감자의 단일 및 결합 스트레스에 대한 형태학적 및 생리학적 반응을 결정하기 위한 고처리량 이미지 기반 표현형 분석

요약

우리는 단일 및 복합 열, 가뭄 및 침수 처리에 대한 형태학적 및 생리학적 반응을 결정하기 위해 이미지 기반 표현형 프로토콜을 설계했습니다. 이 접근 방식을 통해 전체 플랜트 수준, 특히 지상 부품에서 초기, 후기 및 복구 반응을 식별할 수 있었고 여러 이미징 센서 사용의 필요성을 강조했습니다.

초록

고처리량 이미지 기반 표현형은 시간이 지남에 따라 특정 조건에서 식물의 발달 및 성능을 비침습적으로 결정할 수 있는 강력한 도구입니다. 여러 이미징 센서를 사용하면 식물 바이오매스, 광합성 효율, 캐노피 온도 및 잎 반사율 지수를 포함한 많은 관심 특성을 평가할 수 있습니다. 식물은 극심한 폭염, 홍수 및 가뭄으로 인해 작물 생산성이 심각하게 위협받는 현장 조건에서 여러 스트레스에 자주 노출됩니다. 스트레스가 일치하면 시너지 또는 적대적 상호 작용으로 인해 식물에 미치는 영향이 뚜렷할 수 있습니다. 감자 식물이 자연적으로 발생하는 스트레스 시나리오와 유사한 단일 및 복합 스트레스에 어떻게 반응하는지 설명하기 위해 결절화가 시작될 때 선택된 감자 품종(Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta)에 5가지 다른 처리를 가했습니다(예: 제어, 가뭄, 열, 침수 및 열, 가뭄 및 침수 스트레스의 조합). 우리의 분석에 따르면 침수 스트레스는 식물 성능에 가장 해로운 영향을 미치며, 광계 II의 양자 수율 및 효율성 감소, 캐노피 온도 및 수분 지수 증가를 포함하여 기공 폐쇄와 관련된 빠르고 급격한 생리적 반응을 초래했습니다. 열과 결합된 스트레스 치료 하에서, 스트레스의 초기 단계에서 상대적 성장률이 감소하였다. 가뭄과 복합적인 스트레스 하에서, 식물의 부피와 광합성 성능은 떨어지고 스트레스의 후기 단계에서 온도가 증가하고 기공이 폐쇄되었습니다. 선택된 표현형 프로토콜과 함께 정의된 환경 조건에서 최적화된 스트레스 처리의 조합을 통해 단일 및 결합 응력에 대한 형태학적 및 생리학적 반응의 역학을 밝힐 수 있었습니다. 여기에서는 여러 기후 변화 관련 스트레스에 대한 회복력을 나타내는 식물 특성을 식별하려는 식물 연구자에게 유용한 도구를 제공합니다.

서문

폭염, 홍수 및 가뭄 사건의 강도와 빈도 증가를 포함한 기후 변화의 잠재적 영향은 작물 재배에 부정적인 영향을 미칩니다¹. 기후 변화가 작물 변동성에 미치는 영향과 그에 따른 연간 작물 생산량의 변동을 이해하는 것이 중요하다². 인구와 식량 수요가 증가함에 따라 작물 식물의 수확량을 유지하는 것이 어려운 과제가 되었으며, 따라서 육종을 위한 기후 탄력적인 작물을 찾는 것이 시급히 필요합니다 ^3,4. 감자(Solanum tuberosum L.)는 영양가가 높고 물 사용 효율성이 높아 세계 식량 안보에 기여하는 필수 식량 작물 중 하나입니다. 그러나, 불리한 조건 하에서 성장과 수확량의 감소는 특히 감수성이 높은 품종 ^5,6에서 주요 문제이다. 많은 연구에서 농업 관행, 내성이 있는 유전자형 찾기, 스트레스가 발달 및 수확량에 미치는 영향 이해 ^7,8,9를 포함하여 감자 작물 생산성을 유지하기 위한 대체 접근 방식을 조사하는 것의 중요성을 강조했으며, 이는 유럽 감자 재배자(또는 농부)에게도 매우 요구됩니다¹⁰.

이미지 기반 표현형을 포함한 자동화된 표현형 분석 플랫폼은 관심 있는 관련 형질을 선택하는 데 필수적인 식물 구조 및 기능의 정량 분석을 가능하게 합니다^11,12. 고처리량 표현형분석은 재현 가능하고 신속한 방식으로 다양한 형태학적 및 생리학적 관심 특성을 결정하기 위한 고급 비침습적 기법입니다 ¹³. 표현형은 환경 영향과 관련하여 유전형 차이를 반영하지만, 통제된 조건 하의 식물을 스트레스와 비교하면 광범위한 표현형 정보를 특정 (스트레스) 조건에 연결할 수 있다¹⁴. 이미지 기반 표현형은 표현형 변동성을 설명하는 데 필수적이며, 개체군 크기⁽¹⁵)에 관계없이 식물 발달 전반에 걸쳐 일련의 형질을 스크리닝할 수도 있습니다. 예를 들어, RGB(Red-Green-Blue) 이미징 센서를 사용하여 잎의 모양, 크기 및 색상 지수를 포함한 형태학적 특성을 측정하여 식물의 성장과 발달을 결정하는 데 사용됩니다. 또한, 광합성 성능, 캐노피 온도 및 잎 반사율을 포함한 생리학적 특성의 측정은 엽록소 형광, 열적외선(IR) 및 초분광 이미징¹⁶과 같은 여러 유형의 센서를 사용하여 정량화됩니다. 통제된 환경에서의 최근 연구는 감자¹⁷의 열, 보리¹⁸, 쌀¹⁹, 밀²⁰의 가뭄 및 열처리와 같은 비생물적 스트레스 하에서 식물의 다양한 메커니즘과 생리적 반응을 평가하는 데 이미지 기반 표현형을 사용할 수 있는 가능성을 보여주었습니다. 여러 스트레스 상호 작용에 대한 식물의 반응을 연구하는 것은 복잡하지만, 이번 연구 결과는 기후 조건의 급격한 변화에 대처하는 식물의 메커니즘을 이해하는 데 새로운 통찰력을 제공합니다²¹.

