 574nm에서 방출 피크.

2. iMSC 통과 및 확장

  1. 시약 준비
    1. MSC 동결 매체를 준비합니다.
      1. 저포도당 DMEM 30mL, DMSO 5mL, FBS 15mL를 혼합합니다(최종 농도: 각각 60%, 10%, 30%).
      2. 멸균 0.45μm 필터를 사용하여 용액을 여과합니다. 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 통과
    참고: 유도 후 iMSC는 플라스틱 조직 배양 플레이트에서 성장하기 위해 젖을 떼기 전에 젤라틴 코팅 플레이트에서 추가로 2개의 통로를 위해 성장해야 합니다. 또한 세포는 70%가 합류할 때 1:3 분할 비율로 통과해야 합니다.
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"(1.3단계)을 수행합니다.
    2. MSC 배지에 세포를 재현탁시키고 플라스크당 20mL의 배지가 있는 T175 플라스크의 새로운 150mm 플레이트 3개에 세포를 균등하게 분배합니다. 세포를 37°C로 되돌립니다.
    3. 일주일에 두 번 성장 배지를 미리 예열된 MSC 배지로 교체하여 세포에 공급합니다.
  3. 결빙
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
    2. 세포를 1mL의 MSC 동결 배지에 재현탁시킵니다. 1mL의 세포 현탁액을 극저온 저장고에 넣고 -80°C에서 24시간 동안 냉동 용기에 보관한 후 장기 보관을 위해 액체 질소로 옮깁니다.
  4. 녹고
    1. 15mL 코니컬 튜브에 10mL의 예열된 MSC 배지를 준비합니다.
    2. 냉동 공기를 꺼내 37°C 수조에 담그고 완두콩 크기의 얼음 공이 남을 때까지 휘젓습니다(약 1-2분).
    3. 세포 배양 후드에서 예열된 배지 1mL를 cryovial 및 피펫에 위아래로 천천히 추가하여 혼합합니다.
    4. 세포 현탁액을 cryovial에서 사전 예열된 배지를 사용하여 준비된 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리합니다.
    5. 상층액을 제거하고 새 배지로 재현탁합니다. 총 부피가 20mL인 150mm 플레이트에 셀 현탁액을 추가합니다. 배양 플라스크의 크기에 따라 부피를 조절하십시오.
    6. 세포가 분리될 준비가 될 때까지 37°C에서 배양합니다.

3. 렌티바이러스 형질도입을 이용한 SCX를 과발현하기 위한 iMSC의 유전공학

참고: 프로토콜의 이 섹션을 완료하는 데 2주가 걸립니다.

