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요약

이 항체 상동성 모델링 예측 프로토콜은 항체-수용체 Pyrx 도킹 및 분자 역학 시뮬레이션으로 이어집니다. 이 세 가지 주요 방법은 정확한 항체-수용체 결합 영역과 최종 구조의 결합 안정성을 시각화하는 데 사용됩니다.

초록

단쇄 단편 변수(scFv) 항체는 이전에 (Gly4-Ser) 3 링커로 결합된 다양한 경쇄 및 중쇄로 구성되었습니다. 링커는 분자 모델링 소프트웨어를 루프 구조로 사용하여 만들어졌습니다. 여기에서는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)와 상호 작용하는 완전한 scFv 항체의인실리코(in silico ) 분석을 위한 프로토콜을 소개합니다. 단백질-단백질 도킹의 Pyrx와 상호 작용하는 scFv 항체 및 EGFR의 분자 역학 시뮬레이션을 사용한 상동성 모델링첫째, 저자는 상동성 모델링을 위해 단백질 구조 모델링 프로그램과 Python을 사용했으며, 항체 scFv 구조는 상동성을 위해 모델링했습니다. 조사관들은 도킹 연구의 플랫폼으로 Pyrx 소프트웨어를 다운로드했습니다. 분자 역학 시뮬레이션은 모델링 소프트웨어를 사용하여 실행되었습니다. 결과는 MD 시뮬레이션이 에너지 최소화를 적용했을 때 단백질 모델이 가장 낮은 결합 에너지(-5.4kcal/M)를 가졌음을 보여줍니다. 또한, 본 연구의 MD 시뮬레이션은 도킹된 EGFR-scFv 항체가 구조의 움직임이 7.2 Å로 급격히 증가했을 때 20-75 ns 동안 안정적임을 보여주었습니다. 결론적으로, 인실리코(in silico) 분석을 실시하여 scFv 항체의 분자 도킹 및 분자 역학 시뮬레이션을 통해 EGFR에 대한 특이적 약물 요법으로 설계된 면역 치료제 scFv의 효과를 입증했습니다.

서문

단백질(리간드 및 수용체)의 구조적 변화는 항상 구조 기반 기능에 따라 발생합니다. 단백질의 가능한 결합 홈에 대한 연구와 안정적인 결합 상호 작용의 예측은 인체에서 더 잘 사용할 수 있도록 약물을 준비하는 고급 방법입니다. 도킹 및 분자 역학 시뮬레이션에 이은 상동성 모델링은 특정 개인화 의약품으로 사용되는 수용체의 잔기와 구성된 항체 사이의 안정적인 결합 상호 작용을 정확하게 예측하기 위한 간단한 방법입니다 1,2. 예측된 모델 구조는 리간드-수용체 결합 부위, 특히 항체-수용체 계면에서 구조적 변화와 재배열을 보여줄 수 있습니다. 이러한 변경에는 사이드 체인의 회전, 전역 구조 변환 또는 더 복잡한 수정과 같은 여러 가지 이유가 있습니다. 상동성 모델링의 주된 이유는 단백질의 3차 구조를 1차 구조 2,3과 구별하기 위함입니다.

표피 성장 인자 수용체(EGFR)라고 하는 티로신 키나아제 수용체는 세포사멸 4,5, 분화 6,7, 세포주기 진행8,9, 발달 9,10 및 전사11 등 암세포에서 많은 생물학적 역할을 합니다. EGFR은 잘 알려진 유방암 치료 표적 중 하나이다12. EGFR과 같은 규칙적인 키나아제 활성의 과발현은 일반적으로 암세포 진행을 유발하며, 이는 많은 종류의 암 억제제에 의해 억제될 수 있습니다13. 표피 성장 인자 수용체(EGFR)는 이 수용체에 대항하여 작용하도록 특별히 구성된 단일 사슬 단편 변수에 대한 수용체로 사용되었습니다. 예측된 구조는 항체 결합 활성을 테스트하는 데 사용되었습니다.

본 논문에서는 Python 스크립트와 상동성 모델링 방법14,15를 사용한 모델링 소프트웨어를 사용하여 scFv 항체 구조를 모델링했습니다. 상동성 모델은 수용체와 리간드의 단백질 및 아미노산 서열로부터 구축될 수 있습니다16,17. 또한 분자 도킹과 같은 고급 생물정보학 기술을 사용하여 소분자 리간드가 올바른 표적 결합 부위에 어떻게 결합하는지 예측했습니다. 이 도킹은 여러 질병을 대상으로 하는 신약 개발의 균형을 맞출 것입니다. 바인딩 동작이 고려됩니다 5,18.