식물의 생리학적 및 형태학적 반응은 비생물적 스트레스 조건(고온, 물 부족 및 홍수)에 의해 직접적인 영향을 받아 수확량 감소를 초래한다²². 감자는 다른 작물에 비해 물 사용 효율이 높지만, 뿌리 구조가 얕아 수확량과 수확량에 부정적인 영향을 미친다⁵. 가뭄 수준의 강도와 지속 기간에 따라 잎 면적 지수가 감소하고, 새로운 잎 형성을 억제하는 캐노피 성장의 지연이 스트레스의 후기 단계에서 뚜렷하게 나타나 광합성 속도의 감소를 초래한다²³. 물의 임계값 수준은 과도한 물 또는 장기간의 가뭄 기간으로 인해 매우 중요하며, 산소 제한, 뿌리 수력 전도도 감소 및 가스 교환 제한으로 인해 식물 성장 및 괴경 발달에 부정적인 영향을 미칩니다^24,25. 더욱이, 감자는 최적 수준 이상의 온도로 인해 괴경 시작, 성장 및 동화 속도가 지연되는 고온에 민감하다²⁶. 스트레스가 복합적으로 나타날 때, 생화학적 규칙과 생리적 반응은 개별 스트레스 반응과 다르며, 이는 스트레스 조합에 대한 식물의 반응을 조사할 필요성을 강조한다²⁷. 결합된 스트레스는 식물 성장의 (훨씬 더) 심각한 감소와 생식 관련 형질에 대한 결정적 영향을 초래할 수 있다²⁸. 스트레스 조합의 영향은 각 스트레스가 다른 스트레스에 비해 우세한 정도에 따라 달라지며, 이는 식물 반응을 강화하거나 억제합니다(예: 가뭄은 일반적으로 기공이 닫히는 반면 기공은 열 스트레스 하에서 잎 표면이 냉각될 수 있도록 열려 있습니다). 그러나, 결합 응력 연구는 여전히 등장하고 있으며, 이러한 조건 하에서 플랜트 반응을 매개하는 복잡한 조절을 더 잘 이해하기 위해서는 추가 연구가 필요하다²⁹. 따라서 이 연구는 형태 생리학적 반응을 평가하고 단일 및 결합 스트레스 처리에서 감자 전체 성능의 기본 메커니즘을 이해하는 데 적합할 수 있는 여러 이미징 센서를 사용하는 표현형 프로토콜을 강조하고 권장하는 것을 목표로 합니다. 가설에 따르면, 여러 이미징 센서를 결합하는 것은 식물 스트레스 반응 중 초기 및 후기 전략을 특성화하는 데 유용한 도구임이 입증되었습니다. 이미지 기반 표현형 프로토콜 최적화는 식물 연구자와 육종가가 비생물적 스트레스 내성에 대한 관심 형질을 찾을 수 있는 대화형 도구가 될 것입니다.

프로토콜

1. 식물 재료 준비 및 성장 조건

1. 체외 감자(Solanum tuberosum L., cv. Lady Rosetta)는 조직 배양액에서 절단하여 250mL 냄비에 이식합니다.
2. 화분에 완전히 포화된 Klasmman Substrate 2를 채우고 1주일 동안 저조도 조건에서 성장 챔버에 보관합니다.
3. 광도계를 사용하여 백색광 160%와 적외선 25%를 조합하여 캐노피 레벨의 조명 조건을 160μmol·^m-2·^s-35 로 조정합니다.
4. 토양에서 시험관 절단을 성장시킨 지 10 일 후에 식물을 3L 화분 (직경 15.5cm, 높이 20.5cm)에 이식하십시오.
5. 3L 냄비에 1850g의 3:1 Klasmann 기판 2: 모래를 채웁니다.
6. 55 % 백색광과 81 % 적외선의 조합으로 320 μmol·^m-2·^s-1 의 조명 조건에서 식물을 성장 챔버에 놓고 긴 하루 체제 (16 시간 광주기)로 설정합니다.
7. 성장 챔버의 온도를 주간/야간의 경우 22°C/19°C로 설정하고 전체 실험에 대해 상대 습도(RH)를 55%로 설정합니다.
8. 화분 무게를 60% 토양 상대 수분 함량(SRWC)으로 유지하여 성장과 수율^30,31을 유지하는 데 적합한 제어 수준으로 유지합니다.
   참고: 이전 시험에 따르면 체적 수분 함량을 60% 이상으로 유지하면 토양 표면에 이끼가 자라는 것이 촉진되고 식물 질병의 위험이 높아집니다. 또한 이끼의 존재는 엽록소 형광 이미징에서 오해의 소지가 있는 양성 신호를 생성할 수 있으며, 이는 필터링하기 어렵습니다. 다음 방정식을 사용하십시오 : SRWC % = (FW-DW) / (TW-DW) × 100, 여기서 FW는 토양 신선 중량, TW는 터거 중량, DW는 건조 중량³²입니다.
   1. 3개의 서로 다른 Klasmman Substrate 2 혼합물 백에서 토양 샘플(100g)을 반복으로 선택하고 토양의 신선 중량을 계량합니다.
   2. 화분에 물이 떨어지지 않고 물을 담을 때까지 토양을 물로 포화시키고 토양 터벅의 무게를 잰다.
   3. 토양 샘플이 완전히 건조될 때까지 샘플을 80°C의 오븐에 3일 동안 넣고 토양 건조 중량³³의 무게를 잰다.
9. 증발을 줄이기 위해 냄비 표면에 파란색 매트를 놓습니다.
   참고: 파란색은 이미지 분할에서 식물 픽셀에서 토양 배경을 빼는 데 필요합니다.
10. 처리당 10개의 생물학적 복제를 선택합니다.
11. 관개 중 화분을 무작위로 지정합니다(총 50개의 화분).
12. 식물을 지지하고 표현형 시스템에 배치할 때 기계적 손상을 방지하기 위해 파란색 홀더를 추가합니다.

