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요약

본 프로토콜은 기능성 자성 비드를 이용한 요로 세포외 소포체의 효율적인 분리를 위한 상세한 설명을 제공한다. 또한 웨스턴 블로팅(western blotting), 단백질체학(proteomics) 및 포스포프로테오믹스(phosphoproteomics)를 포함한 후속 분석도 포함됩니다.

초록

생체액의 세포외 소포체(EV)는 최근 액체 생검 분야에서 상당한 주목을 받고 있습니다. 거의 모든 유형의 세포에서 방출되는 이 세포는 숙주 세포의 실시간 스냅샷을 제공하며 단백질, 특히 세포 기능과 질병 발병 및 진행의 주요 역할을 하는 인산화와 같은 번역 후 변형(PTM)이 있는 단백질을 포함한 풍부한 분자 정보를 포함합니다. 그러나 현재 EV 분리 방법의 낮은 수율과 불순물로 인해 생체 유체에서 EV를 분리하는 것은 여전히 어렵기 때문에 EV 인단백질과 같은 EV 화물의 다운스트림 분석이 어렵습니다. 여기에서는 인간의 소변 및 다운스트림 단백질체학 및 EV 분리 후 인산염체 분석과 같은 생체 유체로부터 EV를 분리하기 위한 기능성 자성 비드를 기반으로 하는 빠르고 효과적인 EV 분리 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 소변 EV의 높은 회수율과 EV 단백질체 및 포스포프로테옴의 민감한 프로파일을 가능하게 했습니다. 또한 이 프로토콜의 다양성과 관련 기술 고려 사항도 여기에서 다룹니다.

서문

세포외 소포체(EV)는 모든 유형의 세포에서 분비되는 막에 캡슐화된 나노 입자이며 혈액, 소변, 타액 등과 같은 생체 유체에 존재합니다.1,2,3,4. EV는 숙주 세포의 생리학적 및 병리학적 상태를 반영하는 다양한 생체 활성 분자의 화물을 운반하므로 질병 진행에 중요한 요인으로 기능합니다 4,5,6. 또한, 광범위한 연구를 통해 증상이 시작되거나 종양이 생리적으로 감지되기 전에 EV 기반 질병 마커를 식별할 수 있다는 것이 입증되었습니다 5,6,7.

인산화는 세포 신호 전달 및 조절의 핵심 메커니즘으로 작용합니다. 따라서 인단백질은 비정상적인 인산화 사건이 조절되지 않는 세포 신호 전달 경로 및 암과 같은 전이성 질병 발생과 관련이 있기 때문에 바이오마커 발견을 위한 귀중한 소스를 제공합니다 8,9,10. 인산화 역학을 프로파일링하면 잠재적인 바이오마커로서 질병 특이적 인단백질 시그니처를 식별할 수 있지만, 인단백질의 낮은 존재량과 동적 특성은 인단백질을 바이오마커로 개발하는 데 큰 어려움을 초래합니다11,12. 특히, EV 내에 캡슐화된 저농도 인단백질은 세포외 환경(extracellular environment)에서 외부 효소 분해(external enzymatic digestion)로부터 보호된다 8. 결과적으로, EV 및 EV 유래 인단백질은 암 및 기타 질병의 초기 단계 발견에서 바이오마커 발견을 위한 이상적인 소스를 제공합니다.

EV의 단백질 인산화 분석은 암 신호 전달 및 조기 질병 진단을 이해하는 데 귀중한 리소스를 제공하지만, 효율적인 EV 분리 방법의 부족은 주요 장벽이 됩니다. EV 절연은 일반적으로 차동 초원심분리(DUC)13를 통해 달성됩니다. 그러나 이 방법은 시간이 많이 걸리고 처리량이 적고 재현성이 낮기 때문에 임상적 의미에 적합하지 않습니다13,14. 중합체-유도 침전(polymer-induced precipitation)15과 같은 대안적인 EV 분리 접근법은 비-EV 단백질의 동시 침전으로 인한 낮은 특이성에 의해 제한된다. 항체 기반 친화성 포획(antibody-based affinity capture)16 및 친화성 여과(affinity filtration)17를 포함한 친화성 기반 접근법은 향상된 특이성을 제공하지만, 부피가 작기 때문에 상대적으로 낮은 회수율로 제한됩니다.

