Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex의 Dual Extracellular Recordings in the Mouse Hippocampus and Prefrontal Cortex(생쥐 해마와 전전두엽 피질의 이중 세포외 기록)

요약

이 프로토콜은 국소 자기장 전위를 기록하고 쥐 해마와 전전두엽 피질의 정보 흐름을 조사하기 위해 맞춤형으로 설계된 기록 장치와 전극의 사용을 간략하게 설명합니다.

초록

국소 전위(LFP)를 기록하는 기술은 국소화된 신경 세포 집단의 전기적 활동을 측정하는 데 사용되는 전기생리학적 방법입니다. 이는 인지 연구, 특히 해마와 전전두엽 피질과 같은 뇌 영역에서 중요한 도구 역할을 합니다. 이러한 영역 간의 이중 LFP 기록은 지역 간 신호 통신을 탐색할 수 있게 해주기 때문에 특히 흥미롭습니다. 그러나, 이러한 녹음을 수행하는 방법은 거의 설명되지 않으며, 대부분의 상용 기록 장치는 비싸거나 특정 실험 설계를 수용하기에 적응성이 부족합니다. 이 연구는 항정신병 약물 및 칼륨 채널 조절제가 이러한 영역의 LFP 특성에 미치는 영향을 조사하기 위해 마우스 해마와 전전두엽 피질에서 이중 전극 LFP 기록을 수행하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 각 뇌 영역 내의 전력 스펙트럼 및 둘 사이의 일관성을 포함한 LFP 특성을 측정할 수 있습니다. 또한 이러한 실험을 위해 저비용의 맞춤형 녹음 장치가 개발되었습니다. 요약하면, 이 프로토콜은 서로 다른 뇌 영역에서 높은 신호 대 잡음비로 신호를 기록하는 수단을 제공하여 뇌 내 지역 간 정보 통신의 조사를 용이하게 합니다.

서문

국소자기전위(LFP)는 세포외 공간에서 기록된 전기적 활동을 말하며, 국소적인 뉴런 그룹의 집합적 활동을 반영합니다. 1Hz의 느린 파동에서 100Hz 또는 200Hz의 빠른 진동에 이르기까지 다양한 범위의 주파수를 나타냅니다. 특정 주파수 대역은 학습, 기억 및 의사 결정과 같은 인지 기능과 관련이 있습니다 ^1,2. LFP 특성의 변화는 치매 및 정신 분열증을 포함한 다양한 신경 장애의 바이오마커로 사용되었습니다 ^3,4. LFP 기록을 분석하면 이러한 상태 및 잠재적인 치료 전략과 관련된 근본적인 병리학적 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공할 수 있습니다.

이중 LFP 기록은 두 개의 특정 뇌 영역 내부 및 두 영역 사이의 국부적인 전기 활동을 측정하는 데 사용되는 기술입니다. 이 기술은 서로 다른 뇌 영역 내에서 그리고 서로 다른 뇌 영역 사이에서 발생하는 복잡한 신경 역학 및 신호 통신을 조사할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다. 이전 연구에 따르면 개별 뇌 영역의 신경 세포 특성의 변화를 감지하는 것은 복잡할 수 있지만 지역 간 대뇌 피질 통신의 변화는 관찰할 수 있습니다 ^5,6. 따라서 듀얼 LFP 녹음을 사용하면 이 문제를 해결할 수 있는 강력한 수단을 제공할 수 있습니다.

해마-전전두엽 연결성은 인지 기능을 조절하는 데 중요한 역할을 하며, 기능 장애는 다양한 신경 장애와 관련이 있습니다 ^7,8. 이러한 영역의 이중 전극 기록은 이러한 상호 작용에 대한 정보를 제공할 수 있습니다. 불행히도, 이러한 영역 사이에서 이중 전극 LFP 기록을 수행하는 방법에 대해 사용할 수 있는 정보는 제한적입니다. 더욱이, 상업적으로 이용 가능한 기록 장치는 일반적으로 비싸고 특정 실험 설계에 대한 적응성이 부족합니다. LFP를 기록하는 기존의 방법은 차폐 케이블을 사용하여 기록 장치를 동물의 뇌에 이식된 전극에 연결하는 것입니다. 그러나 이 접근 방식은 모션 아티팩트 및 환경 노이즈에 취약하여 기록된 신호의 품질과 신뢰성에 영향을 미칩니다.

이 프로토콜은 동물의 머리에 배치할 수 있는 저비용 맞춤형 설계 헤드스테이지를 사용하여 쥐 해마와 전전두엽 피질에서 이중 전극 LFP 기록을 수행하는 포괄적인 절차를 설명합니다. 이러한 방법을 통해 연구자들은 두 개의 분리된 대뇌 영역 내에서 영역별 진동 패턴을 조사하고 이러한 영역 간의 지역 간 정보 교환 및 연결성을 탐구할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구는 과학적 목적을 위한 동물 관리 및 사용에 대한 호주 규정에 따라 Florey Animal Ethics Committee(The University of Melbourne, No. 22-025UM)의 승인을 받았습니다. 본 연구에는 호주 동물자원센터(Animal Resources Centre)에서 얻은 C57BL/6마리의 수컷 마우스(8주)가 사용되었다.

