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요약

이 연구는 알츠하이머병과 같은 쥐에서 실 끼워넣기 침술 요법을 위한 프로토콜을 제시합니다.

초록

실 삽입 요법 (TEAT)은 생분해 성 봉합사를 경혈에 삽입하여 오래 지속되는 자극을 제공하여 질병을 예방하고 관리하는 치료법입니다. 젖꼭지는 정기적인 침술의 불편함을 피하고 지속적인 치료 효과를 제공하는 간단한 접근법입니다. 이 기사에서는 알츠하이머병과 유사한 증상을 가진 쥐의 학습 및 기억 능력에 대한 TEAT의 잠재적 영향에 대해 논의합니다. 쥐에서 화학적으로 유도된 신경 세포 퇴화와 인지 장애는 알츠하이머병에서 관찰된 진정한 병리학적 변화를 완전히 반영하지 않기 때문입니다. 이에 따라 우리 연구팀은 이러한 증상을 알츠하이머병과 유사한 증상으로 명명했습니다. 경혈의 선택, 수술 과정, 머리와 허리에 필요한 예방 조치를 설명하기 위한 프로토콜이 수립되었습니다. 실험은 대조군, 모델군, TEAT 그룹의 세 그룹으로 진행되었으며 각 그룹에는 6마리의 쥐가 포함되었습니다. 알츠하이머병과 유사한 증상을 유도하기 위해, 쥐에게 7주(49일) 동안 D-갈락토스를 복강내 주사하였다. 젖꼭지 그룹의 쥐는 경혈 캣거트 삽입 치료를 받았습니다. 개입 기간 후, 쥐의 학습과 기억력을 평가하기 위해 Morris Water Maze(MWM)가 수행되었습니다. 그 후, 쥐들을 제물로 바치고 그들의 뇌 조직을 검사하였다. 알츠하이머병의 증상을 보이는 쥐의 병리학에 대한 TEAT의 효과를 이해하기 위해 조직학적 검사를 수행했습니다. 이 연구는 TEAT가 알츠하이머병과 유사한 증상을 가진 쥐의 학습과 기억력을 향상시킬 수 있음을 시사하며, 이는 이 신경퇴행성 질환에 대한 잠재적으로 유망한 새로운 치료 접근 방식을 나타냅니다.

서문

실 삽입 침술(TEA)은 특수 바늘을 사용하여 캣거트 또는 흡수성 봉합사를 경혈에 삽입하는 것을 포함합니다. 이 기술은 봉합사가 흡수되고 분해될 때까지 장기간의 효과가 있습니다. 일주일이상 경혈에 지속적이고 지속적인 자극을 제공하여 1 매일 반복적인 시술을 할 필요 없이 비슷한 결과를 얻을 수 있습니다2. 이로 인해 치료를 받으려는 환자의 수가 줄어들어 의료 자원을 어느 정도 절약할 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 TEAT는 내과, 외과, 피부과, 안면 특징, 산부인과, 소아과 등 중국의 다양한 의료 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다3. 연구에 따르면 간질4 및 안면 신경 마비5와 같은 특정 만성 및 복합 질환에 대해 장기적이고 신뢰할 수 있는 효과를 내는 데 효과적이다. 그것은 최소한의 외상과 간단한 조작의 장점이 있습니다6. 또한 TEAT의 치료 비용은 전기 침술(EA)보다 낮은 것으로 보고되었습니다7. 따라서 TEAT는 임상 및 과학 연구에서 점점 더 가치가 높아지고 있습니다.