  1. 배지 및 시약의 준비
    1. HEK293T/17 세포 배지를 준비합니다.
      1. Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM) 445mL에 FBS 50mL 및 AAS 5mL를 보충합니다(최종 농도: 각각 10%, 1%).
    2. MSC 렌티 패킹 배지를 준비합니다.
      1. 60°C 수조에서 30분 동안 실온 FBS 50mL를 가열하여 열 비활성화 혈청을 준비합니다.
      2. 445mL의 저포도당 DMEM을 열 비활성화 FBS 및 5mL의 L-글루타민과 결합합니다(최종 농도: 각각 10%, 2mM).
    3. transfection complex를 준비합니다.
      1. transfection 복합 성분(재료 표 참조)을 얼음 위에서 해동할 수 있습니다: 패키징 플라스미드 VSV-G 및 Delta, SCX 플라스미드 및 BioT15,16.
      2. 플라스미드를 부드럽게 소용돌이치고 회전시킵니다. DNA 농도를 측정합니다.
      3. DNA 농도와 transfection을 위한 플라스크의 수에 기초하여 필요한 각 성분의 부피를 계산합니다: 하나의 T75 플라스크에 대해 transfection 복합체는 750 μL 무혈청 배지(예: 무혈청 DMEM 또는 PBS), 7.5 μg SCX 플라스미드, 0.75 μg VSV-G 플라스미드, 6.75 μg Delta 플라스미드 및 22.5 μL BioT로 구성됩니다. 피펫팅 오류에 대한 추가 고려 사항.
      4. 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 원심분리기에서 잠시 돌립니다. 실온에서 15분 동안 배양한 후 즉시 사용하십시오.
  2. 형질주입 및 렌티바이러스 생산
    주의: 3일째부터, 프로토콜은 렌티바이러스에 대한 작업을 수반하며, 따라서 격리 등급 2+ 작전 절차에 따라 작업을 수행해야 한다. 작업자는 장갑 2겹, 손목 덮개, 보안경, 마스크, 긴 바지 및 앞이 막힌 신발을 포함한 개인 보호 장비를 착용해야 합니다. 피펫 팁, 플라스크 및 액체 배지를 포함한 모든 폐기물과 재료는 표백제(최종 1% 차아염소산나트륨)로 최소 20분 동안 오염을 제거해야 합니다. 진공 청소기를 사용하지 마십시오.
    1. HEK293T/17 세포를 파종합니다.
      1. transfection(0일) 약 18-24시간 전에 293T 세포를 들어 올려 T75 플라스크에 도금합니다. 다음 볼륨은 T75를 배양 용기로 가정합니다. 사용하는 세포 배양 용기에 따라 부피를 조절하십시오.
      2. 플라스크에서 배양 배지를 제거하고 5mL의 PBS로 세척합니다.
        알림: 셀은 플라스크 표면에서 매우 쉽게 들어 올려집니다. 플라스크 측면에 PBS를 추가하고 셀에 용액을 직접 추가하지 마십시오.
      3. 각 플라스크에 예열된 0.25% 트립신 3mL를 넣고 37°C에서 5분 동안 배양합니다. 세포를 원뿔형 튜브에 모으고 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
      4. 상층액을 제거하고, 293T 배지에 재현탁하고, 혈구계 또는 세포 계수기를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
      5. 세포를 5.3 x 104 cells/cm2 로 플레이트하고 37°C에서 밤새 배양합니다.
      6. 다음날(1일차), transfection complex를 준비합니다. 세포의 성장 배지를 5mL의 예열된 MSC 렌즈 포장 배지로 교체합니다(단계 3.1.2).
      7. transfection complex를 세포에 적적식으로 추가합니다. transfection 복합체가 세포에 균일하게 노출되도록 접시를 부드럽게 기울입니다. 세포를 인큐베이터로 48시간 동안 되돌립니다.
        알림: 독성은 24시간(2일) 후에 관찰해야 합니다.
      8. 48시간(3일) 후 피펫을 사용하여 바이러스 함유 배지를 별도의 원뿔형 튜브에 조심스럽게 수집하고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리합니다.
      9. 293T 세포의 T75 플라스크에 5mL의 사전 예열된 MSC 렌티 패키징 배지를 추가하고 밤새 인큐베이터로 돌아갑니다.
      10. 원심분리 후 필터를 통해 상층액을 직접 피펫팅하여 0.45μm 제균 필터로 상층액을 여과합니다. 바이러스 함유 배지를 4°C에서 밤새 보관합니다.
      11. 또 다른 24시간(4일) 후 피펫을 사용하여 바이러스 함유 배지를 별도의 원뿔형 튜브에 다시 한 번 조심스럽게 수집하고 300 x g (실온)에서 5분 동안 원심분리합니다.