1. 헤드스테이지 설계 및 제작

알림: 헤드스테이지 PCB 보드는 동물의 머리에 직접 배치하도록 설계된 소형 14mm x 12mm 4층 보드입니다. 상용 증폭기 칩( 재료 표 참조)을 사용하며 모든 디자인 및 Gerber 파일은 온라인에서 사용할 수 있습니다(GitHub 링크: https://github.com/dechuansun/Intan-headstage/tree/main/pcbway).

1. 제조업체에 다음 사양을 제공하십시오. 보드 두께: 0.6mm; 최소 트래킹/간격: 4mils; 최소 구멍 크기: 0.2mm.
2. PCB 조립 과정에서 다음 순서를 따르십시오.
   1. 350°C로 설정된 열풍총을 사용하여 증폭기 칩을 보드에 납땜합니다.
   2. 수동 구성 요소를 납땜합니다.
   3. SPI 커넥터와 전극 커넥터를 납땜합니다( 재료 표 참조).
3. 품질 보증을 위해 현미경으로 납땜을 검사하십시오. 안정성을 높이기 위해 에폭시를 사용하여 SPI 커넥터를 제자리에 고정합니다.
4. 신호 수집을 위해 타사 녹음 소프트웨어와 제어 보드( 재료 표 참조)를 사용하십시오. 자세한 지침은 소프트웨어 사용 설명서를 참조하십시오.
5. 설계된 헤드스테이지는 8개의 채널을 지원합니다. 소프트웨어에서 채널 8, 9, 12, 13, 20, 21, 22 및 23을 녹음할 수 있도록 활성화합니다.

2. 전극 제작

1. PFA 코팅 텅스텐 와이어( 재료 표 참조)를 전두엽 피질 전극(12mm), 해마 전극(10mm) 및 접지 전극(6mm)과 같은 다양한 전극 유형에 대해 특정 길이로 자릅니다.
2. 황동 튜브( 재료 표 참조)를 3mm 세그먼트로 자릅니다.
3. 라이터를 사용하여 각 와이어 끝의 코팅 2mm를 제거한 다음 전극 와이어를 황동 튜브에 단단히 납땜합니다. 황동 튜브의 내경은 0.45mm이고 외경은 0.60mm입니다.
4. 접지 전극의 경우 M1.2 스테인리스강 나사( 재료 표 참조)를 전극에 납땜합니다. 인산 기반 플럭스를 나사에 적용하여 납땜을 향상시킵니다. 납땜 후 알코올을 사용하여 나사를 청소하십시오.
   알림: 납땜 과정에서 보호를 위해 장갑을 착용하십시오.

3. 수술 절차

1. 3% 이소플루란과 1L/min 산소 흐름이 있는 마취실에서 마우스를 마취합니다.
2. 마취된 마우스를 가열 패드에 놓고 입체 프레임에 고정합니다( 재료 표 참조).
3. 이소플루란의 유지율을 2.5-3%로 조정하고 산소 흐름을 500mL/분으로 줄입니다. 발가락 핀치를 사용하여 동물이 여전히 깊은 마취 상태인지 확인합니다.
4. 카프로펜 0.5mg/kg을 피하주사하고 눈 보호를 위해 눈 연고를 바릅니다.
5. 포비돈 요오드와 80% 에탄올을 사용하여 쥐의 머리를 면도하고 살균합니다.
6. 두피 정중선을 따라 8mm 절개하여 절개 부위의 결합 조직을 제거합니다.
7. 과산화수소를 바르고 두개골 표면을 청소하고 주변 피부를 만지지 않도록 주의합니다.
8. 정확한 전극 배치를 위해 브레그마와 람다 랜드마크를 동일한 높이에 맞춥니다(브레그마와 람다는 시상 봉합사가 관상 봉합사와 람돔 봉합사와 교차하는 위치입니다).
9. 지정된 좌표에서 기준/접지 전극, 앵커 나사(0.9mm 드릴 버) 및 활성 전극(0.3mm 드릴 버)용 구멍을 뚫습니다.
10. 맞춤형 전극(2단계)을 입체 프레임 암에 부착하고 뇌와 수직이 되도록 합니다.
11. 해마 CA1 영역(AP - 1.8mm, ML - 1.3mm, DV - 1.4mm)에 전극을 이식합니다.
    참고: AP, 전후; ML, 내측; DV, 배쪽.
12. 전전두엽 피질(AP - 2.0mm, ML - 0.3mm, DV - 1.7mm)에 전극 이식을 반복합니다.
13. 시중에서 판매되는 강력한 접착제와 치과용 시멘트로 전극을 고정합니다( 재료 표 참조).
14. 움직임을 방지하기 위해 두 개의 1.2mm 고정 나사(AP - 1.8mm, ML -1.6mm)를 이식합니다.
15. 기준/접지 전극을 경막과 직접 접촉하도록 배치하고, 람다 랜드마크에 대해 2mm 후방 및 2mm 일방적으로 배치합니다.
16. 전극의 황동 튜브 쪽을 접지 전극이 중앙에 있는 다중 채널 소켓 커넥터( 재료 표 참조)에 연결합니다.
17. 절연을 위해 중간 핀 외부에 0.8mm 열수축 튜브를 사용합니다.
18. 전극, 앵커 나사 및 커넥터를 접착제와 치과용 시멘트로 고정합니다.

