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요약

여기에서는 당뇨병성 신병증 치료에서 Jiawei Shengjiang San(JWSJS)의 작용 메커니즘을 탐구하기 위해 네트워크 약리학 및 분자 도킹 기술을 설명하는 프로토콜을 제시합니다.

초록

우리는 당뇨병성 신증을 치료하고 네트워크 약리학을 배포하기 위한 Jiawei Shengjiang San(JWSJS)의 조치를 뒷받침하는 메커니즘을 탐구하는 것을 목표로 했습니다. 네트워크 약리학 및 분자 도킹 기법을 사용하여 JWSJS의 활성 성분과 표적을 예측하고 세심한 "약물-성분-표적" 네트워크를 구축했습니다. 유전자 온톨로지(Gene ontology, GO) 및 교토 유전자 및 게놈 백과사전(Kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG) 농축 분석을 활용하여 JWSJS의 치료 경로와 표적을 식별했습니다. 분자 도킹 검증을 위해 Autodock Vina 1.2.0을 배포하고, 도킹 결과를 확인하기 위해 100ns의 분자 역학 시뮬레이션을 수행한 후 in vivo 동물 검증을 수행했습니다. 그 결과, JWSJS는 당뇨병성 신증과 교차하는 227개의 표적을 공유하여 단백질-단백질 상호작용 네트워크 토폴로지를 구축한 것으로 밝혀졌습니다. KEGG 농축 분석은 JWSJS가 지질 및 죽상동맥경화증, PI3K-Akt 신호전달 경로, 세포사멸 및 HIF-1 신호전달 경로를 조절하여 당뇨병성 신병증을 완화하며, 미토겐 활성화 단백질 키나아제 1(MAPK1), MAPK3, 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 및 세린/트레오닌 단백질 키나아제 1(AKT1)을 여러 경로의 집합적 표적으로 식별함으로써 당뇨병성 신병증을 완화하는 것으로 나타났습니다. 분자 도킹은 JWSJS의 핵심 구성 요소(퀘르세틴, 팔미톨레산, 루테올린)가 수소 결합을 통해 세 가지 핵심 대상(MAPK1, MAPK3 및 EGFR)과의 형태를 안정화할 수 있다고 주장했습니다. 생체 내 검사에서 JWSJS로 인한 체중 증가와 당혈청 단백질(GSP), 저밀도 지단백 콜레스테롤(LDL-C), 우리딘 삼인산(UTP) 및 공복 혈당(FBG) 수치의 감소가 눈에 띄게 나타났습니다. 헤마톡실린 및 에오신(HE) 및 주기적 산-쉬프(PAS) 염색과 결합된 전자 현미경은 p-EGFR, p-MAPK3/1 및 BAX의 다양한 감소와 치료된 쥐의 신장 조직에서 BCL-2 발현의 증가를 나타내며 다양한 범위로 신장 손상을 완화하는 데 있어 각 치료군의 잠재력을 강조했습니다. 결론적으로, 이러한 통찰은 당뇨병성 신증에 대한 JWSJS의 보호 효능이 EGFR/MAPK3/1 신호전달 경로의 활성화를 억제하고 신장 세포 사멸을 완화하는 것과 관련이 있을 수 있음을 시사합니다.

서문

당뇨병(Diabetes mellitus, DM)은 여러 시스템에 영향을 미치는 만성 질환으로, 당뇨병성 신증(DN), 망막병증, 신경병증 등 지속적인 고혈당증으로 인해 다양한 합병증을 유발할 수 있다1. DN은 말기 신장 질환(ESRD)의 약 30%-50%를 차지하는 DM의 심각한 합병증입니다2. 임상적 증상은 미세알부민뇨증으로, 사구체 부피 증가, 간막 기질 증식, 두꺼워진 사구체 기저막 등을 특징으로 하는 ESRD로 진행될 수 있다3. DN의 발병 기전은 복잡하며 완전히 밝혀지지 않았습니다. 혈당을 낮추고, 혈압을 조절하고, 단백뇨를 줄이는 등의 임상적 방법이 주로 진행을 지연시키는 데 사용되지만 효과는 일반적입니다.

현재로서는 DN4를 치료하는 특정 약물이 발견되지 않았습니다. 그러나 수 세기 동안 한약은 당뇨병과 그 합병증을 치료하는 데 널리 사용되어 왔으며5 환자의 임상 증상을 개선하고 질병 진행을 지연시켰다. multi-component, multi-target, multi-pathway effect의 장점으로 인해 한약은 DN6 치료를 위한 혁신적인 약물 공급원이 될 것으로 기대됩니다.

