힘줄 연구를 위한 이광자 현미경 검사

요약

이 기사에서는 다광자 현미경을 사용하여 힘줄을 준비, 설정 및 이미징하는 과정을 간략하게 설명합니다. 또한 콜라겐 원섬유 정렬을 분석하고 힘줄의 3D 표현을 생성하기 위한 SHG의 적용을 다룹니다. 이 방법론은 손상 및 발달 중에 힘줄 세포와 ECM을 특성화하는 데 매우 유용한 것으로 입증되었습니다.

초록

이광자 현미경 검사는 심부 조직 세포를 평가하고 다양한 생물학적 시스템에서 세포외 기질(ECM)의 정렬을 특성화하기 위한 강력한 도구로 부상했습니다. 이 기술은 비선형 광-물질 상호 작용에 의존하여 두 가지 별개의 신호, 즉 콜라겐 섬유와 그 방향의 시각화를 용이하게 하는 SHG(Second Harmonic Generated) 확산 신호와 자외선 여기 자가형광 이미징을 위한 근적외선 여기 신호입니다.

SHG 이미징은 섬유소 콜라겐 I의 비중심대칭 결정 구조로 인해 콜라겐 섬유를 시각화하는 데 특히 효과적인 것으로 입증되었습니다. 힘줄은 세포 수가 제한된 매트릭스가 풍부한 조직이라는 점을 감안할 때 콜라겐 함량이 높기 때문에 이광자 현미경을 사용한 분석에 이상적인 후보입니다. 결과적으로, 이광자 현미경 검사는 힘줄의 콜라겐 이상을 분석하고 특성화할 수 있는 유용한 수단을 제공합니다. 그 응용 분야는 힘줄 발달, 부상, 치유 및 노화 연구로 확장되어 이광자 현미경 도구를 사용하여 다양한 조건에서 힘줄 세포와 ECM과의 상호 작용을 포괄적으로 특성화할 수 있습니다. 이 프로토콜은 힘줄 생물학에서 이광자 현미경의 사용을 간략하게 설명하고 발달 중 및 손상 후 힘줄 세포의 효과적인 이미징 및 특성화를 달성하기 위한 적응된 방법론을 제시합니다. 이 방법을 사용하면 얇은 현미경 절편을 활용하여 힘줄 및 이 매트릭스와 상호 작용하는 세포 내의 ECM에 대한 포괄적인 이미지를 생성할 수 있습니다. 특히 이 기사는 동물 모델에서 이광자 현미경을 사용하여 3D 이미지를 생성하는 기술을 보여줍니다.

서문

근육에서 뼈로 힘을 전달하고 적절하게 기능하기 위해^힘줄은 1 콜라겐 섬유 사이의 분자간 및 분자 내 결합에 의존합니다. 콜라겐 섬유의 복잡한 자체 조립, 가교 결합 및 정렬은 힘줄 조직의 생체 역학적 강도와 유연성에 기여하는 고도로 조직화된 매트릭스의 형성을 초래합니다 ^2,3,4. 다른 ECM 단백질도 힘줄5의 섬유소 네트워크의 안정성에 기여^{하지만, 힘}줄 건조 덩어리는 약 86%가 콜라겐^6이며, 콜라겐 I은 총 콜라겐 함량 ^7,8의 최대 96%를 차지합니다. 이것은 궁극적으로 콜라겐 구조를 정상적인 힘줄 건강과 기능의 핵심 출력물로 만듭니다.

힘줄에 사용되는 일부 임상 영상 방식은 MRI 및/또는 초음파입니다. 초음파 기술은 힘줄의 근막 구조에 대한 이미지를 제공하고 조직⁹의 섬유소 구조 중 일부를 드러내지만, 해상도는 정량화에 적합하지 않습니다. MRI는 초음파 영상보다 공간 해상도가 우수하지만 여전히 제한적입니다. 그러나 이러한 방법은 조직을 통한 잠재적인 이미징 깊이에도 제한이 있습니다. 보다 미시적인 규모에서는 소각 및 광각 광 산란 및 컨포칼 현미경을 사용하여 콜라겐 원섬유의 구조와 잠재적인 이상을 평가할 수 있습니다.

대조적으로, SHG(Second-Harmonic Generation) 현미경은 콜라겐 원섬유의 외부 껍질을 캡처할 수 있다는 점에서 다른 이미징 방법과 다릅니다. 힘줄의 콜라겐 I 원섬유는 힘줄 ECM을 통해 단축 평행 방식으로 조직되며 본질적으로 비중심 대칭입니다 ^4,10. 이러한 특성은 다광자 현미경을 사용한 이미징에 활용할 수 있으며, 이는 컨포칼 이미징보다 최대 2-3배 더 깊은 선명한 이미지를 생성할 수 있습니다¹¹. 이것은 또한 힘줄의 더 나은 품질의 광학 단면을 생성할 수 있게 해줍니다. 관심 샘플에 빛이 투사되면 SHG 신호가 생성되고 이러한 빛의 산란을 캡처할 수 있습니다. 힘줄에서 이것은 콜라겐 구조와 정렬에 대한 이미지를 생성하므로 건병증, 부상 등의 잠재적인 형태학적, 병리학적 결과를 평가할 수 있습니다.