2. 스트레스 적용

1. 초기 결절 단계( 시험관 절단을 이식한 후 28일)에서 식물을 5개의 처리 그룹으로 나누고 처리당 10개의 식물을 표현형화합니다(그림 1).
2. 다음과 같이 단일 및 결합 된 스트레스를 해롭지 않은 수준으로 유도하십시오.
   1. 성장 챔버에서 식물을 통제, 가뭄 및 침수 처리를 22 °C / 19 °C 주야간 (단계 1.7)으로 유지하며 SRWC의 비율이 다릅니다.
      전체 실험에 대해 60% SRWC를 사용한 대조군(C).
      20% SRWC가 있는 가뭄(D)은 7일 동안 서서히 진행한 후 1일 동안 회복합니다.
      5일 동안 160% SRWC로 침수(W)한 후 10일 동안 복구합니다.
   2. 침수 처리에서 토양 표면 위의 수위를 유지하려면 빈 냄비에 비닐 봉지를 넣은 다음 흙이 담긴 메인 냄비를 준비된 두 번째 냄비에 넣습니다.
   3. 식물을 30/28 °C 낮/밤 및 열처리를 위해 55 % RH의 성장 캡슐에 넣으십시오. 다음과 같이 단일 및 결합된 열 응력을 부과합니다.
      1. 열(H)의 경우 30일 동안 SRWC의 60%로 28-15°C의 온도를 유지합니다.
      2. 열 + 가뭄 + 침수(HDW) 삼중 스트레스의 경우 처음 7일 동안은 30°C/28°C 낮/밤 온도에서 식물을 열처리하고(60% SRWC 유지) 나머지 7일 동안은 가뭄 + 열 결합 처리(20% SRWC 및 30°C/28°C)하고 마지막으로 식물을 1일 동안 침수 스트레스에 노출시킵니다. 후자의 경우 식물을 성장 챔버에 다시 넣고(조건은 1.7단계 참조) 1일 동안 160% SRWC로 침수를 유도합니다.
         참고: 유도 응력의 선택된 지속 시간은 처리된 식물의 100% 생존율로 해로운 영향 없이 응력 효과를 보여준 파일럿 실험을 기반으로 했습니다. 성장 챔버 환경에서 환경 조건의 변화는 온도의 경우 0.2°C, 습도의 경우 ±± 3% 범위였습니다.

3. 표현형을 위한 식물 준비

1. 성장 챔버에서 오전 6:00에 조명을 켠 후 표현형 프로토콜 시작 전에 최소 2-3시간 동안 식물이 일정한 성장 조명 조건(320μmol·^m-2·^s-1)에 적응하도록 합니다. 이것은 광합성과 기공 조절이 안정된 상태에 있도록 보장한다³⁴.
2. 측정하기 전에 식물을 재배 위치에서 식물을 시스템에 수동으로 로드하는 데 사용되는 표현형 시스템의 성장 완충 영역으로 옮기고 자동 채점이 대기 모드에 있고 온실 내에 위치합니다(보충 그림 1, 보충 그림 2 및 보충 그림 3).
   참고: 식물은 3.5시간 지속되는 표현형 분석 기간 동안 성장 완충 영역에 유지되었습니다. 온실에서 환경 조건의 변화는 온도의 경우 ± 2 °C, 습도의 경우 ± 5 %, 광도의 변동 20 % 범위였습니다. 따라서 측정은 온실 조건이 식물에 미치는 영향을 피하면서 즉시 시작하고 짧아야 한다는 점을 고려하십시오.
3. 표현형 분석 플랫폼에서, 섹션 4에 지정된 측정 프로토콜에 따라 주어진 간격으로 이미징 센서로 지정된 간격으로 컨베이어 벨트를 따라 자동으로 이동하는 디스크에 포트를 배치합니다.
4. 각 공장/트레이에 고유 ID를 레이블을 지정하여 실험 전반에 걸쳐 측정된 데이터가 올바른 공장에 할당되도록 합니다.

4. 표현형 프로토콜

1. 여러 이미징 센서(엽록소 형광, 열 IR, RGB 및 초분광 이미징)를 사용하여 표현형 분석 프로토콜을 최적화하여 식물의 생리학적 및 형태학적 매개변수를 동시에 측정할 수 있습니다(그림 2).
   참고: 식물 반응은 환경 조건과 일주 효과를 반영하기 때문에 화분의 무작위화를 고려하고 하루 중 같은 시간 내에 표현형을 수행하는 것이 중요합니다.
2. 표현형 분석 플랫폼에서 식물이 적응 터널(그림 2A)을 통해 시스템에 들어가도록 하며, 여기서 식물의 높이를 먼저 캡처한 다음 고정된 작동 거리에 따라 각 센서의 높이를 조정합니다.
3. 소프트웨어를 사용하여 측정 프로토콜에서 정당화된 대로 두 라운드로 측정을 수행합니다.
   1. 첫 번째 라운드에서는 엽록소 형광 및 열화상 이미징을 사용하여 "빠른 반응"으로 정량화된 생리적 반응 측정으로 구성됩니다.
   2. 먼저 열 스트레스 처리에서 생리적 매개변수를 측정한 다음 나머지 처리를 측정합니다.
   3. 두 번째 라운드에서는 구조적 RGB 및 초분광 이미징을 포함하여 더 느린 반응을 평가하기 위한 다른 측정을 진행한 다음 중량 평가 및 물을 줍니다.
4. 계량 및 급수 단계에서는 각 식물에 대한 기준 중량을 정의하여 주어진 처리에 대한 자동 급수 및 계량을 가능하게 합니다.
   1. 총 기준 중량에 디스크, 컨베이어 벨트에 위치한 인서트, 지지대 파란색 홀더, 파란색 매트, 화분, 토양 및 정의된 프로토콜의 식물 바이오매스의 무게가 포함되는지 확인합니다.
   2. 계량 및 급수 단계에서 증발산을 정확하게 측정하려면 빈 냄비를 참조로 준비하십시오. 또한 식물 바이오매스 무게를 보정하기 위해 추가 화분을 준비하십시오.
5. 50개의 식물을 측정하기 위해 전체 표현형 프로토콜 기간은 215분(1^차 라운드 85분, 2^{차 라운드} 130분)이 소요됩니다.
6. 통제 조건 하에서 모든 식물을 매일 표현형(처리 1일 전)한 다음 스트레스 처리를 유도하여 동적 반응을 모니터링하고 유도된 스트레스의 초기 및 후기 단계를 평가합니다.