또한, 분자 도킹은 리간드-수용체 결합 발달을 촉진하고 가속화하는 중요한 기술입니다. 분자 도킹을 통해 과학자들은 표적 단백질에 대한 리간드 라이브러리를 가상으로 스크리닝하고 표적 수용체 단백질에 대한 리간드의 결합 형태 및 친화도를 예측할 수 있습니다. 분자역학 시뮬레이션(MNS)은 잔류물이 공간에서 어떻게 이동하는지 보여주고, 수용체를 향한 항체 움직임을 시뮬레이션하며, 최종적으로 항체 설계 노력에 정보를 제공합니다. 이 연구는 scFv 항체가 EGFR에 결합하는 방법과 MD시뮬레이션에서 해당 결합의 에너지와 시간을 감지하는 방법을 결정한 그리드 상자 치수에 대한 새로운 예측입니다.

프로토콜

1. 단쇄 단편 변수(scFv) 단백질의 2차 구조 예측

  1. BLAST 단백질 데이터 뱅크(PDB), KABAT 번호 매기기 및 모델링 소프트웨어를 사용하여 scFv(single-chain fragment variable) 단백질의 3D 구조를 구축합니다. scFv는 가변 중쇄(VH)와 가변 경쇄(VL)를 연결하는 링커(Gly4-Ser)로 구성됩니다.
  2. 분자 모델링 소프트웨어를 사용하여 링커를 루프 구조로 구축하고 이전 연구 2,19,20에서 설명한 대로 이러한 모든 방법을 수행합니다.

2. 템플릿 선택 및 scFv 및 EGFR 3D 구조 예측 및 상동성 모델링

  1. EGFR 구조에 대한 템플릿 1ivo를 선택합니다(고해상도에 따라). 그림 1B와 같이 pdb 웹 사이트에서 1ivo.pdb 파일을 다운로드합니다.
  2. 아래 설명된 대로 입력 1ivo.pdb 파일을 준비합니다.
    1. 1ivo.pdb 파일에서 pdb.org 웹 사이트를 열고 1ivo를 선택하여 모든 외부 리간드를 제거합니다. Structure, 그리고 pdb 웹 사이트의 1ivo structure page에 있는 small molecule 제목 아래에서 리간드의 이름을 찾고 있습니다.
    2. 리간드 이름 NAG를 찾습니다. pdb 웹사이트에서 다운로드한 1ivo.pdb 파일을 열고 종단 잔류물(TER)을 찾습니다.
    3. 1ivo 구조에서 외부 리간드의 잔류물을 TER 이후의 잔기부터 시작하여 잔기가 끝나기 전에 삭제합니다. 시스템에 1ivo.pdb 파일을 저장합니다.
  3. 저장된 1ivo.pdb 파일을 아래와 같이 준비합니다.
    1. 창 선택 영역에서 Autodock 도킹 소프트웨어(autodock.scripps.edu)를 다운로드합니다. 열린 1ivo.pdb 파일을 클릭합니다.
    2. Edit(편집) 명령을 사용하여 Add Hydrogen(수소 추가) > Add(추가)를 선택한 다음 Polar Only(극좌표만)를 선택하고 Ok(확인)를 누릅니다.
    3. 편집 명령을 사용하여 Kollman 충전을 추가합니다(보충 그림 1). 편집 명령을 사용하여 물을 삭제합니다. PC에 1ivo.pdb 파일을 저장합니다.
  4. 아래와 같이 1ivo.pdb 구조체의 에너지를 최소화한다.
    1. SPDBV를 다운로드합니다. http://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html 의 소프트웨어. 1ivo.pdb 파일을 엽니다.
    2. 모두 선택합니다. Perf > Energy minimization > Ok(보충 그림 2) 명령을 선택합니다. PC에 1ivo 파일을 저장합니다.
  5. 아래 설명된 대로 상동성 모델링을 사용하여 전체 모델 scFv를 준비합니다.
    1. Window-64에서 모델링 소프트웨어 17 및 Python 스크립트 3.7.9 셸을 다운로드합니다. 다운로드한 소프트웨어 파일을 D 드라이브에 보관하십시오.
  6. 아래 설명된 대로 입력 파일을 준비합니다.
    1. NCBI 웹 사이트에서 fasta 형식의 scFv Pdb 파일을 로드하고 파일 이름을 TARGET.ali로 바꿉니다. 보충 코딩 파일 1에 설명된 바와 같습니다. NCBI의 Blast 섹션을 사용하여 템플릿을 선택하고, 시퀀싱된 파일을 붙여넣고, Supplementary Coding File 2에 설명된 대로 pdb 형식 7det.pdb를 선택한 다음 제출합니다. 그런 다음 pdb.org 웹 사이트를 사용하여 템플릿 파일을 가져옵니다.
    2. 보조 그림 3A와 같이 열리는 Supplementary Coding File 3에 설명된 대로 세 번째 입력 파일을 align2d.py(Python)으로 준비합니다. 더 보기 옵션을 누른 다음 IDLE로 편집 > EDLE(64비트)로 편집으로 이동합니다. align2d.py 에서 run module 5 명령을 사용하여 실행하여 Tar- 7det.ali 및 Tar- 7det.pap의 두 출력 파일을 가져옵니다.
  7. 이전 세 단계를 완료하여 마지막 입력 파일에서 명령을 사용합니다.
  8. Supplementary Coding File 4 및 아래 설명된 대로 새 입력 파일 model-single.py(명령 python 파일)을 추가합니다.
    1. 더 보기 옵션을 누른 다음 IDLE로 편집 > EDLE3.7(64비트)로 편집으로 이동합니다. 보충 그림 3B와 같이 (run module 5) 명령을 사용하여 실행합니다.
      참고: 결과 출력 파일은 보충 그림 3C에 표시된 상동성 모델의 6개 파일입니다.