콜라겐은 힘줄 건조 덩어리의 대부분을 구성하고 힘줄 기능에 기여하기 때문에 ^6,12, 콜라겐 구조의 파괴는 힘줄의 생체역학적 특성에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서 구조를 분석하면 부상의 영향과 심각성을 더 잘 이해할 수 있을 뿐만 아니라 치유 효능에 대한 지표를 만드는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 논문은 다광자 및 SHG 현미경을 사용하여 발달 및 손상이 콜라겐 I 원섬유의 구조와 정렬에 어떤 영향을 미치는지 분석하고 동물 모델에서 힘줄 ECM의 3D 이미지를 생성하는 방법을 검토합니다. 따라서 힘줄을 이미지화하는 당사의 방법은 연구자들이 발달 중 또는 손상 후에 힘줄 세포와 ECM을 특성화하는 데 도움이 될 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 실험은 매사추세츠 종합 병원의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)(프로토콜 #2013N0000062) 및 AAALAC 지침에 따라 수행되었습니다. 본 연구에는 생후 30일의 Scx-GFP 배경에서 BHLHE40 null knockout 또는 이형접합 암컷 마우스가 사용되었습니다. 동물은 상업적 출처에서 얻었습니다 ( 재료 표 참조).

1. 조직 준비 및 정착

1. 조직을 준비하기 위해 CO₂ 챔버에서 마우스를 안락사시킨 다음(기관에서 승인된 프로토콜에 따름) 자궁경부 탈구를 수행합니다.
2. 조직 샘플에 달라붙을 수 있는 털의 양을 줄이려면 털이 포화될 때까지 마우스에 70% EtOH를 뿌립니다. 뒷다리의 껍질을 벗긴 다음 가위를 사용하여 고관절을 잘라 두 개의 뒷다리를 제거합니다.
3. 두 개의 뒷다리를 20mL 섬광 바이알에 넣고 바이알이 채워지도록 4% PFA에 담급니다. 바이알을 4°C에서 밤새 저어줍니다.
4. 실온(RT)에서 10분 동안 교반하면서 1x PBS에 뒷다리를 씻고 총 3회 반복합니다. 뒷다리를 4°C에서 0.5M EDTA(pH 8.0)에 최대 2주 동안 교반하면서 담그고 2-3일마다 새 EDTA로 교체합니다.
5. RT에서 10분 동안 교반하면서 1x PBS로 뒷다리를 씻고 총 3회 반복하여 씻습니다.
6. 팔다리를 신선한 1x PBS에 담그고 이미징에 사용될 때까지 4°C에서 보관합니다.

2. 힘줄 절제 및 이미징을 위한 조직 준비

1. 집게로 발을 잡고 스프링 가위 날의 한쪽 끝을 아킬레스 건 아래로 밀어 넣고 가능한 한 근긴장 접합부에 가깝게 절단합니다.
2. 힘줄의 절단된 근 끝 부분을 집게로 잡고 스프링 가위를 사용하여 힘줄을 뼈에 최대한 가깝게 잘라냅니다.
   알림: 필요한 경우 집게를 사용하여 첫 번째 절단 중에 아킬레스 건을 뒷다리의 나머지 부분에서 멀리 떨어뜨립니다. 이미징 중 콜라겐 정렬에 영향을 미치므로 조직을 부수거나 손상시키지 마십시오.
3. 투과화하여 핵 대조염색을 하려면 절개된 힘줄을 PBT(PBS의 1% Triton-X)에 0.1% Draq5(스톡 농도, 5mM, 재료 표 참조)에 담그십시오. 힘줄을 2mL 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 1uL의 Draq5를 1mL의 PBT에 추가합니다. RT에서 로커에서 하룻밤 배양하십시오. Draq5는 빛에 민감하기 때문에 마이크로 원심분리기 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 시료를 빛으로부터 보호하십시오.
4. 이미징하기 전에 Draq5 용액을 제거하고 dPBS로 교체하십시오. s를 계속 보호하십시오.amp빛으로부터 le.
   주의: Draq5는 독성 범주 3을 가지고 있으며 OSHA 위험 정보 보호 표준에 의해 위험한 것으로 간주됩니다. 접촉을 피하고 라벨이 붙은 쓰레기통에 버리십시오.
5. 내경이 6mm인 생검 펀치 도구를 사용하여 젤 폼 조각( 재료 표 참조)을 잘라내어 60 x 15mm의 작은 페트리 접시에 넣습니다. 접시에 ddH₂O를 추가하여 젤 폼이 팽창할 수 있도록 합니다.
6. 절개된 아킬레스건을 젤 폼에 놓습니다. 와셔에 접착된 커버슬립을 사용하여 커버슬립이 조직에 닿을 때까지 와셔를 힘줄 위에 조심스럽게 놓습니다. 이미징 시 문제를 방지하려면 샘플과 커버슬립 사이에 기포가 없는지 확인하십시오. 필요한 경우 접시에 ddH₂O를 더 추가하여 샘플을 덮고 와셔를 커버 슬립으로 덮습니다.