"Shengjiang san"은 명나라 의사 Gong Tingxian의 "Wanbing Huichun"에서 유래했습니다. "Neifu Xianfang"이라는 책은 Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma 및 Radix Rhei et Rhizome의 사용을 설명합니다. 이를 바탕으로 Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis Glabrae Rhixoma를 첨가 한 후 명료성을 높이고, 탁도를 낮추고, 정체 된 "열"을 방출하고, "기"와 혈액을 조화시키는 성강산의 기능을 발휘합니다 7,8. 또한 비장을 강화하고 신장을 강화하는 효과를 증가시킵니다. 그 효능은 "생명 에너지"의 결핍, 과도한 건조 및 "열", 트리플 에너자이저 7,8에 의한 "열"의 정체로 인해 DN의 "기"가 상승 및 하강하는 병인과 일치합니다.

이전 임상 연구에 따르면 중국 약초가 DM과 그 합병증을 치료하는 데 사용되었으며, jiawei shengjiang san(JWSJS)은 혈당과 지질을 조절하고 단백뇨를 줄이며 초기 DN7 환자의 임상 효능을 크게 향상시키는 것으로 나타났습니다. DN 쥐의 요로 단백질과 혈당 수치를 낮추는 JWSJS의 능력은 이전 연구에서 확인되었습니다. 이는 TXNIP/NLRP3 및 RIP1/RIP3/MLKL 신호전달 경로를 억제하고, podocyte pyroptosis를 감소시키며, DN rats의 신장 조직에서 괴사성 세포사멸을 예방하여 신장 보호를 달성함으로써 발생하는 것으로 보인다9. JWSJS는 네프린 및 포도신 단백질 발현을 상향 조절하고 DN 랫트의 족세포 손상을 줄일 수 있으며, 이는 JWSJS가 족세포 손상에 대한 억제 효과가 있음을 시사합니다. JWSJS는 안전성 프로필이 우수하고 특정 항DN 효과가 있지만 이에 대한 연구는 거의 없으며 이 연구는 주로 발열증 및 괴사성 세포사멸에 중점을 둡니다. 문헌이 충분히 깊거나 체계적이지 않다10. 우리의 이전 연구 결과는 JWSJS가 DN 쥐에서 단백뇨를 줄이고 신장 손상을 완화할 수 있음을 확인했다7. 그러나 DN 치료를 위한 JWSJS의 메커니즘에 대한 연구는 소수에 불과하며 이러한 연구는 깊이와 체계화가 부족합니다. 따라서 본 연구는 네트워크 약리학을 이용하여 DN 치료를 위한 JWSJS의 분자 물질 및 작용 기전을 분석하고 향후 연구를 위한 탄탄한 기반을 제공하는 것을 목표로 합니다.

네트워크 약리학은 화학정보학, 네트워크 생물학, 생물정보학 및 약리학을 포함하여 약물 작용의 메커니즘을 연구하는 새로운 방법입니다11,12. 네트워크 약리학 연구 설계는 중국 전통 의학의 전체론적 개념13,14과 매우 유사하며, 한약의 메커니즘을 연구하는 중요한 방법입니다. 분자 도킹은 분자 간의 상호 작용을 연구하고 분자의 결합 패턴과 친화도를 예측할 수 있습니다. 분자 도킹(molecular docking)은 컴퓨터 보조 약물 연구 분야에서 중요한 기술로 부상했다15. 따라서 본 연구는 네트워크 약리학 및 분자 도킹 방법을 통해 JWSJS-DN-target 상호 작용 네트워크를 구축하여 JWSJS를 사용한 DN 치료에 대한 추가 연구를 위한 신뢰할 수 있고 이론적인 기반을 제공합니다.

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프로토콜

모든 동물은 미국 국립 연구 위원회(US National Research Council)의 실험동물 관리 및 사용 지침(US National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals,8th Edition)에 따라 유지 및 사용되었으며, ARRIVE 가이드라인16,17에서 권장하는 대로 보고되었습니다. 이 연구는 중국 국가연구위원회(China National Research Council)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(China National Research Council Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었으며 허베이 중의과대학(Hebei University of Chinese Medicine, DWLL2019030)의 동물 윤리 위원회(Animal Ethics Committee)의 승인을 받았습니다.