5. 각 이미징 센서의 설정 조정

1. Kinetic chlorophyll fluorescence imaging (키네틱 엽록소 형광 이미징)
   참고: 운동 엽록소 형광은 비생물적 스트레스를 포함한 다양한 환경 조건에 대한 식물의 광합성 능력을 조사하고 광화학 및 열 방출(비광화학 공정)의 양자 효율성에 대한 귀중한 정보를 제공하는 데 사용됩니다.
   1. 짧은 광 프로토콜을 사용하여 빛에 적응한 식물에 대한 엽록소 형광 측정을 수행하여 다양한 처리 중인 식물의 반응을 구별합니다.
   2. ⁵⁰⁰ μmol·m-6500 μmol·^m-2·^s-1에서 시원하 백색 LED (6500 K)가 장착된 적응 터널의 빛 아래에서 5분 동안 식물을 순응합니다.
      참고: 엽록소 형광 이미징은 식물의 광합성 능력 변화를 모니터링하는 데 사용되는 광 적응 후 첫 번째 측정입니다.
   3. 식물 크기와 필요한 광도에 따라 사전 정의된 프로토콜을 선택하고 최적화합니다.
   4. 카메라 및 조명 강도 설정을 포함한 측정 설정을 최적화하여 최적의 신호 대 노이즈 비율로 강력한 신호를 획득할 수 있습니다.
      1. 셔터(노출 시간, 측정 플래시 지속 시간) 및 감도(카메라의 전기 이득)와 같은 카메라 설정을 조정합니다. 셔터는 2ms, 감도는 12%로 사용합니다.
         참고: 이 값은 잎의 크기와 모양, 그리고 캐노피 상단과 이미징 센서 사이의 정의된 거리에 따라 조정됩니다.
      2. 광선 강도를 500μmol·^m-2·^s-1 로 조정하고 채도 펄스를 3200μmol·^m-2·^s-1로 설정하며, 이는 광선보다 6-7배 이상 높습니다.
   5. 광 정상 상태(Lss)(아래 설명 참조)에서 매개변수를 측정하려면 광 적응 터널에서 측정하기 5분 전에 광 적응 식물을 사용합니다.
   6. 광 적응 식물의 정상 상태 광시스템 II(PSII) 양자 수율을 추정하려면 짧은 광 프로토콜(그림 3)을 선택하고 프로토콜을 다음과 같이 설정하십시오.
      참고: 프로토콜 기간은 공장당 10초였습니다.
      1. 500μmol·^m-2·^s-1 에서 3초 동안 냉백색 광선을 켜서 빛(F_{, t}_Lss 일명 정상 상태 형광을 측정하여 측정을 시작합니다. F_t')
      2. 3200 μmol·^m-2·^s-1 에서 800 ms 동안 포화 펄스를 적용하여 빛(F_m_Lss 일명 정상 상태 최대 형광을 측정합니다. F_m')
      3. 광선을 끈 다음 원적색광(735nm)을 켜서 PSII가 800ms 동안 어둠 속에서 휴식을 취하고 빛의 정상 상태 최소 형광(F_o_Lss 일명 측정할 수 있도록 합니다. F_o')입니다.
   7. 상대 매개변수를 계산하려면 배경을 빼고 관련 매개변수를 추출하는 데이터 분석기 소프트웨어를 사용합니다.
      참고: 사용된 프로토콜에서 추출된 매개변수는 다음과 같습니다: F_v/F_m_Lss aka로 결정된 광 정상 상태에서 광 적응 샘플의 PSII 광화학의 최대 효율성. F_v'/F_m', 광계 II 양자 수율 또는 광 정상 상태에서 광계 II의 작동 효율은 QY_Lss aka로 정의됩니다. φ_PSII =_{F q}'/F_m'이고 PSII(산화된 QA)에서 개방 반응 중심의 비율은 qL_Lss = (F_q'/F_v') x (F₀'/F_t')로 결정됩니다.
2. 열적외선(IR) 이미징
   참고: 열IR 이미징은 실제 캐노피 온도의 비침습적 측정에 사용되어 다양한 기공 규정을 결정합니다. 열화상 장치에서는 로봇 팔에 열화상 카메라를 측면으로 장착하여 측면에서 캐노피 온도를 측정합니다.
   1. 이미지 처리 중 이미징된 물체의 온도에 대한 배경 온도의 대비를 높이려면 열화상 카메라의 반대쪽에 있는 자동 제어 가열 벽을 사용하여 대비를 높입니다. 이미징 장치의 공기 온도보다 8°C 높은 벽 온도를 조절합니다.
      참고: 열화상은 라인 스캔 모드³⁵를 사용하여 어두운 곳에서 획득했습니다.
   2. 이미지 획득 후 RGB 측면 뷰 데이터를 기반으로 식물 마스크를 생성하고 이를 사용하여 이미지 분석에서 열 데이터와 공동 정합합니다. 이를 통해 스캔된 물체를 정확하게 식별할 수 있으며 식물 홀더와 같은 배경 간섭을 제거할 수 있습니다.
   3. 전체 실험에서 변동하는 환경 조건의 영향을 방지하려면 매개변수 온도 차이(델타 T 또는 ΔT)를 계산합니다.
      참고: Delta T(ΔT)는 잎 표면의 측정된 온도(식물의 전체 감지된 표면에서 모든 픽셀의 평균)와 이미징 상자 내부의 주변 공기 온도 간의 차이로 정의됩니다.
3. RGB 이미징
   참고: RGB 이미징은 400-700nm의 가시 범위에서 빛을 감지하는 VIS(Visual Inertial System) 카메라를 기반으로 하며, 식물 형태, 구조 및 색상 인덱스 특징의 추출에 대한 심층 분석에 사용됩니다.
   1. 이미징 장치에는 트레이의 정확한 위치를 지정하기 위한 회전 테이블이 포함되어 있으며 동시에 측면 보기를 위한 다각도 이미징이 가능합니다.
   2. 측면 이미징을 기반으로 RGB 이미징을 설정하여 라인 스캐닝 모드(RGB1)에서 촬영하고 스냅샷 모드(RGB2)에서 탑뷰 이미징을 촬영하는 세 가지 각도(0°, 120° 및 240°)에서 식물을 캡처합니다.
   3. 두 카메라 모두 LED 기반 광원을 갖추고 있어 이미징된 식물의 균일한 조명을 보장하여 형태학적 특징과 색상 특징을 정확하게 파악할 수 있습니다.
   4. 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 계산된 매개 변수를 추출합니다.
   5. 측면 및 상단 보기를 기반으로 한 추가 매개변수의 경우 식물 부피(디지털 바이오매스)³⁶를 계산합니다.
      
