small RNA 정량을 위한 AQRNA-seq

요약

절대 정량 RNA 염기서열분석(AQRNA-seq)은 생물학적 혼합물에서 모든 소형 RNA의 환경을 정량화하기 위해 개발된 기술입니다. 여기에서는 AQRNA-seq의 라이브러리 준비 및 데이터 처리 단계를 모두 시연하여 기아 유발 휴면 기간 동안 Mycobacterium bovis BCG의 전달 RNA(tRNA) 풀의 변화를 정량화합니다.

초록

AQRNA-seq는 생물학적 샘플에서 염기서열분석 판독 횟수와 small RNA copy numbers 사이에 직접적인 선형 관계를 제공하여 small RNA pool의 정확한 정량화를 가능하게 합니다. 여기에 설명된 AQRNA-seq 라이브러리 준비 절차에는 맞춤형으로 설계된 염기서열분석 링커의 사용과 역전사 진행성을 차단하는 메틸화 RNA 변형을 줄이는 단계가 포함되며, 이로 인해 전장 cDNA의 수율이 증가합니다. 또한 수반되는 생물정보학 파이프라인의 자세한 구현이 제시됩니다. 이 AQRNA-seq 시연은 20일간의 영양 결핍 과정과 6일의 소생술에 걸쳐 선택된 5일에 걸쳐 수확된 Mycobacterium bovis BCG의 45개 tRNA에 대한 정량 분석을 통해 수행되었습니다. AQRNA-seq의 효율성과 엄격성을 개선하기 위한 지속적인 노력도 여기에서 논의될 것입니다. 여기에는 PCR 증폭 후 primer dimer 문제를 완화하기 위해 gel purification을 없애고 보다 정확한 read mapping을 가능하게 하기 위해 full-length read의 비율을 늘리는 방법을 탐색하는 것이 포함됩니다. AQRNA-seq에 대한 향후 개선 사항은 다양한 유기체의 세포 및 조직 샘플에서 모든 small RNA 종을 정량화하기 위한 이 기술의 자동화 및 고처리량 구현을 촉진하는 데 중점을 둘 것입니다.

서문

대규모 병렬 염기서열분석(MMS)이라고도 하는 차세대 염기서열분석(NGS)은 DNA 단편화, 어댑터 올리고뉴클레오티드의 ligation, 중합효소연쇄반응(PCR) 기반 증폭, DNA 염기서열분석, 단편 염기서열을 게놈으로 재조립하는 DNA 염기서열 분석 기술입니다. RNA 염기서열(RNA-seq)에 대한 NGS의 적응은 RNA 전사체와 그 변이체를 식별하고 정량화하는 강력한 접근법입니다¹. RNA 라이브러리 준비 워크플로우 및 생물정보학 분석 파이프라인의 혁신적인 개발과 실험실 기기의 발전은 RNA-seq 애플리케이션의 레퍼토리를 확장하여 엑솜 시퀀싱을 넘어 non-coding RNA 프로파일링², 단일 세포 분석³, 공간 전사체학 ^4,5, 대체 스플라이싱 분석⁶과 같은 고급 기능 오믹스로 발전했습니다, 다른 사람들 사이에서. 이러한 첨단 RNA-seq 방법은 정상 및 병든 세포 및 조직에서 전사체의 정량 분석을 통해 복잡한 RNA 기능을 밝힙니다.

RNA-seq의 이러한 발전에도 불구하고 몇 가지 주요 기술적 특징이 분석법의 정량적 능력을 제한합니다. 대부분의 RNA-seq 분석법은 실험 변수(즉, 생물학적 시료 및/또는 생리학적 상태) 간의 RNA 수준 변화를 정밀하고 정확하게 정량화할 수 있지만, 시료 내 RNA 분자 수준의 정량적 비교는 제공할 수 없습니다. 예를 들어, 대부분의 RNA-seq 분석법은 발현된 tRNA의 세포 풀에서 개별 tRNA 동수용체 분자의 상대적 복제 수를 정확하게 정량화할 수 없습니다. 동반 간행물⁷에서 강조된 바와 같이, RNA-seq에 대한 이러한 제한은 RNA 구조의 여러 특징과 라이브러리 준비의 생화학에서 발생합니다. 예를 들어, 3' 및 5'-말단 염기서열분석 링커를 RNA 분자에 부착하는 데 사용되는 연결 효소의 활성은 RNA의 말단 뉴클레오티드와 염기서열분석 링커의 정체성에 의해 크게 영향을 받습니다. 이로 인해 링커 결찰(linker ligation)의 효율성에 큰 변화가 발생하고 염기서열분석 판독(sequencing read) ^8,9,10에서 아티팩트(artifactual)가 크게 증가합니다.

두 번째 한계는 RNA 분자의 고유한 구조적 특성에서 발생합니다. 특히, epitranscriptome의 수십 개의 전사 후 RNA 변형에서 RNA 2차 구조 형성 및 동적 변화는 역전사 중에 중합효소 감소 또는 돌연변이를 유발할 수 있습니다. 이러한 오류는 불완전하거나 잘린 cDNA 합성 또는 변형된 RNA 염기서열을 초래합니다. 이 두 가지 현상 모두 2차 구조 또는 일부 변형을 매핑하는 데 활용될 수 있지만, 후속 라이브러리 준비 단계에서 절단된 cDNA를 캡처하지 못하거나 데이터 처리에서 참조 데이터 세트(^11,12)와 일치하지 않는 돌연변이 서열이 발생하는 경우 RNA-seq의 정량적 정확도가 저하됩니다. 더욱이, RNA 전사체의 엄청난 화학적, 길이 및 구조적 다양성과 긴 RNA를 균일하게 단편화할 수 있는 도구의 부족으로 인해 대부분의 RNA-seq 방법의 적용 가능성이 모든 RNA 종에 감소합니다¹³.

