Human Dermal Fibroblast를 이용한 Self-Assembled Cell Sheet Culture 및 3D Tendon/Ligament-like Organoid의 수동 생성 시연

요약

여기에서는 힘줄 기초 연구를 위한 유망한 도구이자 힘줄 조직 공학을 위한 잠재적인 스캐폴드 없는 방법을 제공하는 3단계 오가노이드 모델(2차원[2D] 확장, 2D 자극, 3차원[3D] 성숙)을 시연합니다.

초록

힘줄과 인대(T/L)는 근골격계를 하나로 묶는 강력하고 계층적으로 조직된 구조입니다. 이 조직에는 주로 평행한 줄에 위치한 콜라겐 유형 I-rich 세포외 기질(ECM)과 T/L-계통 세포가 엄격하게 배열되어 있습니다. 부상 후 T/L은 고장 위험이 높고 종종 만족스럽지 않은 수리 결과로 재활에 오랜 시간이 필요합니다. 최근 T/L 생물학 연구의 발전에도 불구하고 남아 있는 과제 중 하나는 T/L 분야에는 여전히 체외에서 T/L 형성 과정을 재현할 수 있는 표준화된 분화 프로토콜이 부족하다는 것입니다. 예를 들어, 중간엽 전구체 세포의 뼈 및 지방 분화에는 표준 2차원(2D) 세포 배양과 특정 자극 매체의 추가만 필요합니다. 연골을 분화하기 위해서는 3차원(3D) 펠릿 배양 및 TGFß 보충이 필요합니다. 그러나 힘줄에 대한 세포 분화에는 매우 질서 정연한 3D 배양 모델이 필요하며, 이상적으로는 동적 기계적 자극도 받을 수 있어야 합니다. 3-step (Expansion, Stimulation, and Maturation) 오가노이드 모델을 구축하여 자체 조립된 세포장에서 3D 막대 형태의 구조를 형성하였으며, 이를 통해 자체 ECM, 자가분비, 측분비 인자를 가진 자연스러운 미세환경을 구현하였습니다. 이러한 막대 모양의 오가노이드는 풍부한 ECM 내에서 다층 세포 구조를 가지고 있으며 정전기적인 기계적 변형에 노출될 경우 매우 쉽게 처리할 수 있습니다. 여기에서는 시판되는 진피 섬유아세포를 사용하여 3단계 프로토콜을 시연했습니다. 우리는 이 세포 유형이 견고하고 ECM이 풍부한 오가노이드를 형성한다는 것을 보여줄 수 있습니다. 설명된 절차는 배양 배지 측면에서 더욱 최적화될 수 있고 동적 축방향 기계적 자극에 대해 최적화될 수 있습니다. 같은 방식으로, 대체 세포 소스가 T/L 오가노이드를 형성할 수 있는 잠재력을 테스트하여 T/L 분화를 거칠 수 있습니다. 요컨대, 확립된 3D T/L 오가노이드 접근 방식은 힘줄 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링의 모델로 사용할 수 있습니다.

서문

힘줄과 인대(T/L)는 신체에 필수적인 지지와 안정성을 제공하는 근골격계의 중요한 구성 요소입니다. 이러한 결합 조직은 중요한 역할에도 불구하고 퇴화와 손상이 발생하기 쉬워 통증과 이동성 장애를 유발합니다¹. 더욱이, 제한된 혈액 공급과 느린 치유 능력은 만성 부상으로 이어질 수 있으며, 노화, 반복적인 움직임 및 부적절한 재활과 같은 요인은 퇴행 및 부상의 위험을 더욱 증가시킨다². 휴식, 물리치료, 외과적 치료와 같은 기존의 치료법으로는 T/L 구조와 기능을 완전히 회복할 수 없습니다. 지난 몇 년 동안 연구자들은 T/L 장애에 대한 효과적인 치료법을 찾기 위해 T/L의 복잡한 특성을 더 잘 이해하기 위해 노력해 왔습니다 ^3,4,5. T/L은 주로 I형 콜라겐 섬유와 프로테오글리칸으로 구성된 계층적으로 조직화된 세포외 기질(ECM) 지배 구조로 구별되며, 이러한 특징은 시험관 내에서 복제하기 어려운 특징입니다 ⁶. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 모델은 T/L 조직의 특징적인 3차원(3D) 조직을 포착하지 못하여 번역 잠재력을 제한하고 T/L 재생 분야의 혁신적인 발전을 저해합니다.