   6. 상대 성장률(RGR)³⁷ 계산:
      
      여기서 T_n 및 T_n+1 은 시간 간격(일)을 나타냅니다.
4. 초분광 이미징
   참고: 초분광 이미징은 식물의 스펙트럼 반사율을 시각화하는 데 사용됩니다. 잎 반사율의 변화는 주어진 식물의 다양한 생리적 상태를 나타내는 지표입니다.
   1. 초분광 이미징 센서를 사용하여 380-900nm 범위의 가시광선-근적외선(VNIR) 초분광 카메라와 900-1700nm 범위의 단파장 적외선 카메라(SWIR)를 사용하여 광 스펙트럼의 가시 영역에서 캐노피 반사율을 정량화할 수 있습니다.
   2. 카메라는 할로겐 튜브 광원(600W)이 구현된 로봇 팔에 장착되어 XZ 영역을 가로질러 이동하는 이미지 획득 중에 균일하고 스펙트럼적으로 적절한 샘플 조명을 제공합니다.
   3. 두 카메라 모두 라인 스캔 모드에서 작동하며 빛이 차단된 이미징 박스에 배치됩니다.
   4. 각 측정 라운드 전에 스펙트럼 반사 테프론 표준을 사용하여 암전류 보정과 방사 보정의 두 가지 보정 측정(자동)을 수행합니다.
   5. 어두운 전류 노이즈를 제거하기 위해 원시 및 흰색 보정 이미지에서 어두운 보정 이미지를 뺍니다. 그런 다음, 뺀 후의 원시 이미지를 흰색 보정 이미지로 나누어 최종 초분광을 생성합니다.