EV의 인단백질 역학을 탐구할 때 발생하는 문제를 해결하기 위해 우리 그룹은 기능성 마그네틱 비드에 EV를 포획하기 위한 화학적 친화력을 기반으로 세포외 소포체 전체 회수 및 정제(EVtrap) 기술을 개발했습니다18. 이전 결과는 이 마그네틱 비드 기반 EV 분리 방법이 광범위한 생체 유체 샘플에서 EV를 분리하는 데 매우 효과적이며 DUC 및 기타 기존 분리 방법에 비해 오염을 최소화하면서 훨씬 더 높은 EV 수율을 달성할 수 있음을 입증했습니다18,19. 우리는 다양한 생체 유체에서 파생된 EV의 인산염을 프로파일링하고 다양한 질병에 대한 잠재적인 인단백질 바이오마커를 검출하기 위해 그룹20에서 개발한 EVtrap 및 티타늄 기반 인산펩타이드 농축 방법을 성공적으로 활용했습니다 19,21,22.

여기에서는 순환 EV의 격리를 위한 EVtrap 기반 프로토콜을 제시합니다. 이 프로토콜은 소변 EV에 중점을 둡니다. 또한 웨스턴 블로팅을 사용하여 절연된 EV의 특성화를 시연합니다. 그런 다음 단백질체학 및 인산염체학 분석을 위한 시료 전처리 및 질량분석법(MS) 획득에 대해 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 소변 EV 단백질체와 포스포프로테옴을 프로파일링하기 위한 효율적이고 재현 가능한 워크플로우를 제공하며, 이는 EV 및 그 임상 응용 분야에 대한 추가 연구를 용이하게 할 것입니다23.

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프로토콜

모든 소변 샘플은 정보에 입각한 동의 후 건강한 개인으로부터 수집되었습니다. 실험은 인체 샘플과 관련된 모든 윤리 기준을 준수했으며 퍼듀 대학교 인간 연구 보호 프로그램의 지침을 준수했습니다.

1. 시료 채취

  1. 15mL 원뿔형 원심분리 튜브에 12mL의 소변 샘플을 원심분리하여 2,500 x g, 4°C에서 10분 동안 세포 파편과 큰 세포사멸체를 제거합니다.
  2. 상층액 10mL를 새 15mL 튜브에 옮기고 EV 분리를 진행합니다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 -80°C에서 보관하고 사용 시 37°C에서 해동할 수 있습니다.

2. EVtrap 접근 방식을 사용한 EV 절연

  1. 제조업체의 지침에 따라 0.5mL의 로딩 버퍼(1:10 v/v 비율)와 100 μL의 EVtrap 비드 슬러리(1:50 v/v 비율)를 샘플에 추가합니다.
  2. 실온에서 30분 동안 종단 회전으로 샘플을 배양합니다.
  3. 15mL 원뿔형 튜브를 자석 분리기 랙에 놓아 샘플을 펠릿화합니다. 상층액을 제거합니다.
  4. 비드를 1mL의 세척 버퍼에 재현탁시키고 현탁액을 1.5mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다. 부드럽게 피펫팅하여 EV 바운드 비드를 재현탁합니다.
  5. 튜브를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 자기 분리기 랙에 놓고 상층액을 흡입합니다. P200 피펫을 사용하여 상층액을 완전히 흡입하고 비드 흡입을 피하십시오.
  6. 세척 완충액 1mL로 비드를 세척합니다. 비드가 마르는 것을 방지하기 위해 상층액을 흡입한 직후에 완충액을 추가하십시오.
  7. 실온에서 1mL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 비드를 2회 세척합니다.
  8. 갓 준비한 100mM 트리에틸아민 100μL로 비드를 실온에서 10분 동안 배양하고 1.5mL 미세 원심분리기 튜브 자기 분리기 랙을 사용하여 EV가 포함된 용출 용액을 수집합니다.
    참고: 1mM 트리에틸아민 1mL를 준비하려면 트리에틸아민 용액 14μL를 물에 희석합니다.
  9. 2.8단계를 반복하고 용리된 용액을 결합합니다. 4°C에서 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 용출액을 건조합니다.
    참고: 여기에서 실험을 일시 중지할 수 있습니다. 건조된 EV 샘플은 다음 단계나 결과에 부정적인 영향 없이 -80°C에서 몇 달 동안 보관할 수 있습니다.

