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생체 외 라이브 이미징은 생체 조직에서 세포 움직임과 상호 작용의 동적 과정을 연구하기 위한 강력한 기술입니다. 여기에서는 배양된 전체 성체 마우스 앞니에서 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하기 위해 이광자 현미경을 구현하는 프로토콜을 제시합니다.
지속적으로 성장하는 마우스 앞니는 성체 상피 및 중간엽 줄기 세포의 조절과 치아 재생을 조사하기 위한 다루기 쉬운 모델 시스템으로 부상하고 있습니다. 이러한 전구 세포는 활발하게 분열, 이동 및 분화하여 조직 항상성을 유지하고 손실된 세포를 반응하는 방식으로 재생합니다. 그러나 고정 조직 절편을 사용하는 기존 분석은 세포 움직임 및 상호 작용의 동적 과정을 포착할 수 없었기 때문에 해당 규정을 연구하는 능력이 제한되었습니다. 이 논문은 이식 배양 시스템에서 전체 마우스 앞니를 유지하고 다광자 타임랩스 현미경을 사용하여 치아 상피 세포를 실시간으로 추적하는 프로토콜을 설명합니다. 이 기술은 치과 연구를 위한 기존 도구 상자에 추가되며 연구자가 살아있는 조직의 세포 행동 및 조직에 대한 시공간 정보를 얻을 수 있도록 합니다. 우리는 이 방법론이 연구자들이 치아 재생과 재생 중에 발생하는 역동적인 세포 과정을 제어하는 메커니즘을 추가로 탐구하는 데 도움이 될 것으로 기대합니다.
지난 20년 동안 마우스 앞니는 성체 줄기 세포 조절 및 치아 재생의 원리를 조사하기 위한 귀중한 플랫폼으로 부상했습니다 1,2. 쥐 앞니는 동물의 일생 동안 지속적으로 성장하고 스스로 재생됩니다. 상피 줄기세포와 중간엽 줄기세포를 모두 유지함으로써 이를 수행하며, 이 줄기세포는 치아의 다른 세포 유형으로 자가 재생되고 분화할 수 있습니다 1,2. 치아 상피 줄기세포는 법랑질 기질을 분비하는 아멜로아세포를 생성하는 반면, 치아 중간엽 줄기세포는 상아질, 시멘트 및 치주 인대를 형성하는 odontoblast, cementoblast 및 fibroblast를 각각생성합니다 3,4,5,6. 이러한 새로운 세포의 지속적인 공급은 조직의 항상성을 유지하고 저작 마모 또는 부상으로 인해 손실된 오래된 세포를 대체할 수 있도록 합니다
모든 쥐는 캘리포니아 대학교 로스앤젤레스(UCLA) 또는 예루살렘 히브리 대학교(HUJI)의 병원균이 없는 동물 시설에서 관리되었습니다. 마우스와 관련된 모든 실험은 각 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 규정 및 프로토콜에 따라 수행되었습니다(ARC-2019-013; UCLA) 또는 (MD-23-17184-3; HUJI)를 사용합니다. 실험 단계의 일반적인 워크플로우는 그림 2A에 나와 있습니다. 이 프로토콜에 사용되는 모든 기기, 시약 및 재료와 관련된 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오.
1. 용액 및 겔의 준비
성체 쥐 앞니의 정점 영역은 하악골 내에 둘러싸여 있기 때문에(그림 1) 성장 영역 내에 있는 전구 세포를 시각화하고 실시간으로 추적하기 위해 직접 접근할 수 없습니다. 따라서 우리는 턱뼈에서 전체 앞니를 추출하고 이광자 타임랩스 현미경을 위한 외식물 배양 시스템에서 유지하는 방법을 개발했습니다(그림 2). 여기서는 치아 상피의 순 경추 루프.......
살아있는 조직 이미징은 세포가 틈새 환경에서 유지될 때 세포의 역동적인 과정과 행동을 연구할 수 있게 해주는 중요한 기술이다41. 이상적으로, 라이브 이미징은 높은 시공간 해상도로 생체 내에서 수행됩니다. 그러나, 포유류 장기에 대한 생체내 이미징은 조직 접근의 불가능성, 광학적 불투명도, 그리고 장기간 동안 동물 또는 장기를 고정시키는 것의 어려움으?.......
저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.
우리는 이광자 현미경을 제공한 캘리포니아 나노시스템 연구소(RRID:SCR_022789)의 UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory 및 Leica Microsystems Center of Excellence를 인정합니다. AS는 이스라엘 과학 재단(Israel Science Foundation)의 ISF 604-21의 지원을 받았습니다. JH는 NIH/NIDCR의 R03DE030205 및 R01DE030471의 지원을 받았습니다. AS와 JH는 또한 미국-이스라엘 양국 과학 재단(BSF)의 보조금 2021007 지원을 받았습니다.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
Scissors | F.S.T | 37133 | |
serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
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