6. 데이터 내보내기 및 이미지 분석

1. 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 이미지 처리 파이프라인의 자동 추출, 배경 빼기 및 식물 마스크 분할을 수행할 수 있습니다(그림 2B).
2. 이 소프트웨어는 마스크 적용, 식물을 배경에서 격리하는 배경 빼기, 파라미터 계산이 RGB 이미징(³⁸ ) 및 열화상^이미지(20)에 대해 설명된 대로 처리되는 완전 자동화된 분석을 수행합니다.
3. RGB 이미지로 생성된 Plant Mask 및 Tray Mask에 의해 정의된 대로 식물별 픽셀에서 측정 및 계산된 파라미터를 추출합니다.
4. 이후 발달 단계에서 식생 녹색의 변화 또는 스트레스 처리의 영향으로 인해 발생할 수 있는 이미지가 완전히 선택되지 않은 경우 소프트웨어에서 로컬 데이터 분석 부분을 열고 각 센서에 따라 데이터 분석기 소프트웨어에서 식물 마스크 설정을 다시 조정합니다.
5. 엽록소 형광 이미지 처리에서 엽록소 형광 식물 마스크 설정 분석 매개변수를 조정합니다(보충 그림 4).
   1. 임계값을 True로 설정하면 플랜트 세분화가 자동으로 수행됩니다.
   2. Mask Frame Index를 False로 설정하는데, 이는 식물 마스크 감지를 위해 Time-Visual 프레임이 엽록소 형광 프로토콜에 정의된 대로 사용됨을 의미합니다.
6. 열화상 처리에서 Plant Mask 분석을 위한 매개변수를 설정합니다(보충 그림 5).
   1. 오브젝트 마스크 생성에 대한 자동 임계값을 False로 설정합니다.
   2. RGB 측면 이미지의 마스크를 True로 설정하여 분석에 사용합니다.
7. RGB 이미지 처리에서 종과 발달 단계에 따라 식물 마스크 설정 분석 매개변수(보충 그림 6 및 보충 그림 7)를 조정합니다.
   1. 오브젝트 마스크 생성에 대한 정의인 수식 4*G-3*B-R을 선택하고 사용되는 색상 구성 요소(빨강, 녹색, 파랑 구성 요소)를 정의합니다.
      참고: 이 표준 공식 및 기타 설정은 사용된 카메라 유형(상단 또는 크기 view), 적용된 처리 및 다양한 품종에 따라 변경될 수 있습니다.
   2. 향상된 녹색 채널이 있는 회색조 이미지를 식물이 덮는 표면을 결정하는 이진 이미지로 변환하는 데 사용되는 임계값 을 조정합니다.
   3. 노이즈와 유효하지 않은 픽셀을 줄이고 누락된 픽셀을 채우는 데 사용되는 Median Filter Size 를 조정합니다.
   4. 분석에 포함할 객체의 최소 크기 (픽셀)를 조정합니다.
   5. 마스크 개체 에 있는 구멍의 최소 크기를 픽셀(일반적으로 수십 픽셀) 단위로 조정합니다. 이 값보다 작은 구멍은 닫히고 개체 픽셀로 가져옵니다.
   6. 각 픽셀의 RGB 값을 정규화하기 위해 Use Reflection Reduction 을 True 로 설정합니다.
   7. 식물 마스크에서 노출 위/부족 노출 픽셀을 자르려면 Skip Bad Exposed Points 를 True 로 설정합니다(예: 표면 반사 누락 또는 노이즈가 신호보다 큰 어두운 픽셀).
8. 색상 : 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 RGB에서 분석 한 분할 설정을 사용하여 응력 반응 및 식물 노화와 관련된 색상 변화에 대한 정보를 제공합니다.
   알림: 녹색도는 식물 발달의 모든 단계를 나타내는 사전 정의된 색상 범위를 사용하여 추정됩니다. 식물 표면에 해당하는 모든 픽셀의 색상 채널의 강도는 색상 분할을 위한 소스 색상 맵으로 사용하기 위해 그룹화되고 클러스터링되었습니다.
   1. 처리된 RGB 이미지(배경 제거), 컬러 맵 - 특정 분석을 위한 색조 목록을 소프트웨어의 입력으로 제공합니다.
   2. 편향되지 않은 결과를 얻으려면 "훈련" 데이터 세트를 사용하여 색조 선택을 수행하고 다른 발달 단계와 치료를 선택하십시오.
      참고: 분석은 이 교육 데이터 세트에서 각 이미지의 각 픽셀에 대한 R, G 및 B 값을 저장합니다.
   3. 색상 정의 출력을 위해 소프트웨어를 사용하여 각 채널에 대해 0-255 범위의 색조 수(6가지 색조 선택)를 정의합니다.
   4. 데이터 분석기 소프트웨어(색상)에서 생성된 색조 목록을 제공합니다.
9. 초분광 이미지 처리에서는 초분광 분석기 소프트웨어에 구현된 픽셀 단위 분석을 사용하여 수집된 초분광 데이터를 처리하며, 이는 방사 측정 및 다크 노이즈 보정, 배경 빼기, 식물 마스크 분할 기능을 제공합니다. 추가 분석을 위해 평균 스펙트럼 및 식생 지수를 사용합니다.
10. VNIR 초분광 카메라로 촬영한 VNIR 영상에서 초분광 영상으로 데이터를 추출하기 위한 마스크를 만듭니다. SWIR 초분광 스캔의 경우 SWIR 분석을 기반으로 식물 마스크를 생성합니다.
    1. VNIR Plant Mask에서 공식 1.2*(2.5*(R740-R672)-1.3*(R740-R556))을 사용하여 R이 특정 파장의 반사율 값을 나타내는 이미지를 시각화합니다(보충 그림 8).
    2. SWIR Plant Mask에서 이미지 시각화를 위해 이미지 처리에 (R960-R1450)-(R960-R1200) 공식을 사용합니다(보충 그림 9).

7. 무게를 달고 물을 주기

1. 계량 및 급수 절차 동안 물을 주기 전(전)의 무게를 보관하십시오. 그런 다음 물을 주고 물을 준 후에도 무게를 유지하십시오.
2. 참조 모드에서 트레이에 물 주기 - 각 트레이에는 데이터베이스에 저장된 참조 값이 있었으며 항상 물을 뿌렸습니다. 처리를 기반으로 참조를 결정합니다.

8. 데이터 분석

1. ANOVA 및 Shapiro 검정을 사용하여 데이터를 분석합니다.
2. (dplyr), (tidyverse), (rstatix) 및 (ggpubr) 패키지를 사용하여 R 스튜디오(버전 4.2.3)에서 Pairwise Wilcox 테스트로 서로 다른 처리 간의 쌍별 비교를 수행합니다.
   참고: 이미지 분석은 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하여 자동으로 수행되었습니다. 이미지 획득에 대한 추가 분석을 위해 센서별 데이터 분석기 소프트웨어를 사용하십시오.

토론

개선된 고급 고해상도 이미징 도구 및 컴퓨터 비전 기술은 재현 가능한 방식으로 대규모 식물 이미지로부터 정량적 데이터를 얻기 위해 식물 표현형의 급속한 개발을 가능하게 했습니다³⁹. 이 연구는 단일 및 결합 비생물적 스트레스 하에서 식물의 동적 반응을 모니터링하기 위해 현재 사용 가능한 이미징 센서 어레이를 사용하여 고처리량 이미지 기반 방법론을 조정하고 최적화하는 것을 목표로 했습니다. 적용된 접근법의 몇 가지 중요한 단계에서는 응력 적용 및 측정에 적합한 이미징 프로토콜 선택을 포함하여 조정이 필요합니다. 이미지 획득을 위해 여러 센서를 사용하면 주요 표현형 형질(예: 식물 성장, 광합성 효율성, 기공 조절, 잎 반사율 등)을 정량화할 수 있습니다. 또한 감자 식물이 다양한 비생물적 스트레스에 어떻게 반응하는지에 대한 이해를 향상시킵니다. 이는 기후 내성 유전자형⁴⁰을 개발하기 위한 식물 육종 프로젝트를 가속화하기 위한 핵심 전제 조건입니다. 유도 스트레스에 대한 형태 학적 반응은 발달 단계에 따라 다릅니다. 예를 들어, 스톨론 또는 괴경 시작 단계에서 응력을 유발하는 것은 잎 및 식물의 발달을 억제하고 스톨론의 수를 제한하여 최종 수율을 감소시킨다(⁴¹). 그러나 불리한 조건 하에서 식물은 스트레스 유발 세포 손상을 예방하고 복구하기 위한 적응 반응으로 스트레스 반응을 활용한다⁴². 식물은 심각도^{수준 43}에 따라 스트레스 조건을 피하고 견딜 수 있는 적응 메커니즘을 가지고 있습니다.