알츠하이머병(AD)은 시간이 지남에 따라 진행되는 신경 퇴행성 질환입니다. 병태생리학적 과정은 임상적 증상이 나타나기 약 20년 전부터 축적되기 시작하지만, 그 기전은 아직 완전히 밝혀지지 않았다8. 알츠하이머병에 효과적인 약물의 가용성이 제한됨에 따라, 연구는 점점 더 알츠하이머병의 전구 및 전임상 단계에 초점을 맞추고 있다9. 예방은 AD 9,10년의 발병과 진행을 다루기 위한 중요한 전략이다. 최근 몇 년 동안 중국 전통 의학(TCM)은 상당한 발전을 이루었으며 AD11,12를 예방하고 치료하는 새로운 가능성을 제공할 것으로 기대됩니다. 침술의 하위 유형인 TEAT는 치료 범위가 넓고, 외상이 적으며, 조작이 간단하고, 치료 빈도가 낮고, 효능이 오래 지속되기 때문에 다른 치료법보다 선호된다6. 최근 문헌에 따르면 TEAT는 비만13,14, 당뇨병15, 불면증16, 폐경 후 골다공증17, 우울증18 등 알츠하이머병의 위험 요인이 있는 환자에게 도움이 될 수 있다고 한다. 또한 미토파지2를 조절하여 노화 쥐의 노화를 개선하고, 공간 학습 및 기억 장애를 개선하며, 해마의 병리학적 손상을 완화하고, 혈관성 치매(VD) 쥐의 염증 반응을 억제한다19. TEAT가 알츠하이머병 중 병리학적 과정에도 작용할 수 있는지 여부를 파악하는 것이 매력적으로 보였습니다.

현재 연구는 임베딩 방법, 임베딩 도구, 스레드 및 임베딩 간격 기간을 포함하여 TEAT 작동의 몇 가지 중요한 요소에서 균일성과 표준화가 부족합니다. 이러한 표준화의 부족은 치료의 효과에 대한 평가와 관련 메커니즘의 탐색에 영향을 미치고 외부 홍보 및 의사 소통을 제한합니다. 선행 연구20,21은 D-갈락토스(D-gal)의 복강내 투여가 쥐에서 신경 세포 퇴행 및 인지 장애를 포함한 알츠하이머병과 유사한 병리학적 변화를 유도할 수 있음을 입증했습니다. 또한, Baihui(GV20) 및 Shenshu(BL23)의 전기 침술은 인지 기능 저하를 효과적으로 개선하고 신경 염증을 완화하며 신경 세포 손상을 줄이는 것으로 나타났습니다. 본 연구는 알츠하이머병과 유사한 모델 쥐를 예로 들어 이 모델에 따른 경혈의 선택과 TEAT의 작동 과정 및 주의사항을 소개한다. 향후 연구를 위한 참고 자료를 제공하기 위해 실험 연구에서 TEAT의 중요한 운영 요소에 대해 논의합니다.

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프로토콜

모든 실험은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었으며, 후베이성 질병통제예방센터(Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention) 실험동물 관리 및 사용 위원회(Hubei Provincial Center for Disease Control and Prevention Laboratory Animal Management and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 체중이 220-250g인 3개월 된 암컷 Sprague-Dawley(SD) 쥐 총 18마리가 시험에 사용되었습니다. 모든 쥐는 23± 1°C 및 40%-50% 습도에서 12시간 밝음/어두운 주기로 유지되었으며 음식과 물에 자유롭게 접근할 수 있었습니다. 1주일간의 적응 기간을 거친 후, 쥐들이 실험실 환경에 적응하도록 허용한 후, 실험이 시작되었다.

1. 모델 개발

  1. 실험 설계는 그림 1과 같습니다. 체중이 220-250g인 Sprague-Dawley 3개월 된 암컷 쥐 18마리를 무작위로 대조군, 모델링 그룹, 젖꼭지 그룹으로 나눕니다. 각 그룹은 6 마리의 쥐로 구성됩니다.
  2. 모델군과 젖꼭지군에 D-갈락토오스(D-gal; 120mg/kg/일)를 매일 주사하고, 대조군은 7주(49일) 동안 하부 복부 부위에 식염수 주사(120mg/kg/일)를 투여한다22. 주사는 매일 오전 8:00에서 9:00 사이에 투여해야 합니다.
  3. 매주 7일 오전 9:00에서 10:00 사이에 쥐의 무게를 잰다. 실험은 49일 동안 지속되었습니다. 14일마다 14일, 28일, 42일에 실을 묻습니다. 각 스레드 임베딩의 시간을 오전 9:00-12:00 사이로 수정합니다.
  4. 쥐에서 알츠하이머병 관련 병리학적 징후를 유도하기 위해 7주 동안 D-갈락토오스의 복강 내 투여를 계속합니다22.