1. JWSJS 유효성분 및 목표 수집

  1. 의약 조성 JWSJS(Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba, Smilacis glabrae rhixoma, radix rhei et rhizome, Curcumaelongae rhizoma)를 전통 한약 시스템 약리학 데이터베이스 및 분석 플랫폼(TCMSP) 데이터베이스(18)에 입력하여 모든 화학 성분을 검색합니다.  ADME(Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion)에 따르면 구강 생체이용률(OB) ≥ 30%, 약물 유사 특성(DL) ≥ 0.18 화학 성분19,20을 스크리닝합니다.
  2. TCMSP 데이터베이스(https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php, 버전 2.3)를 사용하여 화학 성분의 해당 대상을 검색합니다.
  3. Bombyx Batryticatus 및 Cicadae Periostracum의 활성 성분은 Traditional Chinese Medicine and Chemical Composition 데이터베이스를 검색하여 얻을 수 있습니다21.
  4. 실험적 신뢰성을 위해 이 연구에 대한 CAS(Chemical Abstracts Service) 번호가 있는 화합물을 선택하십시오. 그런 다음 PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/, 2021년 업데이트)22에서 활성 성분의 2D 구조 다이어그램(.sdf 형식)을 다운로드합니다.
  5. SwissADME(www.swissadme.ch, 2021년 업데이트)23를 사용하여 ≥ 2개 항목이 '예'인 약물 유사성으로 위장(GI) 흡수율이 높은 성분(Lipinski, Ghose, Veber, Egan, Muegge)을 스크리닝합니다. 이로 인해 Bombyx Batryticatus 와 Cicadae Periostracum의 활성 구성 요소가 생겼습니다.
  6. 표적 단백질 예측을 위해 이를 TCMSP 데이터베이스로 가져옵니다(https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php, 버전. 2.3)18.
  7. UniProt 데이터베이스(https://www.uniprot.org, 2021년에 업데이트됨)의 대상을 검토 됨으로 설정하고 종을 Human24로 설정하여 표준화합니다.

2. DN 대응 대상 수집

  1. GeneCards(https://www.genecards.org/, 버전 5.1)25, OMIM(https://omim.org/, 2021년 업데이트)26, TTD(http://db.idrblab.net/ttd/, 2021년 업데이트)27, PharmGKB(https://www.pharmgkb.org/, 2021년 업데이트)28 및 DrugBank 데이터베이스(https://www.drugbank.ca/, 2021년 업데이트)29를 통해 당뇨병성 신병증을 검색합니다. 결합 및 중복 제거 후 DN의 대상을 얻습니다.
  2. JWSJS와 DN의 공통대상 스크리닝 및 네트워크 구축
    1. R 4.2.0 소프트웨어를 사용하여 JWSJS 및 DN의 공통 대상을 스크리닝하고 벤 다이어그램을 그립니다. JWSJS의 활성 성분 및 잠재적 표적을 Cytoscape 3.8.0 소프트웨어30 으로 가져와 약물, 성분, 표적 및 질병 간의 연결을 시각화하는 약물-성분-표적 네트워크 다이어그램을 구축합니다.
    2. 노드의 크기가 degree 값의 크기를 반영하도록 하며, degree 값이 높을수록 노드가 네트워크에서 더 중요하다는 것을 나타냅니다.
  3. PPI 단백질-단백질 상호작용 네트워크 구축 및 핵심 타겟 스크리닝
    1. 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크31을 구축하기 위해 온라인 플랫폼 STRING(버전:11.5)을 사용하여 교차하는 유전자를 분석한다. 다중 단백질 분석 모드를 사용하여 네트워크를 구성하고, 종을 호모 사피엔스로 설정하고, 필요한 최소 상호 작용 점수를 >0.930으로 설정합니다.
    2. Cytoscape 3.8.0을 사용하여 네트워크를 토폴로지적으로 분석하고, 각 노드에 대한 BC(betweenness centrality), CC(closeness centrality), DC(degree centrality), EC(Eigenvector centrality), LAC(Local Average Connectivity-based Method) 및 NC(Network Centrality) 값을 계산하고, 모든 값이 중앙값32보다 큰 6개의 노드를 선별합니다. DN 요법을 위한 JWSJS의 핵심 표적을 식별하기 위해 이 과정을 여러 번 반복합니다.
  4. GO 기능 분석 및 KEGG 경로 농축 분석
    1. GO 및 KEGG 농축 분석을 수행하여 JWSJS 및 DN의 공통 표적과 관련된 생물학적 과정, 분자 기능, 세포 구성 요소 및 경로를 식별합니다.
    2. org를 사용합니다 . Hs.eg.db 패키지를 사용하여 교차 대상의 ID를 가져오고 clusterProfiler, org를 사용합니다. 농축 분석을 위한 Hs.eg.db, Enrichplot 및 ggplot2 패키지33.
    3. P-값이 0.05로 보정된 상위 10개의 생물학적 적중< 대한 기능적 GO 농축 분석을 스크리닝하고 KEGG 분석을 위해 농축이 가장 높은 상위 30개 경로를 선택합니다.