      12. 바이러스를 이전 채취일 바이러스와 결합하고 혼합하여 균질한 용액을 보장합니다. 이 시점에서 프로토콜은 실험 일정에 따라 일시 중지되고 나중에 다시 시작될 수 있습니다. 렌티바이러스를 분주하여 -80°C에서 동결시키거나, "SCX를 이용한 iMSC의 형질도입"(3.3단계)을 진행하면서 렌티바이러스를 얼음 위에 보관할 수 있습니다.
        참고: 렌티바이러스 부분 표본을 냉동 및 해동한 후에는 다시 얼리지 마십시오.
  3. SCX를 사용한 iMSC의 형질도입
    1. 역가 플레이트 transduction을 수행합니다.
      1. 0일째에 "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
      2. MSC 배지에서 세포를 재현탁시키고 혈구분석기 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
      3. 6웰 플레이트에 4 x 103 cells/cm2를 추가합니다. 나머지는 20mL의 MSC 배지가 있는 추가 150mm 플레이트에 다시 플레이트합니다(이것이 컨트롤 플레이트가 됨). 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
      4. 다음 날(1일차)에 세포는 ~40% 합류해야 합니다. 렌티 포장 성장 배지를 예열하고 폴리브렌과 약 3mL의 렌티바이러스를 얼음 위에서 해동합니다(또는 바이러스 채취 당일에 해동한 경우 사용할 때까지 얼음 위에 보관).
      5. 원하는 역가(즉, 12.5%, 25%, 50%, 75%, 100%)에 따라 렌티 포장 성장 배지와 렌티바이러스를 웰에 추가합니다. 0.5μL의 폴리브렌을 첨가하여 5μg/mL의 최종 농도를 얻습니다(스톡 농도: 10mg/mL, 재료 표 참조).
      6. 모든 세포에 균일하게 노출되도록 플레이트를 빙빙 돌립니다. 플레이트를 37°C에서 48시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.
    2. 유세포 분석을 통해 SCX 렌티바이러스 역가 효율을 평가합니다.
      1. 48시간 후 "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
      2. PBS에서 세포를 재현탁시키고 혈구계 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다. 세포를 실온에서 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
      3. 상층액을 제거하고 3mL의 FACS 완충액에 재현탁하여 세척합니다. 세포 현탁액을 유세포 분석 튜브로 옮기고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
      4. FACS 완충액을 2회 더 세척하고 최종 세포 펠릿을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁시킵니다. 유세포 분석 기계를 사용하여 각 역가에 대한 GFP의 발현을 평가합니다.
      5. 역가와 세포 생존율 계수에 따라 형질도입을 진행하기에 적합한 렌티바이러스 역가를 결정합니다. 이 시점에서 프로토콜은 실험 일정에 따라 일시 중지되고 나중에 다시 시작될 수 있습니다.
    3. 대규모 SCX 변환을 수행합니다.
      알림: 나열된 부피는 1x 150mm 플레이트 또는 1x T175 플라스크당 것입니다. 이는 원하는 혈관 크기 및 형질도입 규모에 따라 적절하게 조정될 수 있습니다.
      1. 0일째에 "표준 리프팅 셀 프로토콜"을 수행합니다.
      2. MSC 배지에서 세포를 재현탁시키고 혈구분석기 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다. 세포를 4 x 103 cells/cm2로 파종합니다. 37°C에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
      3. 다음 날(1일차)에 세포는 ~40% 합류해야 합니다. 렌티 포장 성장 배지를 예열하고 폴리브렌과 미리 계산된 양의 렌티바이러스를 얼음 위에서 해동합니다.
      4. 결정된 역가에 따라 원하는 양의 렌티 포장 성장 배지와 렌티바이러스를 웰에 추가합니다. 5μg/mL의 폴리브렌을 추가합니다(원액 농도: 10mg/mL).
      5. 3일째에는 형광 현미경으로 세포를 관찰합니다. 새로 생산된 iMSCSCX+ 는 GFP를 형광으로 발해야 합니다. 바이러스 함유 배지를 사전 준비된 MSC 배지로 교체합니다. 이 시점에서 프로토콜은 실험 일정에 따라 일시 중지되고 나중에 다시 시작될 수 있습니다.