2. 젖꼭지 준비

  1. 안과 가위, 쟁반, 핀셋과 같은 수술 기구를 소독하고 소독합니다. 수술실 환경의 표면을 철저히 청소하고 소독하십시오.
  2. 작은 동물 가열 패드를 표면에 평평하게 놓고 멸균 수건으로 드레이핑하여 수술 플랫폼을 준비합니다. 그런 다음 청소 및 소독한 작동 보드를 거친 면이 위를 향하도록 하여 위에 부드럽게 놓습니다. 그런 다음 가열 패드를 켜고 온도를 32°C로 설정합니다.
  3. 시술은 직경 0.6mm의 일회용 실 매매 바늘 6 호와 길이 2cm의 5-0 흡수성 수술 봉합사 (콜라겐 봉합사)를 선택합니다. 2cm 5-0 흡수성 수술용 봉합사를 안과 가위를 사용하여 0.5cm와 0.2cm 조각으로 자릅니다. 자른 실을 0.9% 식염수에 담그고 따로 보관합니다.
  4. 비누와 물로 20초 동안 손을 씻은 다음 말리십시오. 그 후에는 멸균 장갑을 착용하십시오.
  5. 쥐를 하부 복부 부위에 클로랄 수화물(300mg/kg)의 IP 주사로 마취하고, 발가락 꼬집기 검사에서 반응이 없어 수술 평면에서 동물이 반응이 없을 때 마취를 확인하고 안정적인 생리 상태를 유지하도록 합니다. 또한 쥐가 마취 중인 동안 각막 건조와 잠재적인 손상을 방지하려면 눈에 수의학 연고를 넉넉히 바르고 시술 내내 윤활 상태가 유지되도록 합니다.
    알림: 쥐가 피어싱을 경험하는 것이 고통스러우므로 쥐를 마취하는 것이 좋습니다.

3. Baihui (GV 20)를 위한 실 끼워넣기 가동

  1. 쥐의 경혈 Baihui(GV 20)를 두정골의 오른쪽 중간 지점에서 찾습니다(그림 2A). 쥐가 머리를 완전히 노출되도록 배치하고 귀를 앞으로 당겨 인간이 귀 정점 선을 연결하는 데 사용하는 방법을 비슷하게 만듭니다. 두개골의 중앙 세로 융기를 촉진하고 대략 중간 지점의 위치를 정확히 찾아내어 Baihui(GV 20) 점을 식별합니다. 시상 봉합사와 두정골의 교차점과 정렬되도록 평평하게 놓았을 때 귀가 머리와 접촉하는 수준에서 이 경혈을 더 확인하십시오. 마커를 사용하여 Baihui (GV 20)를 표시하십시오.
  2. 트리머(보통 전기 남성용 수염 트리머)를 사용하여 쥐의 경혈 주변의 머리 부분을 면도합니다.
  3. 수술 전에 0.5% 요오드 용액을 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 도포하여 경혈과 주변 피부를 소독합니다. 그 후, 삼중 소독 과정을 수행하십시오 : 요오드를 3x 사용한 다음 알코올을 도포하여 적절한 오염 제거를 보장하고 무균 기술을 위해 현장을 준비합니다.
  4. 겸자를 사용하여 식염수에 적신 0.2cm의 흡수성 수술용 봉합사를 집어내고 바늘관의 앞쪽 끝에 놓습니다. 그런 다음 바늘 코어에 연결하십시오.
  5. 한 손에는 엄지와 검지로 Baihui(GV 20) 주변을 집고 다른 손으로는 바늘을 잡습니다.
  6. 피부를 꼬집으면서 Baihui(GV 20) 지점에서 15cm 아래 피부 표면에 대해 0.1° 각도로 바늘을 수평으로 빠르게 삽입합니다(그림 3A).
  7. 바늘 끝이 Baihui(GV 20) 지점에서 0.1cm 위에 도달한 후 바늘 튜브를 집어넣으면서 바늘 코어를 밀어 0.2cm 흡수성 수술용 봉합사를 경혈의 피하 조직에 완전히 이식합니다(그림 3B).
  8. 봉합사가 노출되지 않도록 바늘을 천천히 제거합니다. 출혈을 방지하기 위해 멸균 마른 면포로 바늘 구멍을 10초 동안 누릅니다. 경혈에 라인을 삽입 한 후 실이 몸 밖으로 나오면 빼내고 다시 수술하십시오.

4. Shenshu (BL 23)에 대한 스레드 임베딩 작업

  1. 쥐의 경혈 Shenshu (BL 23)는 제2 요추 에서 5mm 측면에 위치합니다 (그림 2B). 먼저 쥐의 고관절 결절을 기준으로 6번째 요추를 찾습니다. 그런 다음 4개의 척추체를 위쪽으로 세어 2번째 요추를 찾습니다. Shenshu (BL 23)는23 개의 측면에서 5mm입니다.
    참고: Baihui(GV 20)와 Shenshu(BL 23) 경혈의 조합은 뇌 질환의 예방 및 치료를 위해 중국 전통 의학(TCM) 이론에서 자주 사용되는 세트입니다. 이전 연구20,21에 의해 확인된 바와 같이, 이 경혈 쌍은 그 효능을 위해 확립되었습니다.
  2. 마커를 사용하여 Shenshu(BL 23)를 표시합니다. 트리머(일반적으로 전기 수염 트리머)를 사용하여 쥐의 경혈 주변의 등과 허리 부분을 면도합니다.
  3. 수술 전에 0.5% 요오드 용액을 중앙에서 시작하여 바깥쪽으로 원을 그리며 도포하여 경혈과 주변 피부를 소독합니다. 그 후, 삼중 소독 과정을 수행하십시오 : 요오드를 세 번 사용한 다음 알코올을 도포하여 적절한 오염 제거 및 무균 기술을위한 현장 준비를 보장합니다.
  4. 겸자를 사용하여 식염수에 적신 0.5cm의 흡수성 수술용 봉합사를 집어내고 바늘관의 앞쪽 끝에 놓습니다. 그런 다음 바늘 코어에 연결하십시오.
  5. 누르는 손의 검지와 중지 또는 엄지와 검지로 피부를 스트레칭합니다. 구멍을 뚫은 손으로 바늘을 잡습니다.
  6. 바늘을 Shenshu (BL 23) 아래 0.25cm 지점에 수직으로 빠르게 삽입합니다. 그림 4A를 참조하십시오.
  7. 바늘 끝이 피부 아래 0.5cm에 도달한 후 바늘 끝을 조정하여 삽입 방향을 구심성으로 만들고 피부 표면과 45° 각도를 형성하고 0.5cm를 비스듬히 삽입합니다(그림 4B).
    알림: 신장 근처에 위치한 Shenshu(BL 23)를 바늘로 꿰맬 때 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 바늘을 깊게 삽입하거나 반복적으로 들어 올리고 찌르면 손상될 수 있습니다. 따라서 약 0.3-0.6cm의 삽입 깊이를 권장합니다.
  8. 튜브를 집어넣으면서 바늘 코어를 밀어 넣고 0.5cm 흡수성 수술용 봉합사를 경혈의 경혈 근육 조직에 완전히 이식합니다(그림 4C).
  9. 봉합사가 노출되지 않도록 바늘을 천천히 빼냅니다. 그런 다음 멸균 건조면으로 바늘 구멍을 10초 동안 눌러 출혈을 방지합니다. 경혈에 라인을 삽입 한 후 실이 몸 밖으로 나오면 빼내고 다시 수술하십시오.

5. 수술 후 관리

  1. 수술 후에는 마취 회복을 용이하게 하기 위해 32°C의 온도로 설정된 작은 동물 가열 패드에 쥐를 놓습니다. 동물을 주거 우리로 돌려보내기 전에 동물이 완전히 의식이 있고 상태가 만족스러운지 확인하십시오.
  2. 수술 후 일주일 이내에 환부에서 멸균 염증 반응의 징후를 관찰하십시오. 이러한 징후에는 발적, 부기 또는 고름 같은 분비물이 포함될 수 있습니다. 일반적으로 이러한 증상은 치료가 필요하지 않습니다. 그러나 삼출액의 양이 과도하면 환부를 배출하고 소독하십시오. 이런 경우에는 상처가 완전히 회복될 때까지 에리스로마이신 연고를 바르십시오.

6. 행동 검사 및 조직학적 검사

  1. 개입 후 8주차에 MWM(Morris Water Maze) 실험 2,24를 수행하여 학습 및 기억 능력을 평가합니다. 하루에 4번의 시도로 5일에 걸쳐 학습 시도를 수행합니다. 그런 다음 마지막 취득일로부터 24시간 후에 프로브 시험을 시행합니다.
  2. 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 통계 비교를 수행합니다. 일원 분산 분석(ANOVA) 및 사후 Tukey의 테스트를 통해 학습 능력의 행동 데이터를 분석합니다. 양방향 ANOVA(Repeated Measure Analysis of Variance)를 통해 이스케이프 대기 시간 데이터의 유의성을 평가한 후 사후 Bonferroni 테스트를 수행합니다. p <0.05 값은 모든 테스트에서 유의한 것으로 간주됩니다.
  3. 행동 평가 후 위와 같이 쥐를 마취하고 펜토바르비탈 나트륨 150mg/kg 체중의 복강 내 주사로 안락사시킵니다.
  4. 혈관계25를 통해 관류되는 4% 파라포름알데히드를 사용하여 관류를 통해 쥐의 뇌를 고정합니다.
    1. gavage 바늘의 삽입 및 고정
      1. 12G 바늘을 준비하고 바늘이 곧고 쥐의 심실을 통과하기에 적합한지 확인하십시오. 일반적으로 좌심실인 쥐의 심실을 찾아 바늘을 통해 상행 대동맥에 삽입합니다. 이 단계는 쥐의 해부학적 구조에 대한 정밀함과 충분한 이해가 필요합니다.
      2. 바늘이 제자리에 놓이면 지혈제를 사용하여 대동맥에 들어가는 지점 근처에 주사 바늘을 고정합니다. 이렇게 하면 바늘을 고정하고 바늘이 움직이는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다.
      3. 클램프가 바늘을 단단히 고정할 수 있을 만큼 충분히 조여졌지만 대동맥을 손상시키거나 혈류를 방해할 정도로 조여서는 안 됩니다. 위침은 적절한 관류를 유지하기 위해 시술 내내 상행 대동맥에 남아 있어야 합니다.
    2. 생리식염수를 사용한 관류
      1. 관류를 위해 바늘이 없는 50cc 주사기를 준비합니다. 쥐의 몸 밖에 있는 개비젓 바늘의 다른 쪽 끝을 생리식염수로 채워진 주사기에 부착합니다.
      2. 심장에서 혈액이 흐를 수 있도록 오른쪽 심방 부속기를 약간 절개합니다. 이 단계는 관류 중에 혈액이 식염수로 대체되도록 합니다.
      3. 상행 대동맥에 생리 식염수를 일정하고 일정한 속도로 주입하기 시작합니다. 이렇게 하면 혈액이 씻겨 나가고 조직이 고정될 준비가 됩니다.
      4. 우측 심방 부속기에서 나오는 액체를 모니터링하고 신선한 식염수로 지속적인 관류를 유지하기 위해 필요에 따라 주사기를 교체할 준비를 합니다.
        배치하고 정착액으로 관류할 준비를 합니다.
      5. 식염수가 함유된 주사기를 조직학에서 일반적으로 사용되는 정착제인 4% 파라포름알데히드가 함유된 주사기로 교체합니다. 파라포름알데히드를 사용하여 관류를 진행하여 후속 처리 및 분석을 위해 조직을 제자리에 고정합니다.
        참고: 이 절차 전반에 걸쳐 감염을 예방하기 위해 무균 기술을 유지하고 부상을 최소화하기 위해 쥐를 부드럽게 다루는 것이 중요합니다. 또한 일관성과 효율성을 보장하기 위해 관련된 모든 직원에게 이 기술에 대한 교육을 받아야 합니다.
  5. 쥐의 뇌를 제거하고 4 ° C에서 24-48 시간 동안 4 ° C25,26 동안 4 % 파라 포름 알데히드가 들어있는 표본 병에 넣으십시오. 에탄올 탈수 및 크실렌 처리를 단계별로 수행한 다음 측정을 위해 기존의 연속 코로나 절편(4-5μm)을 수행합니다. Hematoxylin 및 Eosin(H&E) 염색(200x)을 사용하여 각 그룹에서 해마 뉴런의 형태 및 손실을 평가합니다.
    참고: 위장관(GI) 병변을 평가하기 위한 부검 검사는 실험 기간 동안 위장 장애를 나타내는 임상 징후가 없다는 이유로 설치류에 대해 수행되지 않았습니다. 동물은 그러한 병리의 존재를 암시하는 명백한 부작용을 나타내지 않았다.

