양성 위체 및 안방 상피의 생검에서 환자 유래 위 오가노이드의 확립 및 특성화

요약

위 환자 유래 오가노이드는 연구에서 점점 더 많이 사용되고 있지만, 표준화된 파종 밀도를 가진 단일 세포 분해물에서 인간 위 오가노이드를 생성하기 위한 공식적인 프로토콜은 부족합니다. 이 프로토콜은 상부 내시경 검사 중에 얻은 생검 조직에서 위 오가노이드를 안정적으로 생성하는 자세한 방법을 제시합니다.

초록

위 환자 유래 오가노이드(PDO)는 위 생물학 및 병리학을 연구하기 위한 고유한 도구를 제공합니다. 결과적으로 이러한 PDO는 다양한 연구 응용 분야에서 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 그러나 표준화된 초기 세포 파종 밀도를 유지하면서 단일 세포 분해물에서 위 PDO를 생산하기 위한 공개된 접근법이 부족합니다. 이 프로토콜에서는 분리된 단일 세포에서 위 오가노이드를 시작하고 단편화를 통해 오가노이드를 통과시키는 방법을 제공하는 데 중점을 둡니다. 중요한 것은 이 프로토콜이 초기 세포 파종 밀도에 대한 표준화된 접근 방식이 양성 생검 조직에서 일관되게 위 오가노이드를 생성하고 오가노이드 성장의 표준화된 정량화를 가능하게 한다는 것을 보여줍니다. 마지막으로, 증거는 위 PDO가 오가노이드가 신체의 생검에서 유래했는지 또는 위의 전방 영역에서 유래했는지에 따라 다양한 형성 및 성장 속도를 나타낸다는 새로운 관찰을 뒷받침합니다. 특히, 오가노이드 개시를 위해 전방 생검 조직을 사용하면 위체의 생검에서 생성된 오가노이드와 비교할 때 20일 동안 더 많은 수의 오가노이드가 형성되고 더 빠른 오가노이드 성장이 발생하는 것으로 나타났습니다. 본 명세서에 기술된 프로토콜은 연구자에게 위 PDO를 성공적으로 생성하고 작업하기 위한 시기적절하고 재현 가능한 방법을 제공한다.

서문

오가노이드는 ^{1,2에서 파생된} 장기의 구조와 기능을 닮은 소형 3차원(3D) 세포 구조입니다. 이러한 실험실 성장 모델은 줄기 세포 또는 조직 특이적 세포를 통제된 환경에서 배양하여 생성되며, 이를 통해 세포가 다양한 세포 유형으로 자체 조직화되고 분화할 수 있습니다 ^1,2,3. 오가노이드의 주요 장점 중 하나는 기존의 2차원(2D) 세포 배양보다 인간 생물학을 더 면밀히 재현할 수 있다는 것입니다 ^1,2,3. 특히, 인간 오가노이드는 기원 조직의 유전적 다양성을 유지하는 것으로 나타났습니다 ^3,4,5. 오가노이드는 통제된 실험실 환경에서 인간 장기 발달을 연구하고, 질병을 모델링하고, 잠재적....

프로토콜

이 프로토콜에 사용된 모든 인체 조직은 펜실베니아 대학교 기관 검토 위원회(IRB #842961)에서 승인한 위 조직 수집 연구를 통해 조직 수집에 대한 정보에 입각한 동의를 제공한 개인으로부터 수집되었습니다. 이 연구의 참가자는 일상적인 치료의 일환으로 상부 내시경 검사를 받아야 하고 18세 이상이어야 하며 정보에 입각한 동의를 제공할 수 있어야 했습니다. 수행된 모든 연구는 펜실베니아 대학교에서 정한 지침을 준수했습니다.

1. 실험 준비

1. 앞서 설명한 대로 컨디셔닝된 L-WRN 매체를 준비합니다¹⁶. 필수는 아니지만 컨디셔닝된 배지에 포함된 Wnt-3A, R-spondin 및 noggin의 농도는 제조업체의 지침에 따라 시판되는 ELISA 키트를 사용하여 확인할 수 있습니다( 재료 표 참조).
2. RPMI-항생제(RPMI-ABX), PBS-항생제(PBS-ABX), PBS-디티오트레이톨(PBS-DTT), 분해 완충액 및 위 오가노이드 배지를 준비합니다(세부 조성은 보충 표 1 참조). 위 오가노이드 배지는 4°C에서 1주일 동안 안정적입니다.
3. 오토클레이브 겸자,....

토론

여기에서, 위체 및 antrum의 양성 상피의 생검으로부터 분리된 단일 세포로부터 인간 위 오가노이드를 신뢰성 있게 생성하기 위한 상세한 프로토콜이 개략적으로 설명된다. 프로토콜의 중요한 단계는 타이밍과 기저 멤브레인 매트릭스 처리와 관련이 있습니다. 생존력을 보존하려면 생검 조직을 획득한 후 가능한 한 빨리 프로토콜을 시작하는 것이 중요합니다. 목표는 생검 후 30분 이내에 생검 조?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
A83-01	R&D Systems	2939
Advanced DMEM/F12	Gibco	12634-010
Amphotericin B	Invitrogen	15290018
B27	Invitrogen	17504044
BZ-X710	Keyence	n/a
cellSens	Olympus	n/a
Collagenase III	Worthington	LS004182
Dispase II	Sigma	D4693-1G
Dithiothreitol (DTT)	EMSCO/Fisher	BP1725
DPBS	Gibco	14200-075
Fungin	InvivoGen	NC9326704
Gastrin I	Sigma Aldrich	G9145
Gentamicin	Invitrogen	1570060
Glutamax	Gibco	35050-061
hEGF	Peprotech	AF-100-15
HEPES	Invitrogen	15630080
hFGF-10	Peprotech	100-26
L-WRN Cell Line	ATCC	CRL-3276
Matrigel	Corning	47743-715
Metronidazole	MP Biomedicals	155710
N2 Supplement	Invitrogen	17502048
Noggin ELISA Kit	Novus Biologicals	NBP2-80296
Pen Strep	Gibco	15140-122
RPMI 1640	Gibco	11875-085
R-Spondin ELISA Kit	R&D Systems	DY4120-05
Wnt-3a ELISA Kit	R&D Systems	DY1324B-05
Y-27632	Sigma Aldrich	Y0503