4. iMSCSCX+ 패세이징 및 확장

  1. 프로토콜의 2단계에 설명된 대로 iMSC와 동일하게 iMSCSCX+ 의 패싱, 확장, 동결 및 해동을 수행합니다.

5. 기계적 하중

참고: 이 섹션은 최소 4일이 소요되지만 세포 수축이 관찰되는지 여부에 따라 더 길어질 수 있습니다.

  1. 실험 준비
    1. 실리콘 플레이트를 준비합니다.
      1. 2개의 실리콘 플레이트를 오토클레이브합니다( 재료 표 참조). 후, 멸균 조건에서 오토클레이브 백에서 실리콘 플레이트를 제거하고 150mm 플레이트에 넣습니다.
      2. 15mL 코니컬 튜브에 130μL의 피브로넥틴(100x, 재료 표 참조)과 13mL의 멸균 PBS를 결합합니다. 튜브를 여러 번 뒤집어 섞습니다.
      3. 400μL의 피브로넥틴 용액을 실리콘 플레이트의 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 37°C에서 최소 2시간 또는 하룻밤 동안 배양합니다.
      4. 사용하기 전에 피브로넥틴 용액을 흡인하고 플레이트를 세포 배양 후드에서 최소 30분 동안 자연 건조시켜 피브로넥틴 용액이 완전히 증발하도록 합니다.
        참고: 피브로넥틴 용액은 웰에서 미리 제거할 수 있으며, 현재 코팅된 플레이트는 사용할 때까지 최대 2주 동안 37°C에 둘 수 있습니다.
    2. MSC 스트레치 미디어를 준비합니다.
      1. 15mL 코니컬 튜브에 140μL의 아스코르브산(스톡: 100x, 최종 농도: 50μg/mL)을 14mL의 예열된 MSC 배지에 첨가하여 MSC 스트레치 배지를 준비합니다.
        참고: 아스코르브산은 모든 배지 교체 전에 MSC 여과지에 신선하게 첨가해야 합니다.
  2. 실리콘 플레이트에 iMSCSCX+ 파종
    1. "표준 리프팅 셀 프로토콜"(1.3단계)을 수행합니다.
    2. MSC 배지에서 세포를 재현탁시키고 혈구분석기 또는 세포 카운터를 사용하여 생존 가능한 세포를 계수합니다.
    3. 1.25 x 104 cells/cm 2를 얻는 데 필요한 셀 현탁액의 부피를 계산합니다.
    4. 15mL 코니컬 튜브에서 이 부피의 MSC 스트레치 배지를 제거합니다. 대상 셀을 추가합니다. 새로운 세포 현탁액을 균질하게 반전시킵니다.
    5. 400μL의 새 셀 현탁액을 두 실리콘 플레이트의 모든 웰에 추가합니다.
    6. 150mm 플레이트에 뚜껑을 다시 덮고 37°C에서 24시간 동안 인큐베이터로 되돌립니다.
  3. 단축 장력
    1. 다음날 스트레칭 장치( 재료 표 참조)를 ddH2O와 70% 에탄올로 헹굽니다. 기기를 닦고 세포 배양 후드에 넣고 15분 동안 UV를 씌웁니다.
    2. 파종된 플레이트를 회수하고 웰에 세포가 잘 부착되어 있는지 확인합니다.
    3. 인큐베이터(정적 제어)에 한 플레이트를 남겨두고 나사를 실리콘 플레이트의 구멍에 맞춰 두 번째 시드된 실리콘 플레이트를 스트레칭 장치에 넣습니다. 멸균을 보장하기 위해 장치의 뚜껑을 교체하십시오.
    4. 씨를 뿌린 실리콘 플레이트가 있는 장치를 전자 소스( 재료 표 참조)에 부착하고 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
    5. 프로그램에서 순환 스트레칭 프로토콜을 4% 정현파 변형률, 0.5Hz, 하루 2시간 으로 설정합니다. 시작 버튼을 한 번 눌러 스트레칭을 시작합니다. 스트레칭은 즉시 시작해야 합니다.
    6. 최소 3일 동안 세포를 늘립니다. 매일 세포를 모니터링하고 세포 수축이 관찰될 수 있는 경우 스트레칭 프로토콜을 중지합니다. 이틀에 한 번씩 새로운 MSC 스트레치 미디어로 교체하십시오.