3. 분자 도킹

  1. AutoDock Vina 소프트웨어를 사용하여 JWSJS 핵심 구성 요소와 DN요법 34의 핵심 타겟 간에 분자 도킹을 수행합니다.
  2. PubChem 데이터베이스에서 검색하여 JWSJS 핵심 구성 요소의 2D 구조에 대한 sdf 파일을 가져옵니다. ChemBio 3D Ultra14.0 소프트웨어를 사용하여 3D 구조를 생성 및 최적화하고, mol2 형식으로 저장하고, 리간드 파일로 사용할 수 있습니다.
  3. RCSB(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics) PDB(Protein Data Bank) 데이터베이스에서 핵심 표적의 3D 구조의 pdb 형식을 찾아 다운로드합니다. Pymol 2.4.0 소프트웨어를 사용하여 단백질 구조에서 물 분자와 리간드를 제거하고 pdb 형식으로 저장한 다음 수용체 파일로 사용합니다.
  4. 수소화를 위해 수용체 pdb 파일을 AutoDockTools 1.5.7 소프트웨어로 가져오고, 수용체 단백질과 소분자 리간드를 모두 pdbqt 형식으로 변환하고, 간격 계수가 1로 설정된 수용체 단백질의 활성 포켓을 설정합니다.
  5. 분자 도킹을 위해 Autodock vina 1.2.0을 사용하고 결합 에너지를 계산하십시오. 친화도가 0< 경우 분자가 단백질과 자발적으로 결합한다는 점을 고려하면 친화도의 절대값이 클수록 단백질 간의 결합이 더 안정적임을 나타냅니다. 마지막으로 Pymol 2.3.0 및 LigPlot 2.2.5 소프트웨어를 사용하여 도킹 결과를 시각화합니다.

4. 분자 역학 시뮬레이션

  1. Desmond 소프트웨어를 사용하여 MD 시뮬레이션을 수행하려면 다음 단계를 따르십시오.
    1. 단백질-리간드 상호 작용의 안정성과 유연성을 평가하기 위해 2019-1 아카데믹 버전의 Desmond 소프트웨어를 사용합니다.
    2. 도킹 연구에서 파생된 가장 유망한 리간드 복합체 3종에 대한 분자 역학(MD) 조사를 수행합니다. 0.15M NaCl의 SPC 수성 환경에서 시뮬레이션을 수행하여 생리학적 이온 조건을 복제합니다. 시뮬레이션 박스는 용질이 경계에서 최소 10 Å 떨어져 있도록 설계되었습니다. 카운터이온은 시스템의 전하를 중화하기 위해 도입됩니다. 또한 OPLS 2005 힘 필드의 매개변수에 의해 제어되는 주기적 경계 조건이 적용됩니다.
    3. Desmond 기본 매개변수를 사용하여 100ps에 대한 에너지 최소화 단계를 시작합니다.
    4. 모든 생산 MD 시스템에서 Nosé-Hoover 체인 및 Martyna-Tobias-Klein 방법론을 통해 26.85°C(300K) 및 1.01325bar에서 온도 및 압력 안정화를 보장합니다. 분자 역학 시뮬레이션은 총 100ns의 기간 동안 2fs의 시간 단계로 실행되어 100ps마다 원자 좌표를 기록합니다.
    5. 시뮬레이션 상호 작용 다이어그램(SID) 모듈을 엽니다. 시뮬레이션 결과 데이터 파일을 모듈에 불러옵니다.
    6. 모듈에서 사용할 수 있는 옵션(예: RMSD(제곱 평균 제곱근 편차), RMSF(제곱 평균 제곱근 변동), 수소 결합 분석 등)에서 원하는 분석 유형을 선택합니다. 선택한 분석 유형에 필요한 추가 매개변수를 지정합니다.
    7. Analyze(분석) 또는 Start(시작) 버튼을 클릭하여 분석을 실행합니다.
    8. 분석이 완료되면 SID 모듈 인터페이스 내에서 결과를 보고 해석합니다. 추가 사용 또는 프리젠테이션을 위해 필요한 경우 결과를 내보냅니다.

