유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 사용한 바이러스 감염 인간 장 오가노이드 단층의 라이브 칼슘 이미징

요약

이 프로토콜은 바이러스에 감염된 인간 장 오가노이드에서 칼슘 이미징을 수행하기 위한 접근 방식을 설명하고 분석에 대한 접근 방식을 제공합니다.

초록

칼슘 신호전달은 거의 모든 조직의 필수 조절자입니다. 장 상피 내에서 칼슘은 분비 활동, 액틴 역학, 염증 반응, 줄기 세포 증식 및 기타 많은 특성화되지 않은 세포 기능의 조절에 관여합니다. 따라서 장 상피 내의 칼슘 신호 역학을 매핑하면 항상성 세포 과정에 대한 통찰력을 제공하고 다양한 자극에 대한 고유한 반응을 밝힐 수 있습니다. 인간 장 오가노이드(HIO)는 장 상피를 연구하기 위한 고처리량 인간 유래 모델로, 칼슘 역학을 조사하는 데 유용한 시스템입니다. 이 논문에서는 유전적으로 인코딩된 칼슘 표지자(GECI)를 사용하여 HIO를 안정적으로 transduction하고, 실시간 형광 현미경 검사를 수행하고, 이미징 데이터를 분석하여 칼슘 신호를 의미 있게 특성화하는 프로토콜을 설명합니다. 대표적인 예로, 3차원 HIO를 렌티바이러스로 transduction하여 녹색 형광 단백질 기반 세포질 GECI인 GCaMP6를 안정적으로 발현시켰습니다. 그런 다음 엔지니어링된 HIO를 단일 세포 현탁액으로 분산하고 단층으로 파종했습니다. 분화 후, HIO 단층을 로타바이러스에 감염시키거나 칼슘 반응을 자극하는 것으로 알려진 약물로 처리하였다. 온도 제어, 가습 라이브 이미징 챔버가 장착된 형광 현미경을 사용하면 감염되거나 약물로 처리된 단층의 장기 이미징이 가능합니다. 이미징 후 무료로 제공되는 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 획득한 이미지를 분석했습니다. 전반적으로, 이 연구는 HIO에서 세포 신호 전달을 특성화하기 위한 적응 가능한 파이프라인을 구축합니다.

서문

칼슘은 세포 생리학을 조절하는 데 중요한 역할을 하는 널리 보존된 두 번째 전달자이다¹. 생리적 조건에서 강한 전하, 작은 크기 및 높은 용해도를 감안할 때 칼슘은 단백질 구조의 이상적인 조작제입니다. 따라서 칼슘은 전기화학적 신호를 효소, 전사 또는 전사 후 변화로 변환하는 강력한 수단이 됩니다. 소포체(ER)와 원형질막을 가로지르는 엄격한 칼슘 농도 구배는 세포질 칼슘 농도의 급격한 변화를 가능하게 하는 높은 추진력을 생성합니다. 버퍼링과 활성 전송을 모두 포함하는 여러 메커니즘은 이 기울기를 긴밀하게 유지합니다. 정상적인 세포 기능을 위해 필요하기는 하지만, 이러한 유지는 에너지 비용이 많이 들기 때문에 스트레스 상태에서 특히 취약하다 ².

이와 같이, 세포질 내의 칼슘 조절 장애는 많은 종류의 세포 스트레스의 거의 보편적인 신호입니다. 대사 장애, 독소, 병원균, 기계적 손상 및 유전적 교란은 모두 칼슘 신호 전달을 방해할 수 있습니다. 자극에 관계없이, 전체 세포 수준에서 세포질 칼슘의 지속적이고 통제되지 않은 상승은 세포 사멸을 촉진하고 결국 괴사를 촉진할 수 있습니다 ^3,4

프로토콜

이 프로토콜과 대표 실험에 사용된 모든 인간 장 오가노이드(HIO)는 Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core에서 획득하고 유지 관리하는 인체 조직에서 파생되었습니다. 모든 샘플은 Baylor College of Medicine의 Institutional Review Board에서 승인한 프로토콜에 따라 수집되었습니다.

1. 재료 및 시약의 준비

1. 오가노이드 유지를 위해 세포 배양 처리된 24웰 플레이트, 기저막 매트릭스(BMM), 15mL 코니컬 튜브 및 1.5mL 코니컬 튜브를 수집합니다.
   1. 성장 인자(CMGF-)가 없는 완전한 배지를 준비하려면 500mL의 고급 DMEM F12에 1M HEPES 5mL, 100x 항생제-항진균제 5mL, 100x 글루타민 보충제 5mL를 추가합니다.
   2. Wnt-, R-spondin- 및 Noggin 함유 (WRNE) 배지를 제조하려면 CMGF 및 Wnt 조절 배지를 동일한 비율로 혼합하고 Noggin 조절 배지, 10 부피 %, R-spondin 조절 배지, 20 부피 %, 50 ng / mL 인간 표피 성장 인자, 10 mM 니코틴아미드, 10 nM [Leu15] -Gastr....

토론

세포질 Ca²⁺ 수준의 변화는 상피 내 병리학의 원인이자 결과일 수 있습니다^10,16,17. 세포질 칼슘의 증가는 칼슘 의존성 염화물 채널의 활성화를 통해 분비를 직접 유도할 수 있습니다^18,19 TMEM16A. Ca^{2 +}에 대한 반응으로 TMEM16A의 활성화는 염화물의 정점 유출을 허용하여 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
[Leu15]-Gastrin I	Sigma-Aldrich	G9145
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
0.05% Trypsin EDTA	Gibco	25300054
1.5mL microcentrifuge tubes	Fisherbrand	5408137
15mL conical tubes	Thermofisher Scientific	0553859A
16% formaldehyde	Thermofisher Scientific	28906
1M HEPES	Gibco	15630080
1M HEPES	Gibco	15630080
1X PBS	Corning	21-040-CV
25 gauge needle	Thermofisher Scientific	1482113D
A-83-01	Tocris	2939
ADP	Sigma-Aldrich	A2754
Advanced DMEM F12	Gibco	12634028
Antibiotic-antimycocytic	Gibco	15240062
Antibiotic-antimycotic	Gibco	15240062
B27 Supplement	Gibco	17504-044
Bovine serum albumin	FisherScientific	BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments	Greiner	543979
Collagen IV	Sigma Aldrich	C5533
DAPI	Thermofisher Scientific	D1306
EDTA	Corning	46-034-CI
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fetal bovine serum	Corning	35010CV
Fluorobrite	Gibco	A1896701
GlutaMAX	Gibco	35050079
GlutaMAX	Gibco	35050079
Human epidermal growth factor	ProteinTech	HZ-1326
Lentivirus	VectorBuilder	(variable)
Matrigel	BD Biosceicen	356231/CB40230C
N2 Supplement	Gibco	17502-048
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A9165-5G
NH4Cl	Sigma-Aldrich	A9434
Nicotinamide	Sigma-Aldrich	N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates	Thermofisher Scientific	142475
Polybrene	MilliporeSigma	TR1003G
SB202190	Sigma-Aldrich	S70767
Triton X-100	Fisher BioReagents	BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Thermofisher Scientific	12604013
Trypsin	Worthington Biochemical	NC9811754
Y-27632	Tocris	1254