최근 3D 오가노이드 모델의 개발은 다양한 조직 유형 7,8,9,10,11,12,13의 기초 연구 및 스캐폴드가 없는 조직 공학을 발전시킬 수 있는 새로운 가능성을 제공했습니다. 예를 들어, 근건성 접합부를 조사하기 위해 Larkin et al. 2006은 쥐 꼬리 힘줄¹⁰에서 파생된 자체 조직화된 힘줄 분절과 함께 3D 골격근 구조를 개발했습니다. 또한, Schiele et al. 2013은 미세 가공된 피브로넥틴 코팅 성장 채널을 사용하여 배아 힘줄 발달의 주요 특성을 포착할 수 있는 접근 방식인 3D 스캐폴드의 도움 없이 인간 피부 섬유아세포의 자가 조립을 지시하여 세포 섬유를 형성하도록 지시했습니다¹¹. Florida et al. 2016의 연구에 따르면, 골수 기질 세포는 먼저 뼈 및 인대 계통으로 확장되었고, 그 다음에는 자가 조립 단층 세포 시트를 생성하는 데 사용되었으며, 그런 다음 인대 재생에 대한 이해를 향상시키는 것을 목표로 하는 모델인 천연 전방 십자인대를 모방한 다상 뼈-인대-뼈 구조를 만들기 위해 구현되었습니다¹². 힘줄 기계전달 과정을 설명하기 위해 Mubyana et al. 2018은 단일 힘줄 섬유를 생성하고 기계적 하중 프로토콜¹³을 적용하는 스캐폴드가 없는 방법론을 활용했습니다. 오가노이드는 조직의 기본 아키텍처, 미세환경 및 기능을 모방하는 자체 조직화된 3D 구조입니다. 3D 오가노이드 배양은 조직 및 장기 생물학과 병태생리학을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 모델을 제공합니다. 이러한 모델은 또한 상이한 줄기/전구 세포 유형의 조직 특이적 분화를 유도하는 데 사용될 수^{있다 14,15}. 따라서 T/L 생물학 및 조직 공학 분야에서 3D 오가노이드 모델을 구현하는 것은 매우 매력적인 접근 방식이 됩니다 ^9,16. 대체 세포 소스는 오가노이드 어셈블리를 위해 구현될 수 있으며 tenogenic differentiation을 향해 자극될 수 있습니다. 이 연구에서 시연에 사용된 한 가지 관련 세포 유형은 피부 섬유아세포 ^7,17,18입니다. 이 세포는 피부 생검 절차를 통해 쉽게 접근할 수 있으며, 이는 골수 천자나 지방 흡입에 비해 덜 침습적이며 우수한 증식 능력으로 인해 상당히 빠르게 증식할 수 있습니다. 반면, T/L-상주 섬유아세포와 같은 보다 전문화된 세포 유형은 분리 및 확장이 더 까다롭습니다. 따라서, 피부 섬유아세포는 유도만능배아줄기세포(induced pluripotent embryonic stem cells)를 향한 세포 재프로그래밍 기술의 출발점으로도 사용되었다¹⁹. T/L의 형성 및 유지를 포함한 다양한 세포 과정의 핵심 조절자 역할을 하는 것으로 보고된 형질전환 성장 인자-베타 3(TGFß3)와 같은 특정 3D 배양 조건 및 신호 전달 신호에 피부 섬유아세포를 적용하면 힘줄 특이적 유전자의 발현 및 T/L-전형적인 ECM의 침착으로 이어지는 시험관 내 테노겐 분화를 강화할 수 있습니다^{.20, 21}.