3. 웨스턴 블로팅에 의한 EV의 특성화

  1. 10mM 디티오트레이톨(DTT)이 포함된 1x 리튬 도데실 설페이트(LDS) 샘플 버퍼 20μL에 건조된 EV 샘플의 5%(소변 샘플 0.5mL에 해당)를 재현탁시킵니다.
    참고: 0.5mL의 소변에서 추출한 EV는 웨스턴 블로팅에서 CD9(EV 마커24) 신호를 검출하기에 충분합니다.
  2. 샘플을 95°C에서 5분 동안 끓입니다. 샘플을 폴리아크릴아미드 겔에 로드하고 표준 프로토콜25에 따라 전기영동 및 면역블로팅을 수행합니다.
  3. 단백질을 저형광 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 옮긴 후 실온에서 1시간 동안 트리스 완충 식염수 트윈-20(TBST)의 1% 소 혈청 알부민(BSA)으로 멤브레인을 차단합니다. 1L의 TBST 완충액을 제조하려면 19mM Tris 염기, 137mM NaCl 및 1mL의 Tween-20을 추가합니다. HCl을 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
  4. 토끼 항-CD9 항체와 함께 1:5,000 비율로 TBST의 1% BSA에서 4°C에서 밤새 또는 실온에서 2시간 동안 멤브레인을 배양합니다.
  5. TBST로 멤브레인을 각각 3분 동안 5회 세척합니다. 실온에서 1시간 동안 TBST의 1% BSA에서 1:5000 비율로 항-토끼 IgG, HRP 결합 2차 항체로 멤브레인을 배양합니다.
  6. TBST로 멤브레인을 각각 3분 동안 5회 세척합니다. 상업적으로 획득한 ECL(enhanced chemiluminescence) 기질(1:1 비율)을 멤브레인에 추가하고 화학발광 이미징 시스템에서 신호를 감지합니다.

4. 단백질체학 및 인산염학 분석을 위한 시료 전처리

  1. 12mM 소듐 데옥시콜레이트(SDC), 12mM 소듐 라우로일 사르코시네이트(SLS), 100mM 트리에틸암모늄 중탄산염 완충액(TEAB), 10mM 트리스-(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP), 40mM 클로로아세트아미드(CAA) 및 1x 인산가수분해효소 억제제 칵테일을 포함하는 신선한 용해 완충액을 준비합니다.
    참고: 원액은 재료 목차의 설명에 나열되어 있습니다. 용해 완충액은 필요한 부피에 따라 원하는 농도를 얻기 위해 원액을 첨가하여 준비됩니다.
  2. 건조된 EV 시료를 100μL의 용해 완충액에 용해시키고 1,100rpm에서 진탕하면서 95°C에서 10분 동안 시료를 가열합니다.
  3. 샘플을 실온으로 냉각한 후 400μL의 50mM TEAB를 추가하여 5배로 희석합니다.
  4. 제조업체의 지침에 따라 BCA 분석 키트를 사용하여 단백질 농도를 측정합니다. 50mM TEAB로 5배 희석한 용해 완충액을 블랭크로 사용합니다.
  5. 효소 대 단백질 비율을 1:50 w/w로 하여 트립신/Lys-C 혼합물을 첨가하고 1,100 rpm으로 진탕하면서 37°C에서 밤새 샘플을 배양합니다.
  6. 50μL의 10% 트리플루오로아세트산(TFA)을 추가하여 시료를 산성화합니다.
  7. 샘플에 에틸 아세테이트 600μL를 추가하고 혼합물을 2분 동안 소용돌이칩니다.
  8. 샘플을 20,000 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 상부층(유기층)을 제거합니다. 흡인 중에 인터페이스를 방해하지 마십시오.
  9. 4.7-4.8단계를 반복합니다. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 수성상을 건조합니다.
  10. 건조된 시료를 0.1% TFA 200μL에 재현탁시켜 펩타이드를 산성화하고 제조업체의 지침에 따라 C18 탈염 팁을 사용하여 시료를 탈염합니다. 80% 아세토니트릴에 0.1% TFA 200μL로 팁을 컨디셔닝한 다음 0.1% TFA의 200μL로 2x를 컨디셔닝합니다. 산성화된 펩타이드 샘플을 팁에 로드한 다음 0.1% TFA의 200μL로 팁을 3번 세척합니다. 80% 아세토니트릴에서 0.1% TFA의 200μL로 펩타이드를 용리합니다.
  11. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 용출액을 건조시킵니다. 단백질체학 분석을 위해 펩타이드 샘플의 2%(소변 샘플의 0.2mL에 해당)를 별도로 건조합니다. 샘플의 나머지(98%)는 인산단백질체학 분석을 위해 사용합니다.
  12. 제조업체의 지침에 따라 인산펩타이드 농축 키트를 사용하여 샘플에서 인산펩타이드를 농축합니다. 보강을 위해 아래에 설명된 단계를 수행합니다.
    1. 건조된 샘플을 200μL의 로딩 버퍼에 재현탁시킵니다. 샘플에 비드 50μL를 넣고 실온에서 20분 동안 세게 흔듭니다. 비드와 함께 샘플을 프릿 팁에 로드하고 100 x g에서 1분 동안 원심분리기를 로드합니다.
    2. 200μL의 로딩 버퍼로 팁을 세척한 다음 세척 버퍼 1을 세척한 다음 세척 버퍼 2를 세척합니다. 20 x g 에서 2분 동안 한 번, 100 x g에서 1분 동안 한 번 원심분리하여 세 가지 세척 단계를 모두 수행합니다.
    3. 비드가 있는 팁을 새 튜브에 넣어 용리된 인산펩타이드를 수집합니다. 팁에 50μL의 용출 완충액을 추가하고 20 x g에서 2분 동안 한 번 원심분리합니다 . 팁에 50μL의 용출 완충액을 더 추가하고 20 x g에서 2분 동안 한 번 원심분리합니다. 100 x g에서 1분 동안 마지막으로 원심분리합니다.
  13. 진공 원심분리기 농축기를 사용하여 용리된 인산펩타이드를 건조합니다.