5. 동물실험 검증

  1. 동물과 실험 설계
    참고: 이 연구는 SPF 등급 동물 생산 시설에서 얻은 75마리의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 대상으로 했으며, 생후 8주령의 체질량은 150g ± 20g(동물 생산 증명서 번호 SCXK[Hebei] 2018-004)이었습니다.
    1. SPF 수준의 동물 실험실에 쥐를 수용하고 적응 섭식 1주일 후 무작위로 정상 그룹과 모델 그룹으로 나눕니다. 정상 그룹에는 일반 식단을 제공하고 모델 그룹에는 고설탕 및 고지방 식단을 제공합니다. 4 주 후에는 쥐를 금식시키되 12 시간 동안 물을 빼앗지 마십시오.
    2. 모델군에 스트렙토조토신(STZ; 35mg·kg-1)의 복강내 주사를 주입합니다. 72시간 후 꼬리 정맥 혈액 샘플링을 통해 혈당 수치를 테스트합니다. 공복 혈당 수치가 ≥16.7mmol· L-1, 성공적인 당뇨병 모델로 확인하십시오.
    3. 쥐 신장의 조직병리학적 변화를 관찰하여 성공적인 DN 모델을 확인합니다.
    4. 성공적으로 복제된 모델을 4.37g/kg, 8.73g/kg 및 17.46g/kg(임상적 등가 용량의 3.2, 6.3 및 12.6배에 해당)으로 JWSJS를 받은 모델 그룹과 이르베사르탄 그룹(0.014g/kg)으로 무작위로 나눕니다. 각 그룹은 10마리의 쥐로 구성되었습니다. 하루에 한 번 경구 투여를 통해 모든 약물을 투여하십시오. 이 투여 요법을 4주 동안 일관되게 유지하십시오.
    5. 1% 펜토바르비탈 나트륨(50mg/kg)의 복강 내 주사를 사용하여 쥐를 마취하고 페달 철수 반사의 상실로 적절한 마취를 확인합니다. 안락사 전에 복부 대동맥에서 혈액 샘플을 채취합니다.
    6. 150mg/kg의 용량으로 펜토바르비탈 나트륨의 복강 내 주사를 사용하여 쥐를 안락사시킨 후 신장을 채취합니다.
      참고: 동물들은 안락사에 대한 가장 업데이트된 미국 수의학 협회(AVMA) 지침(https://www.avma.org/resources-tools/avma-policies/avma-guidelines-euthanasia-animals)에 따라 인도적으로 안락사되었습니다.
  2. 신장 조직학 분석
    참고 : 신장 조직을 4 % 파라 포름 알데히드에 고정하고 48 시간 후에 에탄올에서 탈수했습니다. 절편은 파라핀에 박혀 있었다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신(HE) 및 주기적 산-쉬프(PAS) 염색을 위해 얇은(4μm) 조각으로 절단하고 광학 현미경으로 신장 조직학의 형태학적 변화를 관찰했습니다.
    1. HE 염색:
      1. 탈왁스 및 수분 공급: 조직 절편을 크실렌 I 및 II(각 10분), 절대 알코올 I 및 II(각 3분)로 처리합니다. 그런 다음 조직 절편을 95%, 90%, 80% 및 70% 에탄올(각 2분)에 담근 다음 증류수를 5분 동안 세척합니다.
      2. 조직 절편을 헤마톡실린 염색제에 5분 동안 놓고 5초 동안 염산 알코올로 절편을 분화합니다.
      3. 섹션을 eosin 염색 용액에 3분 동안 넣습니다.
      4. 탈수, 청소 및 장착: 다양한 에탄올(70%,80%,90%,95% 및 절대 에탄올)에서 다양한 시간에 섹션을 탈수한 다음 크실렌 I 및 II로 청소한 다음 중성 검으로 장착합니다.
    2. PAS 염색:
      1. 5.2.1 단계에 설명 된 탈왁스 단계를 따르고 ~ 8 분 동안 주기적인 산성 염색 용액으로 섹션을 처리합니다.
      2. 절편을 증류수로 2분 동안 헹구고 어두운 곳에서 15분 동안 Schiff 시약으로 염색합니다.
      3. Schiff 시약으로 처리한 후 단면을 수돗물로 10분 동안 세척합니다.
      4. 헤마톡실린을 사용하여 절편을 1분 동안 대조염색한 다음 HCl-알코올로 30초 동안 분화합니다. 단면을 수돗물로 5분 동안 다시 세척하여 핵을 파란색으로 착색합니다.
    3. 전자 현미경:
      1. 샘플을 2.5% 글루타르알데히드에 3시간 동안 고정한 다음 PBS에서 3시간 동안 헹굽니다. 또한, 샘플을 1% 오스믹산으로 3시간 동안 처리한 다음 PBS에서 3시간 동안 다시 헹굽니다.
      2. 아세톤으로 끝나는 일련의 점진적인 알코올 목욕을 통해 탈수합니다(각 단계는 총 약 2시간 동안 지속됨).
      3. 에폭시 프로판과 에폭시 수지(1:1)의 혼합물로 실온(RT)에서 2시간 동안 샘플에 침투시킨 다음 37°C에서 순수 에폭시 수지를 추가로 2시간 동안 침투시킵니다.
      4. 그런 다음 절단하기 전에 36시간 동안 점점 더 높은 온도에서 샘플을 경화하고 경화시킵니다. 이 공정은 조직이 수지로 완전히 침투하도록 한 다음 전자 현미경을 위해 얇게 썰 수 있도록 경화시킵니다.