4. 수술 후 관리

1. 수술 후 통증을 완화하기 위해, 3일 동안의 통증 평가에 근거하여 12-24시간마다 5-10 mg/kg의 용량으로 카프로펜을 피하 주사하십시오.
2. 기록 또는 실험 절차를 시작하기 전에 동물에게 1주일의 회복 기간을 제공하십시오.

5. 녹음 절차

1. 3일 연속으로 하루에 두 번, 15분 동안 동물을 다루십시오.
2. 과도한 압력을 가하지 않고 쥐 주위의 손을 부드럽게 닫아 쥐를 들어 올립니다.
3. 3일 연속 하루에 한 번 30분 동안 동물의 머리에 헤드스테이지 보드를 놓습니다.
4. 녹음 당일에는 동물을 30분 동안 녹음실에 적응시킵니다.
5. 외부 전기 간섭을 줄이기 위해 동물을 패러데이 케이지 내의 작은 녹음 챔버에 놓습니다. 녹음을 위해 사용자 지정 헤드스테이지를 부착합니다.
6. 녹음 소프트웨어를 열고 2.00kHz 샘플링 속도를 선택합니다. 각 채널을 선택하고 스페이스 바를 눌러 13과 20을 제외한 모든 채널을 비활성화합니다.
7. 하드웨어 대역폭 창에서 낮은 대역폭을 2Hz로 설정하고 상위 대역폭을 100Hz로 설정합니다.
8. 소프트웨어 필터링 창에서 저역 통과 필터를 100Hz로, 고역 통과 필터를 2Hz로 조정합니다.
9. Select File Name(파일 이름 선택)을 클릭하여 저장 경로를 선택한 다음 Record(기록)를 클릭합니다.
10. 10분의 습관화 기간으로 각 녹음 세션을 시작한 다음 15분의 기본 EEG 기록으로 시작합니다.
11. 기준선 기록 후 복강 내 주사를 통해 약물을 투여하고 지체 없이 추가로 30분 동안 녹음을 계속합니다.
    참고: 사용된 약물에 대한 자세한 내용은 결과 섹션을 참조하십시오.

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결과

여기에 표시된 결과는 C57BL/6 수컷 마우스의 4개 코호트(각 코호트에 대해 n = 8, 연령: 8주, 체중: 24.0 ± 0.42g)에서 테스트한 국소 자기장 전위(LFP) 특성에 대한 여러 약물의 효과를 보여줍니다. 검사된 약물에는 항정신병 약물인 클로자핀, 칼륨 채널 조절제인 4-아미노피리딘(4-AP), 레티가빈, 대조군 생리식염수가 포함되었습니다.

그림 1에서 볼 수 있듯이 마?...

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토론

여기에 제시된 프로토콜은 해마(HIP)와 전전두엽 피질(PFC)에서 이중 국소자기전위(LFP)를 동시에 기록하기 위해 특별히 설계된 맞춤형 헤드스테이지를 구성하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜에 제공된 자세한 단계는 연구원이 각 영역 내 및 HIP와 PFC 간의 신호 통신을 철저히 조사할 수 있는 충분한 정보를 제공합니다.

맞춤형으로 설계된 헤드스테이지는 상업용 앰?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Brass tube	Albion Alloys, USA	Inside diameter of 0.45 mm
Carprofen	Rimadyl, Pfizer Animal Health
Commercial amplifier chip	Intantech	RHD 2132
Control board	Intantech	RHD recording system
Dental cement	Paladur
Heat shrinks	Panduit	0.8 mm diameter
M1.2 stainless steel screw	Watch tools	Clock and watch screw
Multichannel socket connector	Harwin, AU	1.27 mm pitch, PCB socket
PFA-coated tungsten wires	A-M SYSTEMS, USA	Inside diameter of 150 µm
Phosphoric acid-based flux	Chip Quik	CQ4LF-0.5
Recording software	Intantech	RHX recording software
Stereotactic Frame	World Precision Instruments	Mouse stereotactic instrument
Super glue	UHU	Ultra fast