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결과

인간 iPSC와 iMSC의 분화
앞서 설명한 바와 같이, iPSC를 iMSC로 분화하기 위한 현재의 프로토콜은 배아체(embryoid body)의 형성을 포함한다(2). 이 과정은 iPSC에서 iMSC를 유도하는 데 약 10일이 걸립니다(그림 1A). 그러나 새로 생성된 iMSC를 최소 두 번 통과하는 것이 좋습니다. 이는 젤라틴 코팅 플레이트의 필요성을 없애는 데 도움이 될 뿐만 아니라 안...

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토론

이 프로토콜에서 iTenocyte는 (1) iMSC에 대한 iPSC의 유도, (2) 렌티바이러스 벡터를 사용한 SCX의 과발현, (3) 2D 단축 장력을 통한 세포 성숙의 세 가지 주요 단계를 통해 생성됩니다.

iPSC를 iMSC로 구별하기 위해 제시된 프로토콜은 이전에 그룹2에서 설명했습니다. 이 발표 이후, 임상시험에서 iMSC를 사용하기 위한 확립된 프로토콜(21,22,23)

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공개

모든 저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 NIH/NIAMS K01AR071512 및 CIRM DISC0-14350에서 Dmitriy Sheyn에 의해 부분적으로 지원되었습니다. 두 개의 렌티바이러스 패키징 플라스미드는 Simon Knott 실험실(Cedars-Sinai Medical Center, Department of Biomedical Sciences)에서 기증한 것입니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanol Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920cell dissociation reagent
Antibiotic-antimycotic solutionThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
APC mouse anti-human CD44BD Biosciences559942
APC mouse IgG2 K isotype controlBD Biosciences555745
BenchMark fetal bovine serumGeminiBio100-106
BiglycanThermofisherHs00959143_m1
Bovine serum albuminMillipore SigmaA3733
Collagen type I alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00164004_m1
Collagen type III alpha 1 chain human Taqman primerThermofisherHs00943809_m1
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD8418
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol redThermofisher11054020
Eagle's minimum essential medium (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectin bovine plasmaSigma AldrichF1141
FITC mouse anti-human CD90BD Biosciences555595
Gelatin from porcine skinSigma AldrichG1890
Goat anti Mouse IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, no phenol redThermofisher21056023
iPSCs: 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC Core FacilityN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Isotype Control Antibody, mouse IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut serum replacementThermofisher10828010
L-ascorbic acidSigma AldrichA4544
L-GlutamineThermofisher2503081
MatrigelCorning354230basement membrane matrix
MechanoCulture FXCellScaleN/Astretching apparatus
MEM non-essential amino acids solutionThermofisher11140050
Mohawk human Taqman primerThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Platelet-derived growth factor receptor A human Taqman primerThermofisherHs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate)Sigma Aldrich192066
Polybrene infection/transfection reagentsMillipore SigmaTR-1003
Recombinant human  TGF-beta 1 protein human Taqman primerRnD Systems240-B
Scleraxis human Taqman primerThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) human tagged ORF cloneOriGeneRC224305L4
Silicone platesCellScaleN/A
Sodium azideMillipore SigmaS2002
Tenascin C human Taqman primerThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin human Taqman primerThermofisherHs00223332_m1
Thrombospondin 4 human Taqman primerThermofisherHs00170261_m1
Transfection reagent, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermofisher25200072
Tubulin polymerization promoting protein family member 3ThermofisherHs03043892_m1
Y-27632 dihydrochlorideBiogems1293823

참고문헌

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