      5. 3% 우라닐 아세테이트와 납산으로 이중 염색하고 15분 이내에 전자 현미경으로 샘플을 관찰하고 사진을 찍습니다.
        참고: 투과 전자 현미경(TEM) 설정은 고대비 모드(Zoom-1 HC-1)에서 7000배 확대, TEM 시스템에서 80.0kV의 가속 전압입니다.
  3. 면역조직화학(Immunohistochemistry)
    1. 탈왁스: 조직 절편을 크실렌 I과 II에 각각 10분 동안 놓습니다.
    2. 재수화: 탈랍된 조직 부분을 절대 에탄올 I과 II에 각각 3분 동안 연속적으로 배치한 다음 95, 90%, 80% 및 70% 에탄올을 각각 2분 동안 배치하여 재수화합니다.
    3. 항원 채취: 조직 절편을 고압 하에서 0.1M 구연산염-구연산 완충 용액에 약 5분 동안 담근 다음 RT로 냉각합니다.
    4. 차단: 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위해 약 37°C에서 30분 동안 5% 정상 염소 혈청으로 조직 절편을 배양하여 차단합니다.
    5. 1차 항체 배양: 1차 항체 p-EGFR(1:200 희석) 및 p-MAPK3/1(1:200 희석)을 조직 절편에 첨가하고 가습 챔버 내에서 4°C에서 밤새 배양합니다.
    6. 2차 항체 배양: PBS로 절편을 3회 세척한 다음 비오틴 표지 2차 항체(제조업체의 지침에 따라 PBS에 희석)를 절편에 추가하고 37°C에서 30분 동안 배양합니다.
    7. 고추냉이 과산화효소 접합 스트렙타비딘 작업 용액을 37°C에서 조직 절편에 적용한 후 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 세 번 세척합니다.
    8. DAB 현상을 위해 DAB 현상 용액으로 섹션을 배양한 다음(RT의 어두운 곳에서 3분) 증류수로 헹굽니다. DAB는 산화 시 갈색으로 변하는 고추냉이 과산화효소(HRP)의 발색체 기질로 작용합니다.
    9. 약 2분 동안 카운터염색을 위해 헤마톡실린을 사용하고 5초 동안 1% 염산 알코올로 섹션을 구별한 다음 흐르는 물에 씻어 파란색으로 변합니다.
    10. 저농도에서 고농도까지 일련의 에탄올에 섹션을 연속적으로 배치하고 크실렌 I 및 II를 투명하게 하여 탈수하고 중성 검으로 섹션을 장착합니다.
      참고: 이 절차는 하룻밤 동안의 1차 항체 배양을 포함하여 약 18-24시간이 소요됩니다.
    11. 각 단면에 대해 3개의 시야(200×)를 무작위로 선택하고 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 단면의 염색 결과를 분석합니다. Image Pro Plus 6.0 소프트웨어는 아래 단계에 따라 사용되었습니다.
    12. 먼저 섹션의 이미지를 소프트웨어로 가져옵니다.
    13. 밀도 보정: 정확한 결과를 얻으려면 밀도 보정을 수행합니다.
      1. Measure > Calibration > intensity > new > std. optional density > options(선택적 밀도 옵션) > image(이미지)로 이동합니다. 그런 다음 이미지의 빈 영역을 클릭하여 배경 값을 기록하고 확인을 클릭하여 확인합니다.
    14. 측정 파라미터 설정: 측정 파라미터를 설정하여 면적 및 통합 광학 밀도(IOD)를 계산합니다.
      1. Measure > Count/Size > Measure를 클릭하고 측정값을 선택합니다>. Area(100)와 IOD를 선택한 후 OK를 클릭합니다.
      2. Options( 옵션)로 이동하여 Sample, 4-Connect Pre-Filter(샘플, 4-Connect Pre-Filter)에서 Dark Background(어두운 배경) 를 선택하고 OK(확인)를 클릭합니다.
    15. 색상 선택: 양성도를 정확하게 결정하려면 색상을 선택하여 얼룩진 영역과 염색되지 않은 영역을 감지합니다.
      1. 히스토그램 기반 > HSI> 색상 선택을 클릭합니다. S는 변경하지 않고 I는 0에서 배경 값 사이로 유지하면서 그림에 따라 H 값을 조정합니다. 그런 다음 닫기를 클릭하여 확인합니다.
      2. 데이터 수집 및 계산: 이름, Area(합계) 및 IOD(Sum)가 선택된 레이아웃> Measure > Data Collector 클릭하여 데이터 수집 및 계산을 수행합니다. 그런 다음 Count > Collect Now > Data List를 클릭하여 추가 분석 또는 저장을 위해 데이터를 내보냅니다.
        참고: 그 결과 IOD/Area 측면에서 각 섹션의 단백질 발현을 반정량적으로 측정했으며, 이는 분석된 전체 면적에 비해 얼마나 많은 단백질이 존재하는지 나타냅니다.