식물의 메커니즘을 이해하려면 이미징 센서를 사용하여 스트레스의 적절한 지속 시간과 강도를 유도하고 스트레스에 대한 식물의 반응을 결정하는 것이 중요한 단계 중 하나로 간주됩니다. 여러 응력이 일치하면 한 응력의 강도가 응력의 조합, 강도 및 지속 시간에 따라 다른 응력의 효과보다 우선할 수 있습니다. 따라서 스트레스 효과가 합산되거나 반대되는 반응이 (부분적으로) 서로를 상쇄하여 궁극적으로 식물에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구에서 선택한 프로토콜은 충분한 스트레스 수준이 적용되었는지 확인하기 위해 이전 경험을 기반으로 했습니다. 예를 들어, 가뭄 스트레스의 적용은 이전 실험에서와 같이 중간 수준으로 조정되었으며, 반응은 엽록소 형광 이미징을 기반으로 한 스트레스 초기 단계의 대조 처리와 다르지 않았습니다. 이것은 틸라코이드 막의 전자에 대한 대체 싱크 역할을하는 광 호흡의 발생과 광시스템 II^44,45에 대한 보호 메커니즘 때문입니다. 결합된 스트레스 반응 하에서, 식물이 경미한 1차 스트레스 요인에 노출되면 다음 스트레스 요인에 대한 내성이 향상될 수 있으며, 이는 유익하거나 해로운 영향을 미칠 수 있다⁴⁶. 이 연구에서는 개별 가뭄 스트레스에 비해 결합된 스트레스 하에서 더 강력한 반응이 관찰되었습니다. 다른 생리적 반응을 조사한 결과, 가뭄 시 기공이 가까워짐에 따라 과도한 수분 손실을 피하기 위해 ΔT(deltaT)가 증가하는 것으로 나타났습니다. 대조적으로, 열과 가뭄 스트레스가 결합된 밀에서 20의 결과에 따라 잎 냉각을 향상시키기 위해 기공 개방을 반영하는 대조군에 비해 ΔT가 더 낮은 열 스트레스 하에서 역반응이 관찰되었습니다²⁰. 침수 중에는 기공 폐쇄로 인한 ΔT의 증가는 토양의 산소 결핍과 뿌리 수분 항상성의 붕괴로 인해 발생하며, 이로 인해 물 스트레스 반응의 핵심 호르몬인 ABA가 증가하여 증산 흐름이 감소합니다⁴⁷.

식물 스트레스 연구에서 스트레스 및 후속 회복 처리의 지속 시간은 스트레스 강도에 정비례합니다. 예를 들어, 토양 수분을 20%의 현장 용량(FC)으로 유지하는 것과 같은 중간 정도의 가뭄 스트레스는 일반적으로 재관개 하루 후에 회복되는 가역적 표현형 변화를 유도합니다. 대조적으로, 침수와 같은 심각한 스트레스 조건은 광범위한 표현형 손상을 초래하여 더 긴 회복 기간을 필요로 합니다. 처리 기간을 표준화하는 것이 이상적이지만, 응력 강도의 내재적 변동성을 실험 설계에서 고려해야 합니다.

두 번째 중요한 단계는 적절한 프로토콜을 선택하고 각 센서에 대한 설정을 최적화하는 것입니다. 엽록소 형광은 응력 하에서 광합성 장치의 성능을 결정하는 강력한 도구이다⁴⁸. 다양한 엽록소 형광 측정 프로토콜은 연구 질문 및 실험 설계에 따라 밝은 또는 어두운 적응 식물로 선택할 수 있습니다⁴⁹. 이 연구에서, 선택된 프로토콜(짧은 광 응답)은 다양한 조건(⁵⁰)에서 광합성 성능을 나타내는 F_v'/F_m', φ_PSII 및 qL을 포함한 다양한 형질의 측정을 가능하게 한다. 이전 연구에 따르면 고처리량 표현형에 사용된 프로토콜은 스트레스 처리의 다양한 응용 분야에서 식물의 광합성 효율성을 조사하고 건강한 식물과 스트레스 받은 식물을 구별하는 데 효과적입니다^14,20. 실험 설계에 따라 식물 개체군이 많은 고처리량 시스템에서 측정할 때 선택한 프로토콜의 지속 시간을 고려하는 것이 매우 중요합니다. 따라서, 단시간 프로토콜을 사용하여 광 적응 식물에 대한 엽록소 형광 측정은 다양한 처리에서 반응을 구별하기 위해 선택되었습니다. 유전자형-환경 상호작용은 많은 표현형 형질에 영향을 미칠 수 있으며, 이는 측정 중에 매우 중요하다¹². 광합성 제한에 대한 일일적 영향을 최소화하기 위해 측정 시간이 짧은 시간에 완료되어야 한다는 점을 고려하는 것이 필수적이다⁵¹.