3. 다광자 현미경을 사용한 이미징

1. FVMPE-RS 다광자 레이저 현미경, 물에 담글 수 있는 25x 대물렌즈, HPDS-O IR 펄스 레이저 및 IR 펄스 레이저( 재료 표 참조)를 사용하여 EPI 광 경로를 사용하여 이미징할 샘플과 관심 영역을 찾습니다. 샘플이 발견되면 아킬레스 건의 근 끝 또는 내측 끝에 카메라를 놓습니다.
2. 광 경로를 LSH로 전환하고 레이저 2의 IR 레이저 설정을 840nm로 조정한 다음 적극적으로 정렬합니다. 20%를 초과하지 않고 조직과 SHG 신호를 볼 수 있도록 HV 강도를 조정합니다. 게인을 조정하지 말고 오프셋을 0으로 유지하십시오.
3. 그런 다음, z-stack 매개 변수를 구성하여 샘플 이미지를 가져옵니다. 1024 x 1024 스캔 크기를 사용하고 단계 크기를 0.4미크론으로 설정합니다. Z-스택은 평균적으로 약 150개의 슬라이스이며, SHG 신호가 더 이상 명확하지 않을 때까지 바깥쪽 외피에서 시작하여 힘줄의 중심을 향해 이동하여 시상 광학 단면(¹³)을 생성합니다.
4. 신호 감지 표준화를 허용하기 위해 레이저 출력을 Bright Z 모드로 조정합니다. Z-stack 시작/중지 매개변수가 설정되면 이미징 시작 시 4, 이미징 종료 시 6에서 레이저 강도를 설정합니다. 이는 스코프 이미지가 조직 깊숙이 들어갈 때 SHG 신호의 일관성을 유지하는 데 도움이 됩니다.
5. Z 스택이 생성되면 ImageJ/FIJI에서 추가로 처리하여 가로 방향의 광학 단면 동영상을 만듭니다. 이렇게 하려면 ImageJ/FIJI 소프트웨어¹⁴ 를 열고 이미지 > 스택 > 재슬라이스를 클릭합니다. 이를 통해 아킬레스건을 가로로 볼 수 있으며, 건세포의 성상 형태와 콜라겐 매트릭스에서의 방향을 밝힐 수 있습니다.

결과

이 프로토콜은 손상 후, 발달 중 또는 돌연변이 상태에서 힘줄 세포와 그 세포외 기질(ECM)을 특성화하는 데 유용합니다. 샘플을 신중히 해부하고 준비하면 시상 방향으로 조직을 통해 z-stack 비디오를 생성할 수 있습니다(비디오 1 및 비디오 2). ImageJ/FIJI를 사용하여 이미지를 처리하고 다시 슬라이스하면 아킬레스건의 횡방향 보기가 생성됩니다(

토론

이 기사에서는 힘줄 ECM의 비중심대칭 결정 특성을 활용하여 마우스 아킬레스건을 준비, 절제 및 이미지화하는 방법을 제시합니다. 조직 준비의 주요 단계에는 counterstain에 대한 투과화와 이미징 중 페트리 접시에 적절한 조직 배치를 확인하는 것이 포함됩니다. Draq5 대신 Hoechst 33258을 1:100,000 희석¹³으로 사용할 수 있지만 Draq5는 높은 투과성, 광안정성 및 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	AM9262
2 mL microcentrifuge tubes	USA Scientific	1620-2700
20 mL scintillation vial	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4% Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-487	Use PFA ampuole to create 4% PFA solution
6 mm Biopsy Punch Tool	Ted Pella Inc.	15111-60
60 x 15 mm petri dish
BHLHE40 null knockout or heterozygous mice in a Scx-GFP background	The Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Coverslips	Fisher	12-544-F	Can use any coverslip that spans the area of the M20 washer
dPBS	Gibco	14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Fine scissors 21 mm cutting edge	Fine Science Tools	14060-10
FVMPE-RS multiphoton laser scanning microscope	Olympus
Gelfoam Sterile Sponge Size 50	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL IR pulsed laser	Olympus
MaiTai HPDS-O IR pulsed laser	Olympus
Phosphate-Buffered Saline (1x)	Invitrogen	AM9625	Dilute 10x PBS in milli-Q water to get 1x solution
Stainless steel M20 flat washer	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Dilute Triton X-100 in dPBS to get 1% solution
Vannas spring scissors 4 mm cutting edge	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens