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요약

이 원고는 백내장 및 후낭 혼탁(PCO)에 대한 재현성을 개선하고 연구를 지원하는 것을 목표로 하는 1차 수정체 상피 세포(LEC) 배양을 위한 자세한 비디오 프로토콜을 간략하게 설명합니다. 렌즈 박리, LEC 분리 및 검증에 대한 단계별 지침을 제공하며, 특히 이 분야의 초보자에게 귀중한 가이드 역할을 합니다.

초록

수정체 상피세포(LEC)는 수정체의 항상성과 정상적인 기능을 유지하는 데 여러 가지 중요한 역할을 합니다. LEC는 렌즈의 성장, 발달, 크기 및 투명도를 결정합니다. 반대로, LEC의 기능 장애는 백내장 형성 및 후낭 혼탁(PCO)으로 이어질 수 있습니다. 따라서 강력한 1차 LEC 배양 시스템을 구축하는 것은 수정체 개발, 생화학, 백내장 치료제 및 PCO 예방에 종사하는 연구자에게 중요합니다. 그러나 1차 LEC를 배양하는 것은 제한된 가용성, 느린 증식 속도 및 섬세한 특성으로 인해 오랫동안 어려움을 겪어 왔습니다.

이 연구는 1차 LEC 배양을 위한 포괄적인 프로토콜을 제시함으로써 이러한 장애물을 해결합니다. 이 프로토콜은 최적화된 배양 배지의 제형화, 렌즈 캡슐의 정확한 분리, 트립신화 기술, 하위 배양 절차, 수확 프로토콜, 보관 및 배송 지침과 같은 필수 단계를 포함합니다. 배양 과정 전반에 걸쳐 위상차 현미경을 사용하여 세포 형태를 모니터링했습니다.

배양된 LEC의 진위를 확인하기 위해 면역형광 분석을 수행하여 중요한 수정체 단백질, 즉 αA- 및 γ-결정체의 존재 및 세포 내 분포를 검출했습니다. 이 상세한 프로토콜은 연구자들에게 일차 LEC를 배양하고 특성화하는 데 유용한 자원을 제공하여 수정체 생물학에 대한 이해와 수정체 관련 질환에 대한 치료 전략 개발을 가능하게 합니다.

서문

눈의 수정체는 들어오는 빛을 망막에 집중시킴으로써 시력에 중요한 역할을 합니다. 이 세포는 특수 세포로 구성된 투명한 무혈 구조로 구성되어 있으며, 그 중 수정체 상피 세포(LEC)가 핵심 역할을 합니다. LEC는 수정체의 전면에 위치하며 수정체의 투명성을 유지하고, 수분 균형을 조절하며, 수정체의 성장과 발달에 관여하는 역할을 합니다 1,2. LEC는 수정체의 앞쪽에 위치한 독특한 유형의 세포로, 평생 동안 수정체 섬유를 지속적으로 생산하여 수정체의 선명도와 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.

백내장은 수정체가 점진적으로 흐려져 빛의 왜곡과 산란을 일으켜 시력을 손상시키는 것이 특징입니다 3,4. 백내장 형성의 기초가 되는 정확한 메커니즘은 복잡하고 다인자적이며, 자외선, 산화 손상 및 당화와 같은 다양한 세포 및 분자 과정을 포함합니다 5,6. LEC는 백내장의 발병에 크게 기여하는 것으로 밝혀져 연구의 중요한 초점이 되고 있습니다 1,2,7,8,9.

또한 오늘날 안과에서 가장 시급한 문제 중 하나는 이차성 백내장이라고도 하는 후낭 혼탁(PCO)의 발생률이 상대적으로 높다는 것입니다. 다낭성 난소 증후군은 백내장 수술 후 가장 흔한 합병증으로, 수술 후 5년 이내에 성인 환자의 최대 20-40%, 소아 환자의 100%에 영향을 미친다10. PCO는 주로 백내장 적출 후 수정체 주머니에 남아 있는 잔류 LEC에 의해 발생합니다. 이 세포들은 상피에서 중간엽으로의 전이(EMT)뿐만 아니라 LEC에서 수정체 섬유로의 분화를 포함하는 다면적인 병태생리학적 변형을 겪으며, 그 결과 LEC, 섬유 및 근섬유아세포가 혼합된 세포 집단이 생성됩니다 11,12,13. 형질전환된 세포는 수정체 후낭을 가로질러 증식하고 이동하여 시각 장애를 일으킵니다. 배양 모델에서 LEC의 행동 및 제어 메커니즘을 이해하면 PCO의 예방 및 관리에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 따라서 LEC를 배양하는 이 프로토콜은 이 만연한 수술 후 합병증을 연구, 이해 및 궁극적으로 퇴치하는 것을 목표로 하는 안과 연구자에게 중요한 도구를 제공합니다.

LEC 생물학의 복잡성과 백내장 형성 및 PCO에서의 LEC 생물학의 역할을 밝히기 위해서는 견고하고 재현 가능한 in vitro 1차 세포 배양 시스템을 구축하는 것이 필수적입니다. 1차 LEC 배양은 연구자에게 LEC의 기능, 신호 전달 및 분자 특성을 연구할 수 있는 통제된 환경을 제공합니다. 또한 세포 과정과 다양한 실험 조건의 영향을 조사할 수 있어 수정체 생리학 및 병리학에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다.

선행 연구는 LEC 배양 기법에 대한 우리의 이해를 풍부하게 했다 14,15,16,17,18,19,20. 이러한 연구는 다양한 방법론을 사용하고 LEC 행동 및 특성에 대한 중요한 결과를 도출했지만 LEC 배양을 위한 포괄적이고 접근 가능한 비디오 녹화 프로토콜은 현재 문헌에 없습니다. 이러한 제한은 초보 연구자가 기술을 정확하게 재현하는 데 방해가 될 수 있으며 실험 결과의 불일치 및 변동으로 이어질 수 있습니다. 이 연구 논문은 비디오 녹화 프로토콜을 제공함으로써 이러한 격차를 해소하고 LEC 문화 분야에서 재현성을 높이고 지식 전달을 촉진할 수 있는 표준화된 리소스를 제공하는 것을 목표로 합니다.

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프로토콜

모든 동물 실험은 안과 및 시력 연구에서 동물 사용에 대한 시력 및 안과 연구 협회 지침에 따라 수행되었습니다. 절차적 승인은 University of North Texas Health Science Center Animal Care and Use Committee(프로토콜 번호: IACUC-2022-0008)에서 부여했습니다. 일반적으로 생후 2주 미만의 어린 C57BL/6J 마우스가 이 연구에 사용되었습니다.

1. 배양액 준비 및 수정체 해부

  1. 50mL의 소 태아 혈청(FBS)과 0.1mL의 겐타마이신 50mg/mL를 DMEM 450mL에 첨가하여 배양 배지를 준비합니다.
  2. 2주 미만의 C57BL/6J 마우스를 인도적으로 안락사시킵니다.
    참고:CO2 흡입 방법을 사용하여 안락사시켰습니다. CO2 안락사 시스템의 최적 유속은 챔버 또는 케이지 부피/분의 30%에서 70%를 변위시켜야 합니다.
  3. 수술용 가위로 눈꺼풀을 부드럽게 제거하고 눈구멍의 반대쪽에 구부러진 핀셋으로 섬세한 압력을 가하여 눈이 바깥쪽으로 튀어나오도록 합니다. 백내장 칼을 사용하여 각막을 조심스럽게 절개하고 구부러진 핀셋을 사용하여 수정체를 조심스럽게 빼내어 수정체나 캡슐이 손상되지 않도록 합니다.
    알림: 렌즈 캡슐의 무결성을 유지하기 위해 이 단계를 수행하는 동안 주의하십시오. 렌즈의 섬세한 특성으로 인해 렌즈 손상 위험을 최소화하기 위해 끝이 구부러지고 뭉툭한 해부 도구를 사용하는 것이 중요합니다.
  4. 끝이 뭉툭한 곡선형 핀셋을 사용하여 10μg/mL 겐타마이신이 함유된 5mL의 예열 및 멸균 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 용액으로 채워진 60mm 플라스틱 조직 배양 접시에 렌즈를 옮깁니다.
  5. 10μg/mL 겐타마이신이 함유된 DPBS 용액으로 렌즈를 부드럽게 헹구어 잠재적인 이물질이나 오염 물질을 제거하고, 추가 처리를 위해 렌즈를 준비하고, 멸균 배양 환경을 유지합니다.
  6. 적절한 수의 LEC를 얻으려면 24-well 배양 플레이트에 4개의 렌즈를 풀링하고 6-well 배양 플레이트에 6개의 렌즈를 풀링합니다.

2. LEC 격리

  1. 헹굼 과정이 끝나면 렌즈를 여과지 위에 올려 건조시킵니다.
  2. 렌즈가 충분히 건조되면 렌즈 캡슐 제거를 준비하기 위해 페트리 접시의 덮개에 조심스럽게 옮깁니다.
  3. 렌즈를 위쪽으로 돌려 앞쪽 부분이 위쪽을 향하도록 합니다. 핀셋을 사용하여 전방 캡슐을 잡는 동안 주로 사용하는 손에 캡슐 헥시스 겸자를 사용하여 캡슐에 작은 찢어짐을 만듭니다. 두 도구를 반대 방향으로 부드럽게 당겨 캡슐을 제거하고 모든 수정체 박리가 완료될 때까지 DPBS에 넣습니다.
    참고: 불일치를 피하기 위해 연구자들은 각 수정체 상피 캡슐을 즉시 절개하고 DPBS에 임시로 보관해야 합니다. 모든 해부를 완료한 후에만 캡슐을 37°C로 유지되는 트립신으로 집합적으로 옮겨 동기화되고 균일한 노출을 보장합니다.
  4. 렌즈 캡슐을 6웰 플레이트에 조심스럽게 옮깁니다. 각 웰에 0.05% 트립신 용액 1mL를 추가하여 효소 분해 과정을 시작합니다.
  5. 트립신 용액을 부드럽게 저어 균일한 투과를 보장합니다. 플레이트를 세포 배양 인큐베이터에 넣고 캡슐을 37°C에서 8-10분 동안 분해합니다.
    참고: 이 단계는 수정체 캡슐 조직의 분해와 개별 상피 세포의 후속 방출을 용이하게 합니다.
  6. 배양 후 소화된 수정체 캡슐을 해부 가위를 사용하여 조심스럽게 다져 남아 있는 조직 덩어리를 분해하고 세포 분리를 촉진합니다.
    참고: 소화된 렌즈 캡슐에서 효율적인 세포 방출을 보장하기 위해 조직 다질의 철저함이 강조됩니다.
  7. 트립신을 담금질하기 위해 10% FBS가 함유된 배양 배지 0.5mL를 추가합니다. 조직 샘플을 원심분리 튜브로 옮기고 1,000× g 의 속도로 5분 동안 원심분리합니다.
  8. 세포 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하십시오. 1mL의 배양 배지를 사용하여 세포를 재현탁시키고 24웰 플레이트에 세포를 시드합니다.
  9. 배양 배지는 2-3일마다 교체합니다.

3. LEC 서브컬쳐

  1. 세포가 합류하면 배양 접시에서 배지를 제거합니다. 1mL의 DPBS로 세포를 2번 세척합니다.
  2. 200μL의 트립신-EDTA 용액을 넣고 세포를 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
  3. 배양 후 인큐베이터에서 세포를 제거하고 현미경으로 검사하여 배양 접시에서 분리되어 부유하기 시작했는지 확인합니다.
  4. 배양 배지 1mL를 추가하고 세포를 3-5배 부드럽게 피펫팅하여 모든 세포를 분리합니다.
  5. 세포를 원심분리 튜브로 옮기고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  6. 상층액을 조심스럽게 제거하고 완전한 성장 배지에 세포를 재현탁시킵니다.
  7. 필요한 경우 혈구계를 사용하여 세포 수를 계산합니다.
  8. subculturing 목적을 위해 세포 현탁액을 1:2 또는 1:3 비율로 세분화합니다.
  9. 문화권이 다시 합류하면 앞서 언급한 절차를 반복합니다.
    참고: LEC는 고밀도 배양 조건에서 번성합니다. 세포를 과도하게 희석하면 세포의 성장을 방해할 수 있으므로 피하십시오.

4. 저장 및 선적

알림: 저장을 위한 이상적인 셀 번호는 ~1 × 106입니다.

  1. 1mL의 DPBS로 세포를 3배 철저히 세척합니다. 세척 후 트립신-EDTA 용액 1mL를 넣고 세포를 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
  2. 2mL의 완전 배양 배지를 추가하고 세포 현탁액을 원심분리 튜브에 옮기고 1,000× g 에서 5분 동안 원심분리합니다.
  3. 상층액을 버리고 90% FBS 및 10% DMSO로 구성된 냉동 배지에 세포를 재현탁시켜 세포 밀도를 1 × 106 cells/mL로 목표로 합니다. 세포 현탁액을 cryovial로 옮깁니다.
  4. 즉시 세포를 -20°C 환경으로 1시간 동안 이동한 다음 밤새 -80°C로 이동한 후 액체 질소에 영구적으로 보관합니다.
    알림: 액체 질소를 사용할 수 없는 경우 셀은 -80°C에서 처음 한 시간 후에 -20°C에서 저장할 수 있습니다.
  5. 배송이 필요한 경우, 익일 배송을 위해 드라이아이스와 함께 크라이오비얼의 세포를 패키지에 담아 배송하십시오.
  6. 세포를 수령하면 신속한 회복을 보장하고 세포를 하위 배양에 넣습니다. 즉각적인 배양이 불가능한 경우 세포를 액체 질소로 옮겨 장기간 보관합니다.
    알림: 셀을 배송해야 하는 경우 samples는 온도 변화로 인한 잠재적인 손상을 방지하기 위해 드라이아이스에 깊숙이 묻혀 있습니다.

5. LEC 검증

  1. 커버 유리를 사용하여 LEC를 35mm 배양 접시에 담고 약 48시간 동안 배양합니다.
  2. PBS로 세포를 2배 세척하고 -20°C에서 10분 동안 차가운 메탄올로 세포를 고정합니다.
  3. 고정 세포를 PBS로 3 x 5분 동안 세척하고 비특이적 결합을 방지하기 위해 실온에서 차단 완충액으로 고정 세포를 1시간 동안 배양합니다.
  4. 차단 후 희석제 완충액에 1:50 비율로 개별적으로 희석한 1차 항체(αA-crystallin, γ-crystallin 및 PROX1 항체)를 사용하여 4°C에서 밤새 세포를 배양합니다.
  5. PBS로 세포를 3 x 5분 동안 세척하고 2차 항체를 희석제 완충액에 1:100으로 희석하여 1시간 동안 배양합니다.
  6. PBS로 세포를 3 x 5분 동안 세척하고 PBS에서 5μg/mL Hoechst 33342로 실온에서 10분 동안 세포를 염색하여 핵을 시각화합니다.
  7. PBS로 세포를 2 x 5분 동안 세척하여 과도한 염색 용액을 제거하고 핵용 DAPI 채널과 αA-, γ-결정질 및 PROX1용 FITC 채널을 사용하는 형광 현미경을 사용하여 세포의 형광 이미지를 캡처합니다.

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결과

그림 2에서 볼 수 있듯이 이 프로토콜을 따르면 C57BL/6J 마우스의 1차 LEC가 4시간 이내에 접시에 부착되었습니다. 특히, 후낭(posterior capsule)과 수정체 섬유 세포(lens fiber cell)의 일부와 같은 다른 조직의 흔적이 눈에 띄게 남아 있었습니다. 그러나 이러한 의도하지 않은 요소는 접시에 부착되지 않았으므로 배양 배지를 변경하여 제거할 수 있습니다. 그 후, 3일째에서 5일 사이에 ...

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토론

이 백서에 제시된 프로토콜은 기본 LEC의 성공적인 격리, 배양 및 하위 배양에 대한 포괄적인 단계별 가이드를 제공하며 함께 제공되는 비디오 문서도 함께 제공됩니다. 서면 지침과 함께 상세한 시각적 가이드는 프로토콜의 명확성과 접근성을 향상시켜 해당 분야의 연구자들 사이에서 프로토콜의 사용과 재현성을 촉진합니다. 궁극적인 목표는 백내장 형성 및 백내장 수술 후 만연한 합병증인 PCO?...

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공개

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 말

이 작업은 NEI R21EY033941(to Hongli Wu)의 지원을 받았습니다. 국방부 W81XWH2010896 (Hongli Wu에게); R15GM123463-02 (케일라 그린과 홍리 우에게)

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
0.05% Trypsin-EDTAThermo Fisher#25300054For LECs dissociation
Alexa Fluor 488 Secondary Antibody Jackson ImmunoResearch#715-545-150For cell validation
Alexa Fluor 647 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch111-605-003For cell validation
Antibody dilution bufferLicor#927-60001For cell validation
Beaver safety knifeBeaver-Visitec International#3782235For lens dissection
Blocking bufferLicor#927-60001For cell validation
Capsulorhexis forcepsTitan Medical InstrumentsTMF-124For lens capsule isolation
DMEMSigma AldrichD6429For LECs culture medium
DMSOSigma Aldrich#D2650For making freezing medium 
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher#J67802For lens dissection
Dumont tweezersRoboz Surgical InstrumentRS-4976For lens capsule isolation
EpiCGS-a (optional)ScienCell4182For LECs culture medium
FBSSigma AldrichF2442For LECs culture medium
Gentamicin (50 mg/mL)Sigma-AldrichG1397For LECs culture medium
Hoechst 33342 solutionThermo Fisher#62249For cell validation
Micro-dissecting scissorsRoboz Surgical Instrument RS-5983For lens dissection
Micro-dissecting tweezersRoboz Surgical Instrument RS5137 For lens dissection
PROX1 antibodyThermo Fisher11067-2-APFor cell validation
Vannas micro-dissecting spring scissorsRoboz Surgical InstrumentRS-5608For lens capsule isolation
αA-crystallin antibodySanta Cruzsc-28306For cell validation 
γ-crystallin antibodySanta Cruzsc-365256For cell validation

참고문헌

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