  4. 웨스턴 블로팅
    1. 신장 조직을 구하여 조각으로 자릅니다. 이 조각을 1.5mL 원심분리기 튜브에 넣고 사전 냉각된 단백질 용해 용액(50mM Tris[pH 7.4],150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% 데옥시콜레이트 나트륨, 0.1% 도데실 설페이트나트륨[SDS])을 넣고 균질화합니다.
    2. 얼음 위에 30분 동안 두었다가 13400 x g 에서 4 °C에서 20분 동안 원심분리합니다. 결과 샘플을 -80 °C 냉동고에 보관하십시오.
    3. Bradford 방법을 사용하여 단백질을 정량화합니다.
      1. 시약과 증류수를 1:4의 비율로 혼합하여 Coomassie Brilliant Blue 작업 용액을 준비합니다.
      2. blank, standard protein group 및 sample protein group의 세 가지 그룹을 설정합니다. 각 그룹에 Coomassie Brilliant Blue 작업 용액 3mL를 추가하고 블랭크 그룹에는 생리식염수를, 표준 그룹에는 표준 단백질을, 샘플 그룹에는 추출된 상층액 단백질을 추가합니다.
      3. 혼합물을 5분 동안 그대로 둔 후 자외선 분광 광도계를 사용하여 흡광도 값을 측정합니다.
      4. 단백질 농도(mg/mL) = (시료 흡광도 값/표준 튜브 흡광도 값) x 표준 단백질 농도 x 5 공식을 사용하여 시료 농도를 계산합니다.
    4. 각 단백질 샘플에 동일한 부피의 6x 로딩 버퍼를 추가합니다. 분취하기 전에 100°C에서 5분 동안 끓이고 나중에 사용할 때까지 -20°C 냉동고에 보관합니다.
    5. 표준 전기영동, 블로팅 및 블로킹을 수행합니다.
      1. 12% 분해능 겔을 사용하여 표준 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)을 수행합니다. 염료 전면이 겔 바닥에 도달할 때까지 적층 겔에 100V, 분해 겔에 120V의 일정한 전압을 적용합니다.
      2. 습식 전달 시스템을 사용하여 4°C의 냉장실에서 100V에서 2시간 동안 폴리비닐리덴 디플루오라이드(PVDF) 멤브레인으로 단백질을 전달합니다.
      3. 단백질 전달 후 RT에서 1시간 동안 TBST에 5% 무지방 우유로 멤브레인을 차단합니다.
    6. TBST에서 1차 항체 EGFR(1:2,000), p-EGFR(1:2,000), MAPK3/1(1:2,000), p-MAPK3/1(1:2,000), Bcl-2(1:2,000), BAX(1:2,000) 및 CAPDH(1:5,000)를 5% BSA로 희석합니다. 이 희석된 1차 항체를 추가하고 4°C에서 부드럽게 교반하면서 밤새 멤브레인을 배양합니다.
    7. TBST로 멤브레인을 3회 세척한 후 희석된 2차 항체(1:5,000)를 첨가한 후 1시간 동안 배양합니다. 색상 개발 후 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 대상 대역의 정량 분석을 수행합니다.
  5. qPCR 분석
    1. 그룹화 : 샘플을 그룹에 할당합니다 - Control, DN, Irbesartan, JWSJS-L, JWSJS-M, JWSJS-H.
    2. RNA 추출: 조직 균질화 및 RNA 추출을 수행한 후 제조업체의 지침에 따라 클로로포름 첨가, 원심분리 및 RNA 침전을 수행합니다.
    3. RNA 침전 및 세척: RNA를 이소프로판올로 침전시키고 에탄올로 세척합니다.
    4. RNA 용해: RNA 펠릿을 건조시키고 DEPC 처리된 물에 녹입니다.
    5. cDNA 합성: 제조업체의 지침에 따라 특정 반응 혼합물을 사용하여 역전사를 수행합니다.
    6. qPCR 증폭: qPCR에 대해 GAPDH, MAPK3, MAPK1 및 EGFR에 대한 특정 프라이머를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 증폭을 수행합니다.
      프라이머 서열은 다음과 같았다.
      갭디: F-5'-GCAAGTTCAACGGCACAG-3', R-5'-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3';
      MAPK3 : F-5'-AGATCTGTGATTTTGGCCT-3', R-5'-TCAATGGATTTGGTGTAGC-3';
      MAPK1 : F-5'-CCTCAAGCCTTCCAACCTC-3', R-5'-GCCCACAGACCAAATATCA-3';
      EGFR: F-5'-GGGGATGTGATTATTTCTG-3, R-5'-ATTTTGGTCTTTTGATTGG-3'.

