단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 생체 유체에서 세포외 소포체의 화학적 친화성 기반 분리

요약

본 프로토콜은 기능성 자성 비드를 이용한 요로 세포외 소포체의 효율적인 분리를 위한 상세한 설명을 제공한다. 또한 웨스턴 블로팅(western blotting), 단백질체학(proteomics) 및 포스포프로테오믹스(phosphoproteomics)를 포함한 후속 분석도 포함됩니다.

초록

생체액의 세포외 소포체(EV)는 최근 액체 생검 분야에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 거의 모든 유형의 세포에서 방출되는 이 세포는 숙주 세포의 실시간 스냅샷을 제공하며 단백질, 특히 세포 기능과 질병 발병 및 진행의 주요 역할을 하는 인산화와 같은 번역 후 변형(PTM)이 있는 단백질을 포함한 풍부한 분자 정보를 포함합니다. 그러나 현재 EV 분리 방법의 낮은 수율과 불순물로 인해 생체 유체에서 EV를 분리하는 것은 여전히 어렵기 때문에 EV 인단백질과 같은 EV 화물의 다운스트림 분석이 어렵습니다. 여기에서는 인간의 소변 및 다운스트림 단백질체학 및 EV 분리 후 인산염체 분석과 같은 생체 유체로부터 EV를 분리하기 위한 기능성 자성 비드를 기반으로 하는 빠르고 효과적인 EV 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 소변 EV의 높은 회수율과 EV 단백질체 및 포스포프로테옴의 민감한 프로파일을 가능하게 했습니다. 또한 이 프로토콜의 다양성과 관련 기술 고려 사항도 여기에서 다룹니다.

서문

세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막에 캡슐화된 나노 입자이며 혈액, 소변, 타액 등과 같은 생체 유체에 존재합니다.1,2,3,4. EV는 숙주 세포의 생리학적 및 병리학적 상태를 반영하는 다양한 생체 활성 분자의 화물을 운반하므로 질병 진행에 중요한 요인으로 기능합니다 ^4,5,6. 또한, 광범위한 연구를 통해 증상이 시작되거나 종양이 생리적으로 감지되기 전에 EV 기반 질병 마커를 식별할 수 있다는 것이 입증되었습니다 ^5,6,7.

인산화는 세포 신호 전달 및 조절의 핵심 메커니즘으로 작용합니다. 따라서 인단백질은 비정상적인 인산화 사건이 조절되지 않는 세포 신호 전....

프로토콜

모든 소변 샘플은 정보에 입각한 동의 후 건강한 개인으로부터 수집되었습니다. 실험은 인체 샘플과 관련된 모든 윤리 기준을 준수했으며 퍼듀 대학교 인간 연구 보호 프로그램의 지침을 준수했습니다.

1. 시료 채취

1. 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 12mL의 소변 샘플을 원심분리하여 2,500 x g, 4°C에서 10분 동안 세포 파편과 큰 세포사멸체를 제거합니다.
2. 상층액 10mL를 새 15mL 튜브에 옮기고 EV 분리를 진행합니다.
   참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 -80°C에서 보관하고 사용 시 37°C에서 해동할 수 있습니다.

2. EVtrap 접근 방식을 사용한 EV 절연

1. 제조업체의 지침에 따라 0.5mL의 로딩 버퍼(1:10 v/v 비율)와 100 μL의 EVtrap 비드 슬러리(1:50 v/v 비율)를 샘플에 추가합니다.
2. 실온에서 30분 동안 종단 회전으로 샘플을 배양합니다.
3. 15mL 원뿔형 튜브를 자석 분리기 랙에 놓아 샘플을 펠릿화합니다. 상층액을 제거합니다.
4. 비드를....

토론

효과적인 EV 분리는 EV에서 저농도 단백질과 인단백질을 검출하기 위한 필수 전제 조건입니다. 이러한 요구를 충족시키기 위한 수많은 방법이 개발되었음에도 불구하고 대다수는 여전히 회복 불량 또는 낮은 재현성과 같은 한계로 고통받고 있으며, 이는 대규모 연구 및 일상적인 임상 환경에서 활용을 방해합니다. DUC는 일반적으로 EV 분리를 위한 가장 일반적인 방법으로 간주되며, 추가 세척 단계.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 mL microcentrifuge tube	Life Science Products	M-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1005
15 mL conical centrifuge tube	Corning	352097
15 mL tube magnetic separator rack	Sergi Lab Supplies	1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody	Cell Signaling Technology	7074P2
Benchtop incubated shaker	Bioer	DIS-87999-3367802	Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAb	Cell Signaling Technology	13403S
Chloroacetamide	Sigma -Aldrich	C0267-100G	Used for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate	Fisher Scientific	E145-4	Precipitates detergents
Evosep One	Evosep		Liquid chromatography system
Evotips	Evosep	EV2013	Sample loading for Evosep One system
EVtrap	Tymora Analytical		Functionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer
Immobilon-FL PVDF Membrane	Sigma -Aldrich	IPFL00010	Blotting membrane
NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel	Invitrogen	NP0322BOX	Invitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)	Invitrogen	NP0007
PBS	ThermoFisher	10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9	Bruker	1893473	Separation column
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2	Sigma -Aldrich	P5726-5ML	100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma -Aldrich	P0044-1ML	100X,  Phosphotase inhibitor.
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher	23225
Pierce ECL Western Blotting Substrate	ThermoFisher	32106	HRP substrate
PolyMAC phosphopeptide enrichment kit	Tymora Analytical		Polymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate	Sigma -Aldrich	D6750-10G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate	Sigma -Aldrich	L9150-50G	Detergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HT	Bruker		Trapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips	Glygen	TT2C18.96	Desalting method
Triethylamine	Sigma -Aldrich	471283-100ML	For EV elution.
Triethylammonium bicabonate buffer	Sigma -Aldrich	T7408-100ML	1 M
Trifluoroacetic acid	Sigma -Aldrich	302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride	Sigma -Aldrich	C4706	Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIX	ThermoFisher	PIA41007