여기에서는 상업적으로 이용 가능한 정상적인 성인 인간 피부 섬유아세포(NHDF)를 세포 소스로 사용하여 이전에 확립 및 구현된 3단계(2D 확장, 2D 자극 및 3D 성숙) 오가노이드 프로토콜을 설명하고 시연하여 체외 건형성⁷을 연구하기 위한 귀중한 모델을 제공합니다. 이 모델이 in vivo T/L 조직과 동일하지 않다는 사실에도 불구하고 세포 분화 메커니즘을 조사하고, in vitro에서 T/L 병태생리학을 모방하고, T/L 맞춤형 의료 및 약물 스크리닝 플랫폼을 구축하는 데 사용할 수 있는 생리학적으로 더 관련성 있는 시스템을 제공합니다. 또한, 향후 연구를 통해 3D 오가노이드가 추가 최적화를 통해 스캐폴드가 없는 T/L 엔지니어링에 적합한지, 그리고 천연 T/L 조직의 치수와 구조적 및 생물물리학적 특성을 밀접하게 유사한 기계적으로 견고한 구조 개발에 활용할 수 있는지 여부를 평가할 수 있습니다.

프로토콜

알림: 모든 단계는 무균 기술을 사용하여 수행해야 합니다.

1. NHDF의 문화와 사전 확장

1. 성인 냉동 보존된 정상적인 인간 피부 섬유아세포(NHDF, 1 x 10⁶ 세포)가 들어 있는 cryo-vial을 거의 해동될 때까지 37°C에서 빠르게 해동합니다.
2. 37°C에서 예열된 1% 페니실린/스트렙토마이신(펜/연쇄상구균)(NHDF 배지)이 보충된 예열된 섬유아세포 성장 배지 2(기저 배지, 2% 태아 송아지 혈청(FCS), 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF) 및 인슐린을 포함한 즉시 사용 가능한 키트) 1mL를 세포에 천천히 추가합니다.
3. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 실온(RT)에서 5분 동안 300 x g 에서 셀을 원심분리합니다.
4. 상층액을 제거합니다. 세포 펠릿을 12mL의 예열된 NHDF 배지에 재현탁시킵니다.
5. 세포를 T-75 플라스크에 옮기고 십자형으로 짧게 흔듭니다. T-75 플라스크를 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에 넣습니다.
6. 2일마다 매체를 교체하십시오. NHDF가 70% - 80%의 밀도에 도달할 때까지 현미경으로 관찰합니다.

2. 2D 확장

1. 인큐베이터의 T-75 플라스크를 꺼내고 NHDF 배지를 제거합니다. 미리 따뜻해진 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 세척합니다.
2. 0.05% 트립신-EDTA 3mL를 세포에 추가합니다. 세포가 플라스크에서 분리될 때까지(약 3분) 37°C에서 5%_CO2 가습 인큐베이터에서 세포를 배양합니다.
3. 트립신 작용을 중화하기 위해 미리 따뜻해진 NHDF 배지 6mL를 추가합니다. 세포를 15mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
4. RT에서 5분 동안 300 x g 에서 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다.
5. 37°C에서 예열된 10% 소 태아 혈청(FBS), 1x MEM 아미노산, 1% 펜/연쇄상구균이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagles Medium) 저포도당에 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
6. 8 x 10³ NHDFs/cm² (총 10 cm 접시당 4.4 x 10⁵ NHDFs)의 밀도로 10cm 부착 세포 배양 접시에 NHDF를 플레이트합니다. 십자형으로 부드럽게 흔듭니다.
7. 37°C에서 10cm 세포 배양 접시를 5%_CO2 가습 인큐베이터에 넣습니다. 2일마다 매체 교체
8. 100% 밀도(약 5일)에 도달할 때까지 현미경으로 세포를 모니터링합니다.