3. 수용체 2차 구조 예측 및 평가

  1. 아래에 설명된 대로 상동성 모델의 보정과 정확도를 감지합니다.
    1. https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download 에서 시각화 툴을 다운로드하여 scFv 모델 및 EGFR 모델에 대한 Ramachandran 플롯을 만듭니다.
    2. 파일을 연 다음 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 표시 순서를 선택합니다(보충 그림 4). 시퀀스를 복사하여 3D 구조의 그림 데이터베이스(pdbsum) www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/ 에 붙여넣습니다.
    3. Search by sequence(시퀀스별 검색)를 선택하고 시퀀스 복사본을 붙여넣은 다음 제출합니다. 그림 1B,D와 같이 플롯을 만듭니다.

4. 단백질-단백질 도킹

  1. 가상 심사 도구 소프트웨어를 다운로드하십시오.
  2. 파일로 이동 하여> 분자를 읽고> 1ivo.pdb를 로드합니다. autodock 패널에서 단백질을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하여 거대분자를 만듭니다. 다시 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 리간드를 만듭니다(보충 그림 5).
  3. autodock 패널을 클릭하여 protein 을 선택한 다음 ligand를 선택합니다.
  4. 단백질 목록을 엽니다. 그런 다음 목록에서 scFv 단백질을 선택합니다.
  5. Toggle Selection Spheres(선택 구 토글)로 이동합니다. 그리드 상자를 수용체의 중심에 맞게 조정합니다. 동그란 분홍색 버튼이 나타나면 앞으로를 클릭합니다.
  6. scFv-antibody 및 EGFR (1ivo) 구조체 모두에 대해 pdbqt 파일을 준비하려면 다음 단계를 사용하십시오.
    1. C Drive > Program Files (86) > Users로 이동한 다음 pdbqt 파일로 저장된 거대분자 및 단백질 출력 파일이 포함된 pyrx 파일을 선택합니다.
    2. 그런 다음 single-chain fragment variable (scFv) 항체 pdbqt 파일을 저장합니다.
  7. PyMOL에서 PyMOL 소프트웨어 다운로드 | pymol.org. PyMOL 소프트웨어를 사용하여 scFv 항체-수용체 EGFR 구성을 보여줍니다.
    1. 파일로 이동하여 C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein을 엽니다. 아래 설명된 대로 그림 2A 의 수용체와 상호 작용하는 scFvantibody의 도킹 구성을 준비합니다.
      1. display 옵션을 사용하여 (1ivo)-수용체 파일을 보충 그림 6에 표시된 흰색 배경의 서열 잔기로 표시합니다.
      2. 도킹 구성 파일을 더 높은 해상도로 표시하여 리간드 색을 녹색과 빨간색 잔류 색상으로 확인합니다. (1ivo)-receptor rigid surface를 노란색으로 표시합니다.
  8. 아래 설명된 대로 그림 2B에서 수용체와 상호 작용하는 scFvantibody의 도킹 구성을 준비합니다.
    1. 창 선택 영역에서 도킹 소프트웨어를 다운로드합니다. Autodock을 사용하여 scFv 항체-수용체 EGFR 구성 및 구조를 표시합니다.
      1. Autodock에서 Analyze Option(분석 옵션)을 선택한 다음 Autodock Vina 결과를 엽니다. 파일로 이동하여 C:\Users\ilham\.mgltools\PyRx\Macromolecules\protein을 엽니다.
      2. 단백질 수용체 pdb 파일을 선택한 다음 리간드 구성 영역(scFv 항체 구조)을 선택합니다. 수용체의 단단한 표면을 도킹된 구조의 구성과 연결하고 나머지 수용체를 숨깁니다. 그림 2B와 같이 리간드에 연결된 잔기에서 수용체의 먼 잔기를 숨깁니다.
    2. 그런 다음 단백질-단백질 복합체를 MD 시뮬레이션을 수행할 준비가 된 것으로 간주했습니다.

