형광 항체 주입을 통한 살아있는 초파리 배아의 저농도 단백질 및 번역 후 변형 시각화

요약

이 프로토콜은 기존의 GFP/mCherry-tag 접근법을 사용하여 검출하기 어려운 저농도 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 이미징을 가능하게 하는 맞춤형 항체 기반 형광 라벨링 및 초기 초파리 배아에 주입하는 방법을 설명합니다.

초록

GFP(Green Fluorescent Protein) 및 기타 형광 태그를 사용하여 살아있는 세포의 단백질을 시각화하면 단백질 국소화, 역학 및 기능에 대한 이해가 크게 향상됩니다. 면역형광과 비교했을 때, 실시간 이미징은 조직 고정으로 인해 발생할 수 있는 잠재적인 아티팩트 없이 단백질 국소화를 더 정확하게 반영합니다. 중요한 것은 라이브 이미징을 통해 단백질 수준과 국소화의 정량적 및 시간적 특성 분석이 가능하며, 이는 세포 이동 또는 분열과 같은 역동적인 생물학적 과정을 이해하는 데 매우 중요하다는 것입니다. 그러나 형광 태깅 접근법의 주요 한계는 성공적인 시각화를 달성하기 위해 충분히 높은 단백질 발현 수준이 필요하다는 것입니다. 결과적으로, 상대적으로 낮은 발현 수준을 가진 많은 내인성 표지 형광 단백질은 검출될 수 없습니다. 반면에, 바이러스 프로모터를 사용한 이소성 발현은 때때로 생리학적 맥락에서 단백질의 국소화 불량 또는 기능적 변화를 초래할 수 있습니다. 이러한 한계를 해결하기 위해 살아있는 배아에서 고감도 항체 매개 단백질 검출을 활용하여 조직 고정 없이 면역형광을 수행하는 접근 방식이 제시됩니다. 원리의 증거로, 살아있는 배아에서 거의 검출할 수 없는 내인성 GFP 태그 노치 수용체는 항체 주입 후 성공적으로 시각화할 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 살아있는 배아의 번역 후 변형(PTM)을 시각화하도록 조정되어 초기 배아 발생 중 티로신 인산화 패턴의 시간적 변화를 감지하고 정점 막 아래에 있는 포스포티로신(p-Tyr)의 새로운 하위 집단을 밝힐 수 있습니다. 이 접근법은 다른 단백질 특이적, 태그 특이적 또는 PTM 특이적 항체를 수용하도록 수정할 수 있으며 다른 주입 가능 모델 유기체 또는 세포주와 호환되어야 합니다. 이 프로토콜은 기존의 형광 태깅 방법을 사용하여 검출하기 어려웠던 저농도 단백질 또는 PTM의 실시간 이미징을 위한 새로운 가능성을 열어줍니다.

서문

면역형광은 앨버트 쿤스(Albert Coons)가 처음 개발한 현대 세포 생물학의 초석 기술로, 본래 세포 구획에서 분자를 검출하고 세포 내 세포 소기관 또는 기계의 분자 조성을 특성화할 수 있습니다¹. 유전자 조작과 결합된 면역형광은 단백질 국소화가 그 기능에 필수적이라는 현재 잘 받아들여지고 있는 개념을 확립하는 데 도움이 됩니다². 특정 1차 항체 및 밝은 형광 염료 외에도 이 기술의 성공은 세포 형태를 보존하고 항원을 고정하며 세포 내 구획에 대한 항체의 접근성을 높이는 고정 및 투과화라는 예비 공정에 달려 있습니다. 필연적으로 고정 및 투과화 과정은 세포를 죽이고 모든 생물학적 과정을 종료합니다³. 따라서 면역형광은 단백질의 생애 여정에 대한 스냅샷만 제공합니다. 그러나 세포 이동 및 분열과 같은 많은 생물학적 과정은 본질적으로 동적이므로 공간-시간적으로 분해되는 방식으로 단백질 거동을 조사해야 합니다 ^4,5.

살아있는 유기체의 단백질 역학을 조사하기 위해 녹색 형광 단백질(GFP)

프로토콜

실험은 SUSTech University의 생명 과학 대학의 지침 및 승인에 따라 수행되었습니다. 사용된 유기체는 Drosophila melanogaster이며, 유전자형은 Notch-Knockin-GFP(염색체 X) 및 Sqh-sqh-GFP(염색체 II)이며, 각각 Francois Schweisguth 박사(파스퇴르 연구소)와 Jennifer Zallen 박사(슬론 케터링 연구소)의 실험실에서 아낌없이 제공합니다. 이 프로토콜은 주로 항체 표지 및 실시간 이미징의 측면에 초점을 맞추고 있지만, 초파리 배아 수집 및 주입에 대한 보다 자세한 설명은 출판된 보고서를 참조하기 바란다^15,16.

1. 항체의 형광 표지

1. 바람직하게는, 관심 단백질에 대해 단클론 항체 또는 나노바디를 사용합니다. 항체의 스톡 농도를 1mg/mL 이상으로 준비합니다.
   주: 이 학문에서는, GFP nanobody는 ( 물자의 테이블 보십시오) 보기로 이용됩니다. 상업적으로 이용 가능한 GFP nanobody는 1.0 mg/mL의 농도 및 250 μL의 부....

토론

이 제시된 절차는 맞춤형 항체를 사용한 형광 표지 및 초기 단계 의 초파리 배아에 대한 후속 주입의 특수 방법을 간략하게 설명합니다. 이 기술은 소량으로 존재하고 일반적으로 기존의 GFP/mCherry 태깅 방법을 통해 관찰하기 어려운 단백질 또는 번역 후 변형의 실시간 시각화를 용이하게 합니다.

야생형 배아와 돌연변이 배아를 정량적으로 비교하기 위해 이 방법을 확?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sangon Biotech	A620014
Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit	Invitrogen	A20185	Purification column from step 1.6 is included in this kit
Biological Microscope	SOPTOP	EX20	Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25
Bleach	Clorox®
Borosilicate Glass Capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4
Centrifuge	Eppendorf	5245
Cell Strainer	FALCON	352350
Desiccation chamber	LOCK&LOCK	HSM8200	320ml
Dissecting Microscope	Mshot	MZ62	Eyepiece lens: WF10X/22mm.
Double-sided Tape	Scotch	665
Fine Super Tweezer	VETUS	ST-14
Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles	Fisherbrand	12-545F
Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides	Fisherbrand	12-550-15
Forcep	VETUS	33A-SA
Halocarbon oil 27	Sigma-Aldrich	H8773-100ML
Halocarbon oil 700	Sigma-Aldrich	H8898-100ML
Heptane	Sigma-Aldrich	H2198-1L	Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane
Dehydration reagent	TOKAI	1-7315-01	Fill to 90% volume of the dessication chamber
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Micropipette puller	World Precision Instruments	PUL-1000	Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50
Pneumatic picopump	World Precision Instruments	PV 830	Eject: 20 psi;  Range: 100ms; Duration: timed
PY20	Santa Cruz	SC-508
Square petri dishes	Biosharp	BS-100-SD
GFP nanobody	Chromotek	gt