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결과

이 기사에서는 알츠하이머병 유사 쥐에서 TEAT의 특정 작동 방법을 소개합니다. 향후 연구를 위한 참고 자료를 제공하기 위해 실험 연구에서 TEAT의 중요한 운영 요소에 대해 논의합니다.

TEAT는 알츠하이머병 유사 쥐의 학습을 향상시킵니다.
순서도(그림 5)에서 볼 수 있듯이 적응 훈련 기간 동안 각 그룹의 쥐가 수영하는 동안 주변 환경을 ?...

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토론

개입 시간
알츠하이머병의 병인은 복잡하며, 발병 기전은 여전히 불확실합니다. 현재로서는 이 병에 대한 효과적인 치료법이 없으며, 병의 경과는 돌이킬 수 없습니다. 따라서 학계에서는 알츠하이머병의 예방과 치료에 초점을 맞추는 것이 중요하다는 데 의견이 일치하게 되었습니다. 알츠하이머병의 예방 및 치료 전략은 조기 개입을 강조하며, 상태가 발생하기 전에 치료한다는 ?...

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공개

저자는 공개할 것이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China, NSFC) Nos. 82374564(YJD에) 및 Nos. 82074566(YJD에)와 중국 우한에 있는 세계침술뜸학회연맹(World Federation of Acupuncture-Moxibustion Societies)의 TCM 침술-뜸을 위한 Sun Guojie Inheritance Base(세계침술-뜸 학회 연맹(World Federation of Acupuncture-Moxibustion Societies [2019] No. 26)(YJD에)와 중국 국립한의약관리국(National Famous TCM Inheritance Studio)의 자금으로 지원되었습니다. 중국(중국 전통 의학국[2022], No. 5) (YJD에).

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% saline, 4% paraformaldehyde, Hematoxylin, Eosin Y (water-soluble), absolute ethanol, 0.01M PBS powder, xylene, hydrochloric acid, embedded paraffin, neutral gumsinopharm (www.sinopharm.com)
5-0 absorbable surgical suturebodamedical (www.bodamedical.com)
70% alcohol, iodophor, cotton ballUsed for disinfection.
chloral hydratesigmaC8383
coverslips, glass slidesGuangzhou Wuqiang Experimental Equipment Co., Ltd
DehydratorWuhan Junjie JT-12J Computerized Biological Tissue Dehydrator
DELUXE THERMOSTAT HEAT MATZhenhua InstrumentsFor maintaining the body temperature of rats.
D-galactosesigmaG0750
electric men's beard trimmerUsed for shaving rats.
Electronic scale for small animals (ZK-DST)Henan Zhike Information Technology Co., Ltd
erythromycin ointmentfrontpharm
glass dishUsed to place cut absorbable sutures.
High-Pressure Steam Sterilization Pot (YM100Z)Shanghai Sanshen medical equipment factoryFor sterilization of surgical instruments.
Ice Maker (CMB40)Shanghai Sheyan Instrument Co., Ltd.
Microscope (BX-53)OLYMPUS
milk powderUsed for the MWM test.
Morris Water Maze Video Tracking System & Data Analysis Software (Version: Watermaze 2.0)Chengdu Taimeng Technology Co., Ltd
No.6 thread-embedding needlebodamedical (www.bodamedical.com)
ophthalmic scissors, trays, tweezers
Pathology Microtome  (RM 2016)LEICA, Germany
pentobarbitalGermanyP11011
permanent markerUsed to mark the acupoint.
Slicing knives (R35)Feathers, Japanese
soapUsed to wash hands.
sterile gloves

참고문헌

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