5. EGFR-scFv 항체 도킹 복합체의 분자역학 시뮬레이션(MD 시뮬레이션)

  1. MD 시뮬레이션 소프트웨어를 다운로드하여 다음과 같이 사용하십시오.
    1. 보충 그림 7A와 같이 배상 마법사를 사용하여 EGFR(1ivo) pdb 파일을 준비합니다. 전처리 섹션을 조작하여 파일을 구체화합니다. 시스템 빌더에서 설정할 구체화된 파일을 보냅니다.
    2. 작업 디렉토리에서 분자 역학 시뮬레이션 소프트웨어를 로드합니다. 이온을 추가하고 정제된 파일을 업그레이드하여 작업을 제출하기 위해 20 Å에 도달합니다(표 1), 이는 보충 그림 7B에도 나와 있습니다.
    3. 가져온 파일에서 EGFR (1ivo) pdb를 로드한 다음 100ns 타임스텝을 선택하여 실행합니다(보충 그림 7C).
  2. 아래 설명된 대로 MD시뮬레이션을 완료한 후 시뮬레이션 분석을 시작합니다.
    1. 작업 폴더를 만들고 cms 파일에 저장합니다. cms 파일을 로드하여 MD 시뮬레이션에서 이 단계를 수행합니다.
    2. 프로젝트 폴더에 대한 작업 디렉토리를 작성하고 에너지 값을 보고합니다. S.I.D. pdf를 사용하여 그림 3A와 같이 시뮬레이션을 보고하고, 그림 3B와 같이 상호 작용 다이어그램과 H 결합을 보고합니다.
    3. 폴더에서 탐색하여 cms의 pdf 파일을 로드하고 TIP3P를 파일 볼륨 최소화 모델로 사용합니다.
    4. 보충 그림 7D에 표시된 이 단계를 수행하기 위해 용매 파일을 만듭니다. 소프트웨어를 통해 pdf 파일을 저장하고 데이터를 분석하여 그림 4, 그림 5 및 그림 6을 만듭니다.
  3. 해석 파일을 작성하여 MDsimulation 종료 설정을 생성합니다. 그림 7과 같이 경계 상자에서 결과를 찾습니다.

결과

파지 디스플레이 기술을 사용하여 마우스 B 세포 하이브리도마 계통 C3A8에서 scFv 유전자 anti-EGFR을 만들었습니다20,21. Chua et al.22에 따르면 VH 및 VL 구조의 scFv(single chain fragment variable) 구조 모델은 별도로 구축되었습니다. 그 후, 모델은 RasMol을 사용하여 생산된 리본으로 볼 수 있었습니다. 그런 다음 분자 모델링...

토론

EGFR은 유방암의 주요 표적 수용체입니다. EGFR 과발현은 전 세계적으로 유방암 발병을 증가시킵니다. 한편, 단쇄 단편 변수(single chain fragment variable)와 같은 특이적 항체는 혈액 순환을 통해 쉽게 이동하고 체내 제거율이 빠른 항체입니다. 항체는 현명한 해결책이자 효과적인 면역요법 약물이다37. 따라서 구조 기반 약물 설계는 표적 수용체(EGFR)에 특이적?...

공개

저자는 공개할 내용이 없습니다.

감사의 말

없음.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Autodock softwareCenter for Computational structural Biology AutoDock (scripps.edu)
Desmond Maestro 19.4 software Schrodingerwww.schrodinger.com 
Download Discovery Studio 2021  Dassault Systems https://discover.3ds.com/discovery-studio-visualizer-download.
Modeler Version 9.24[17] University of Californiahttps://salilab.org/modeller/9.24/release.html
Pictorial database of 3D structures (pdbsum)EMBL-EBI www.ebi.ac.uk/thornton-srv/databases/pdbsum/
PyMOL software SchrodingerPyMOL | pymol.org
Pyrx software Sourceforge Download PyRx - Virtual Screening Tool (sourceforge.net)
Python script 3.7.9 shell from the window (64)PythonPython Release Python 3.7.9 | Python.org
SPDBV software Expasyhttp://spdbv.vital-it.ch/disclaim.html

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