5. LC-MS/MS 분석

참고: 다양한 LC-MS/MS 시스템/설정 및 데이터 종속 수집(DDA)과 같은 데이터 수집 방법을 사용할 수 있습니다.

  1. 건조된 단백질체/포스포프로테옴 샘플을 0.1% 포름산(용매 A)에 재현탁시키고 제조업체의 지침에 따라 샘플을 로드합니다.
  2. 액체 크로마토그래피(LC) 시스템을 통해 갇힌 Ion-Mobility ToF(Time-of-Flight) MS에 시료를 주입하고 사전 설정된 표준화된 Whisper 40 samples per day 분석법을 사용합니다. 펩타이드는 재료 표에 언급된 대로 15cm C18 컬럼(내경 75μm, 입자 크기 1.9μm)에서 분리됩니다.
  3. 단백질체학 분석의 경우, 300-1200 m/z 및 0.6-1.50 1/K0 범위의 램프당 질량 범위와 1.38 초의 사이클 타임으로 데이터 독립적 수집(dia-PASEF) 수집 방법과 결합된 병렬 축적-연속 단편화를 사용하여 데이터를 수집합니다.
  4. 인산화체학 분석의 경우, 1.38초의 사이클 타임으로 램프당 질량 범위가 400-1550m/z 및 0.6-1.50 1/K0인 dia-PASEF 수집 방법을 사용하여 데이터를 수집합니다.
  5. 원시 파일을 단백질체학 소프트웨어에 로드하고 라이브러리가 필요 없는 데이터 독립적 수집 워크플로우를 사용하여 신호 추출, 식별 및 정량 분석을 수행합니다.
    1. 검색 설정의 경우 호모 사피엔스 데이터베이스, 트립신/P 효소가 있는 특정 분해 유형, 7개의 최소 펩타이드 길이, 52개의 최대 펩타이드 길이, 2개의 누락된 절단, 시스테인의 카바미도메틸을 고정 변형으로, 아세틸 단백질 N-term, 메티오닌의 산화, 세린, 트레오닌 및 티로신의 인산화(인산화체학 분석용)를 변수 변형으로, 5개를 최대 변수 변형으로 사용합니다. PSM, 펩타이드 및 단백질 그룹에서 FDR을 0.01로 설정합니다.
      참고: 이 프로토콜에는 Spectronaut 소프트웨어가 사용되었습니다. DIA-NN 및 PEAKS와 같은 다른 DIA 데이터 검색 소프트웨어도 일반적으로 사용됩니다. DDA 모드에서 데이터를 수집한 경우 MaxQuant 및 Proteome Discoverer와 같은 소프트웨어를 적용할 수 있습니다.

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결과

이 프로토콜은 EV 분리부터 다운스트림 단백질체학 및 인산염체 분석에 이르는 포괄적인 워크플로우를 보여줍니다(그림 1). 세 개의 소변 샘플은 EV 분리를 거쳤습니다. 분리된 EV는 웨스턴 블로팅(western blotting)으로 특성화되었으며 이후 단백질 추출, 효소 분해 및 펩타이드 클린업을 포함한 질량 분석 기반 단백질체학 시료 전처리를 위해 처리되었습니다. 인산화체학 분석을 ...

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토론

효과적인 EV 분리는 EV에서 저농도 단백질과 인단백질을 검출하기 위한 필수 전제 조건입니다. 이러한 요구를 충족시키기 위한 수많은 방법이 개발되었음에도 불구하고 대다수는 여전히 회복 불량 또는 낮은 재현성과 같은 한계로 고통받고 있으며, 이는 대규모 연구 및 일상적인 임상 환경에서 활용을 방해합니다. DUC는 일반적으로 EV 분리를 위한 가장 일반적인 방법으로 간주되며, 추가 세척 단계...

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공개

저자는 경쟁적인 재정적 이익을 선언합니다. Anton Iliuk와 W. Andy Tao는 EVtrap 비드를 개발하고 PolyMAC 인산펩타이드 농축 키트를 상용화한 Tymora Analytical Operations의 공동 설립자입니다.

감사의 말

이 연구는 NIH 보조금 3RF1AG064250 및 R44CA239845의 일부 자금 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL microcentrifuge tubeLife Science ProductsM-1700C-LB
1.5 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1005
15 mL conical centrifuge tubeCorning 352097
15 mL tube magnetic separator rackSergi Lab Supplies1002
Anti-rabbit IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7074P2
Benchtop incubated shakerBioerDIS-87999-3367802Bioer Thermocell Mixing Block MB-101
CD9 (D3H4P) Rabbit mAbCell Signaling Technology13403S
ChloroacetamideSigma -AldrichC0267-100GUsed for alkylation of reduced sulfide groups. Freshly prepare 400 mM in water as stock solution.
Ethyl acetate Fisher Scientific E145-4Precipitates detergents
Evosep One EvosepLiquid chromatography system
EvotipsEvosepEV2013Sample loading for Evosep One system 
EVtrapTymora AnalyticalFunctionalized magnetic beads, loading buffer, and washing buffer 
Immobilon-FL PVDF MembraneSigma -AldrichIPFL00010Blotting membrane 
NuPAGE 4-12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 to 12%, Bis-Tris, 1.0 mm, Mini Protein Gel, 12-well
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker 1893473Separation column 
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, Phosphotase inhibitor.
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  Phosphotase inhibitor. 
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher23225
Pierce ECL Western Blotting SubstrateThermoFisher32106HRP substrate 
PolyMAC phosphopeptide enrichment kitTymora AnalyticalPolymer-based metal ion affinity capture (PolyMAC) for phosphopeptide enrichment
Sodium deoxycholate Sigma -AldrichD6750-10GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
Sodium lauroyl sarcosinate Sigma -AldrichL9150-50GDetergent for lysis buffer. Prepare 120 mM in water as stock solution.
timsTOF HTBrukerTrapped ion-mobility time-of-flight mass spectrometry
TopTip C-18 (10-200 μL) tips GlygenTT2C18.96Desalting method
TriethylamineSigma -Aldrich471283-100MLFor EV elution. 
Triethylammonium bicabonate bufferSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Trifluoroacetic acidSigma -Aldrich302031-100ML
Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochlorideSigma -AldrichC4706Used for reducion of disulfide bonds. Prepare 200 mM in water as stock solution. Aliquot the stock solution into small volume and store it in at-20°C (avoid multiple freeze-thaw cycles).
Trypsin/Lys-C MIXThermoFisherPIA41007

참고문헌

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