열적외선 이미징을 사용하여 캐노피 온도를 결정하고 다양한 치료법에서 기공 조절을 이해하였다⁵². 히팅 월이 카메라의 반대쪽에 위치한 곳에 기술 최적화가 사용되었고 월의 온도가 동적으로 제어되고 프로그래밍 가능했다는 점을 언급할 가치가 있습니다. 따라서, 환경 센서가 통합된 배경 가열 벽을 조정하는 것은 이미징된 물체의 온도에 대한 배경 온도의 대비를 증가시킴으로써 배경에서 식물을 적절하게 선택하기 위해 필요합니다.

이미지 분석이 자동화되더라도, 식물(⁵³)을 정밀하게 선택하기 위해 RGB 이미징에서 적절한 바이너리 마스크를 얻기 위해서는 RGB 임계값 인덱스를 조정하는 것이 여전히 요구된다. 또한 디지털 바이오매스 및 성장률을 포함한 정량적 매개변수를 적절하게 추정하기 위해 여러 각도를 선택하는 것이 중요합니다. 이 연구에서는 식물 부피와 상대 성장률을 정확하게 계산하기 위해 RGB 측면도의 세 가지 각도(0°, 120° 및 240°)를 선택하고 평균을 냈습니다.

스펙트럼 범위에 따라, 초분광 이미징(hyperspectral imaging^{) 54}을 사용하여 많은 생리학적 특성을 조사할 수 있다. 반사율 지수 중 어느 것이 필요한 정보를 제공하고 다양한 조건에서 식물의 반응을 보여주는지 결정해야 합니다¹⁴. 초분광 지수와 다른 생리적 형질 사이의 상관관계를 결정하기 위해 내성 품종 및 식물 표현형을 스크리닝하는 데 매우 요구된다⁵⁵. 이 연구에서 침수 처리된 식물은 VNIR 이미징에서 엽록소 함량과 광합성 효율에서 뚜렷한 반응을 보였습니다. 또한, 열처리 및 침수 하에서 SWIR 이미징으로 계산된 수분 지수에서 다른 기공 규정과 잎의 수분 함량이 다르기 때문에 다른 반응이 관찰되었습니다.

따라서 이러한 결과는 설정을 최적화한 후 이러한 접근 방식의 유용성과 기후 내성과 관련된 스트레스 특성을 찾기 위해 여러 센서를 사용할 수 있는 잠재력을 강조합니다. 여러 이미징 센서를 사용하여 반응의 역학을 평가하는 것은 육종 프로그램을 개선하는 강력한 도구 중 하나로 사용될 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.1” CMOS Sensor with RGB camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	The sensor delivers a resolution of 4112 × 4168 pixels for side view and 2560 × 1920 pixels for top view. The sensor is extremely sensitive and is a real megapixel CCD replacement and produces sharp, low-noise images
FluorCam	PSI, Drásov, Czech Republic	FC1300/8080-15	Pulse amplitude modulated (PAM) chlorophyll fluorometer
Fluorcam 10 software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.18106	For Chlorophyll fluorescence images visualization and analysis
GigE PSI RGB – 12.36 Megapixels Camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	For the side view projections, line scan mode was used with a resolution of 4112 px/line, 200 lines per second. The imaged area from the side view was 1205 × 1005 mm (height × width), while the imaged area from the top view position was 800 × 800 mm.
Hyperspectral Analyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.0.14	For hyperspectral images visualization and analysis
Hyperspectral camera HC-900 Series	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Visible-near-infrared (VNIR) camera 380-900 nm with a spectral resolution of 0.8 nm FWHM
Hyperspectral camera SWIR1700	PSI, Drásov, Czech Republic	https://hyperspec.org/products/	Short-wavelength infrared camera (SWIR) camera 900 - 1700 nm with a spectral resolution of 2 nm FWHM
InfraTec thermal camera (VarioCam HEAD 820(800))	Flir,  United States	https://www.infratec.eu/thermography/infrared-camera/variocam-hd-head-800/	Resolution of 1024 × 768 pixels, thermal sensitivity of < 20 mK and thermal emissivity value set default to 0.95.  with a scanning speed of 30 Hz and each line consisting of 768 pixels. The imaged area was 1205 × 1005 mm (height × width).
LED panel	PSI, Drásov, Czech Republic	https://led-growing-lights.com/products/	Equipped with 4 × 240 red-orange (618 nm), 120 cool-white LEDs (6500 K) and 240 far-red LEDs (735 nm) distributed equally over an imaging area of 80 × 80 cm
Light, temperature and relative humidity sensors	PSI, Drásov, Czech Republic	https://psi.cz/	Sensors used to monitor controlled conditions in greenhouse
MEGASTOP Blue mats	Friedola	75831	To cover soil surface
Morphoanalyzer software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 1.0.9.8	For RGB images visualization and analysis and color segmentation analysis
PlantScreen Data Analyzer software (Version 3.3.17.0)	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	To visualize and analyze the data from all imaging sensors,  watering-weighing unit and environmental conditions in greenhouse
PlantScreen Modular system	PSI, Drásov, Czech Republic	https://plantphenotyping.com/products/plantscreen-modular-system/	Type of phenotyping platform
Plantscreen Scheduler software	PSI, Drásov, Czech Republic	Version 2.6.8368.25987	To plan the experiment and set the measuring protocol
SpectraPen MINI	PSI, Drásov, Czech Republic	https://handheld.psi.cz/products/spectrapen-mini/#details	Light meter to adjust light level on a canopy level
TOMI-2 high-resolution camera	PSI, Drásov, Czech Republic	https://fluorcams.psi.cz/products/handy-fluorcam/	Resolution of 1360 × 1024 pixels, frame rate 20 fps and 16-bit depth) with a 7-position filter wheel is mounted on a robotic arm positioned in the middle of the multi-color LED light panel with dimensions of 1326 x 1586 mm.
Walk-in FytoScope growth chamber	PSI, Drásov, Czech Republic	https://growth-chambers.com/products/walk-in-fytoscope-fs-wi/	Type of chambers used to grow the plant