6. 통계적 방법

  1. 적절한 소프트웨어(예: SPSS)를 사용하여 분석을 수행하고 측정된 데이터를 표준 편차의 평균± 나타냅니다. 데이터가 정규 분포 및 분산 균질성의 기준을 충족하는 경우 일원 분산 분석을 사용하여 그룹 간에 비교하고 Bonferroni 방법을 사용하여 다중 비교를 수행합니다.
  2. 분산이 동질적이지 않은 경우 다중 비교에 T2 검정을 사용합니다. P < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

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결과

프로토콜에 따라 OB 및 DL의 설정된 표준에 따라 스크리닝 및 중복 제거 후 분석을 통해 JWSJS의 90가지 활성 성분을 최종적으로 얻었습니다. 여기에는 20 종의 Hedysarum Multijugum Maxim, 23 종의 Epimrdii Herba, 15 종의 Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 종의 Radix Rhei et Rhizome, 4 종의 Curcumaelongae Rhizoma, 15 종의 Cicadae Periostracum 및 6 종의 Bombyx Batryticatus 성...

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토론

우리의 연구는 네트워크 약리학, 분자 도킹 및 생체 내 동물 모델의 조합을 사용했습니다. 중요한 단계는 "약물-성분-표적" 네트워크의 구축이었으며, 이는 특히 EGFR/MAPK3/1 신호 경로와의 상호 작용에 중점을 두고 DN 치료에서 JWSJS의 잠재적 메커니즘을 식별하는 데 중요했습니다.

이 연구에서 우리는 예측의 정확도를 높이기 위해 특히 분자 도킹...

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공개

저자는 밝힐 것이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 중국 허베이성 자연과학재단(Natural Science Foundation)의 일반 프로젝트(No. H2019423037)의 지원을 받았습니다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
2×SYBR Green qPCR Master Mix Servicebio, Wuhan, ChinaG3320-05
24-h urine protein quantification (UTP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
3,3'-DiaminobenzidineShanghai Huzheng Biotech, China91-95-2
Automatic biochemical analysis instrumentHitachi, Japan7170A
Anhydrous EthanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
BAX Primary antibodies Affinity, USAAF0120Rat
BCL-2 Primary antibodies Affinity, USAAF6139Rat
BX53 microscopeOlympus, JapanBX53
Chloroform SubstituteECOTOP, Guangzhou, ChinaES-8522
Desmond software New York, NY, USARelease 2019-1
Digital Constant Temperature Water BathChangzhou Jintan Liangyou Instrument, ChinaDK-8D
EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF6043Rat
Embed-812 RESINShell Chemical, USA14900
Fasting blood glucose (FBG)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyserMultiskan; Thermo, USAN/A
GAPDH  Primary antibodies Affinity, USAAF7021Rat
Glycated serum protein (GSP)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
Transmission electron microscopeHitachi, JapanH-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solutionServicebio, USAG1003
Image-Pro PlusMEDIA CYBERNETICS, USAN/A
Real-Time PCR Amplification InstrumentApplied Biosystems, USAiQ5 
Irbesartan tabletsHangzhou Sanofi PharmaceuticalsN/A
IsopropanolBiosharp, Tianjin, ChinaN/A
 JWSJS granulesGuangdong Yifang PharmaceuticalN/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging systemKodak, USAIS2000
Low-density cholesterol (LDL-C)Nanjing Jiancheng Institute of Biological EngineeringN/A
MAPK3/1Primary antibodies Affinity, USAAF0155Rat
Medical CentrifugeHunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China TGL-16K
Mini trans-blot transfer systemBio-Rad, USAN/A
Mini-PROTEAN electrophoresis systemBio-Rad, USAN/A
NanoVue Plus SpectrophotometerHealthcare Bio-Sciences AB, Sweden111765
p-EGFR Primary antibodies Affinity, USAAF3044Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solutionServicebio, USAG1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies Affinity, USAAF1015Rat
Secondary antibodies Santa Cruz, USAsc-2357Rabbit
StreptozotocinSigma, USAS0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis KitGeneCopeia, USAQP056T
TriQuick ReagentSolarbio, Beijing, ChinaR1100
Ultra-Clean WorkbenchSuzhou Purification Equipment, ChinaSW-CJ-1F 

참고문헌

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