3. 2D 자극

1. 인큐베이터에서 NHDFs가 들어있는 10cm 세포 배양 접시를 꺼냅니다(단계 2.6 및 2.7에서). 배양 배지를 제거하고 미리 따뜻해진 PBS로 세포를 세척합니다.
2. 37°C에서 예열된 10% FBS, 50μg/mL 아스코르브산 및 1% 펜/연쇄상구균이 보충된 DMEM 고포도당 배지 10mL를 추가합니다.
3. 페트리 접시를 37% CO_{5 가습} 분위기에서 2°C로 놓습니다. 2일마다 매체를 교체하십시오.
4. 14일 동안 현미경으로 NHDF를 모니터링합니다.

4. 3D 성숙

1. 인큐베이터에서 10cm 세포 배양 접시를 꺼내고 DMEM 고포도당 배지를 제거합니다.
2. 셀 스크레이퍼로 형성된 셀 시트를 접시에서 부드럽고 빠르게 분리합니다. 분리하는 동시에 세포장을 3D 막대 모양의 오가노이드로 롤링합니다.
3. NHDF 오가노이드를 집어 10cm 비부착(세포용) 페트리 접시에 넣습니다. 이 접시 유형은 오가노이드에서 플라스틱으로의 세포 유출을 방지하는 데 사용됩니다.
4. 이 시점 또는 다음 날(3D 성숙 0일 또는 1일차)에 습식 중량, 조직학적 평가(1일차 오가노이드는 더 컴팩트해짐에 따라 바람직함), RNA 및 단백질 분리와 같은 추가 분석을 위해 일부 오가노이드를 수집합니다.
5. 다음과 같이 금속 핀으로 오가노이드의 가장자리를 고정합니다.
   1. 핀셋으로 오가노이드의 한쪽을 조심스럽게 잡고 다른 핀셋으로 약 10%의 축 신장을 수동으로 부드럽게 늘립니다. 10% 축 신장을 추정하려면 밀리미터 용지 또는 자를 사용합니다.
   2. 그런 다음 핀셋으로 금속 핀 하나를 잡고 오가노이드 가장자리를 통해 플라스틱 접시에 수동으로 눌러 고정합니다. 오가노이드의 두 번째 가장자리에 두 번째 핀을 사용하여 이 절차를 반복합니다.
6. 37°C에서 예열된 10% FBS, 1x MEM 아미노산 1개, 50μg/mL 아스코르브산, 10ng/mL TGFß3 및 1% 펜/연쇄상구균이 보충된 DMEM 고포도당 배지 10mL를 추가합니다.
7. 10cm 접시를 37% CO 37_{의 가습} 분위기에서 5°C로 놓습니다. 2일마다 매체를 교체하십시오.
8. 14일 동안 정기적으로 오가노이드를 모니터링합니다.
   알림: 핀이 느슨해질 수 있으므로 4.5단계에서 설명한 것과 동일한 기술을 사용하여 다시 수정하십시오.
9. 14일 후 오가노이드에서 DMEM 고포도당 배지를 제거합니다. 미리 예열된 PBS로 오가노이드를 세척합니다.
10. 정밀 저울을 사용하여 0일째와 14일에 습윤 중량에 대한 오가노이드를 측정합니다.
    1. 저울에 빈 10cm 접시를 놓고 무게를 0으로 측정하여 오가노이드의 무게만 측정되도록 합니다. 10cm 접시에서 배양액을 완전히 제거하고 오가노이드 습윤 중량을 하나씩 측정합니다.
       참고: 이 연구에서는 0일차에 공여체당 3개의 오가노이드, 14일차에 공여체당 2개의 오가노이드의 무게를 측정했습니다.
11. 연구 목적에 따라 추가 조직학적 분석에서 일부 NHDF 오가노이드를 구현하거나 후속 DNA, RNA 및 단백질 분리를 위해 멸균 DNA/RNA-free 튜브를 사용하여 액체 질소에 즉시 동결한 다음 -80°C에서 보관합니다.
12. 조직학적 조사를 위해 각 오가노이드를 예냉(4°C) 4% 파라포름알데히드 5mL의 PBS(중성 pH로 조정)에 얼음에서 45분 동안 고정한 다음 RT(각각 2 x 5분)에서 PBS 세척합니다.
13. 조직학을 위해 오가노이드를 유리병에 넣어 자당 그래디언트를 사용하여 고정 오가노이드를 냉동 보호합니다. 오가노이드를 PBS 용액의 10% 자당에 4°C에서 2시간 동안 배양한 후 4°C에서 2시간 동안 20% 자당/PBS를 배양한 후 마지막으로 4°C에서 30% 자당/PBS를 하룻밤 동안 배양합니다. 먼저 피펫팅을 한 다음 새 용액으로 채워 자당 용액을 교체하십시오.
14. 오가노이드를 cryo-medium에 삽입합니다.
    1. 스티로폼 상자의 드라이아이스 위에 동판을 놓고 10분 동안 식힙니다.
    2. 다음으로, 극저온 매체로 미리 채워진 플라스틱 극저온 주형을 동판에 놓고 핀셋을 사용하여 오가노이드를 극저온 금형 바닥으로 부드럽게 누릅니다. 극저온질이 완전히 얼 때까지 기다리십시오.
    3. 긴 오가노이드의 경우 먼저 메스로 반으로 자르고 두 반쪽을 cryomold에 서로 평행하게 넣습니다. 조직학적 분석을 받으려는 각 오가노이드에 대해 절차를 반복합니다.
15. 냉동 절제술 전까지 -20 °C에서 샘플을 보관합니다.
16. 크라이오토톰을 사용하여 오가노이드를 10μm 두께의 절편으로 세로로 절단하고 표준 프로토콜⁸을 사용하여 헤마톡실린 및 에오신(H&E)과 같은 조직학적 염색을 실시합니다.

결과

3D T/L 오가노이드 모델은 이전에 상업적으로 구매한 NHDF(n=3, 공여체당 3개의 오가노이드, NHDF는 5-8절에서 사용됨)를 구현하여 확립되고 시연되었습니다. 모델 워크플로는 그림 1에 요약되어 있습니다. 그림 2 는 T-75 플라스크의 사전 팽창 중(그림 2A)과 10cm 세포 배양 접시의 2D 확장 단계에서 5일 동안의 배양 시작 및 후 NHDF 배양의 대...

토론

이 연구에서 입증된 결과는 T/L 조직 연구를 위한 NHDF 3D 오가노이드 모델의 확립 및 특성화에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 3단계 프로토콜은 T/L 틈새의 전형적인 특징을 나타내는 3D 막대 모양의 오가노이드를 형성했습니다. 이 모델은 이전에 Kroner-Weigl et al. 2023⁷ 에 보고되었으며 여기에서 매우 자세히 시연되었습니다.

그림 2

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	A8960
10 cm adherent cell culture dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430167
10 cm non-adherent petri dish	Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany	CLS430591
Cryo-medium	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4583
Cryomold standard	Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands	4557
D(+)-Sucrose	AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany	A2211
DMEM high glucose medium	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-HA
DMEM low glucose	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	DMEM-LPXA
Fetal bovine serum	Anprotec, Bruckberg, Germany	AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-23020
H&E staining kit	Abcam	ab245880
Inverted microscope with high resolution camera	Zeiss	NA	Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	NEAA-B
Metal pins	EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic	04.31
Normal human dermal fibroblasts	PromoCell, Heidelberg, Germany	C-12302
Paraformaldehyde	AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	A3813
Penicillin/streptomycin	Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany	15140122
Phosphate buffer saline	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	P4417
TGFß3	R&D Systems, Wiesbaden, Germany	8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS	Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany	TRY-1B