AQRNA-seq(절대 정량 RNA 염기서열분석) 분석법은 정량 정확도를 제한하는 이러한 기술적, 생물학적 제약 중 몇 가지를 제거하기 위해 개발되었다⁷. RNA 염기서열분석 라이브러리 준비 중 capture, ligation 및 증폭에서 염기서열 의존적 바이어스를 최소화함으로써 AQRNA-seq는 다른 방법에 비해 우수한 선형성을 달성하여 963개의 miRNA로 구성된 참조 라이브러리의 75%를 2배 정확도 내에서 정확하게 정량화합니다. 염기서열분석, 판독 횟수와 RNA 풍부도의 이러한 선형 상관관계는 RNA 올리고뉴클레오티드 표준물질의 가변 길이 풀 분석과 노던 블로팅(northern blotting)과 같은 직교 방법에서도 관찰됩니다. 염기서열분석 판독 횟수와 RNA 풍부도 간의 선형성을 통해 AQRNA-seq는 시료 내 모든 RNA 종에 대한 정확하고 절대적인 정량화를 달성할 수 있습니다.

다음은 AQRNA-seq 라이브러리 준비 워크플로우를 위한 프로토콜과 함께 제공되는 다운스트림 데이터 분석 파이프라인에 대한 설명입니다. 이 방법은 결핵의 Mycobacterium bovis bacilli de Calmette et Guérin(BCG) 모델에서 기아 유발 휴면 및 후속 소생술 중 tRNA 풍부의 역학을 설명하기 위해 적용되었습니다. 염기서열분석 데이터의 탐색적 시각화를 위한 결과가 제시되었으며, 후속 클러스터링 및 차등 발현 분석을 통해 다양한 표현형과 관련된 tRNA 풍부도에서 식별 가능한 패턴을 밝혀냈습니다.

프로토콜

참고: 그림 1 은 AQRNA-seq 라이브러리 준비와 관련된 절차를 그래픽으로 보여줍니다. 절차에 사용된 시약, 화학 물질 및 컬럼/키트에 대한 자세한 정보는 재료 표에서 확인할 수 있습니다. (i) 3% 아가로스 겔 전기영동, (ii) 생체 분자의 시료 품질 관리를 위한 자동 전기영동 도구( 재료 표 참조), (iii) UV-Visible 분광광도법 및/또는 형광 정량화를 사용하여 입력 RNA 시료의 순도, 무결성 및 수량을 종합적으로 평가하는 것이 좋습니다. 달리 명시되지 않는 한 모든 반응과 마스터 믹스를 얼음 위에 보관해야 합니다. 시약(예: 효소)을 -20°C 보관 및 저온 보관 상자로 운송하여 유통 기한을 보존하고 라이브러리 중간체의 여러 동결-해동 주기를 방지합니다.

1. RNA의 탈인산화(Dephosphorylation)

참고: 5'-인산(P; donor)을 제거하면 RNA의 3'-hydroxyl(OH; 수용체)에 대한 자가 결찰(self-ligation)을 방지할 수 있습니다. 링커는 3' 말단이 디데옥시시티딘(Linker 1) 또는 스페이서(Linker 2)를 통합하도록 수정되므로 자가 결합되지 않습니다. 링커는 5'-P를 RNA 또는 cDNA의 3'-OH에 결합해야만 접합할 수 있습니다.

1. 최대 2 μL의 RNA 샘플, 0.5 μL의 40 U/μL RNase inhibitor, 1 μL의 0.5 μL of 0.5 μM 내부 표준물질(표 1), 0.5 μL의 10x T4 RNA ligase 반응 완충액, 1 U/μL 1 μL의 1 U/μL Shrimp alkaline phosphatase를 첨가하여 멸균 PCR 튜브(예: 200 μL 또는 500 μL 튜브)에서 탈인산화 반응을 준비합니다. 전체 부피를 5 μL로 만들기에 충분한 RNase-free 물.
   참고: 일반적인 샘플의 경우 75ng의 RNA(또는 80nt RNA의 경우 약 2pmol)가 이 프로토콜을 사용하여 small RNA를 정량화하기에 충분한 것으로 간주됩니다.
2. 37°C에서 30분 동안 배양하여 RNA를 탈인산화한 다음 65°C에서 5분 동안 배양하여 효소를 비활성화하고 RNA를 변성시킵니다. 변형을 방지하기 위해 샘플을 4°C에서 최소 10분 동안 보관하십시오.

2. Linker 1과 RNA의 3' 말단에 대한 결찰

1. 탈인산화된 RNAs(단계 1의 생성물) 5 μL, 0.5 μL의 40 U/μL RNase inhibitor, 1 μL의 100 μM Linker 1(표 1), 10 mM ATP 3 μL, 10x T4 RNA ligase 반응 완충액 2.5 μL, PEG8000 15 μL(50% 용액)를 첨가하여 멸균 PCR 튜브에서 Linker 1 ligation 반응을 준비하고, 2 μL의 30 U/μL T4 RNA 리가아제 1 및 1 μL의 RNase-free 물.
   참고: 시료 처리를 용이하게 하기 위해 시약을 마스터 믹스로 만들 수 있습니다. 마스터 믹스에 PEG8000 및 T4 RNA 리가아제 1을 포함하지 마십시오.
2. 25 °C에서 2 시간 동안 배양 한 다음 16 °C에서 16 시간 동안 배양하여 Linker 1을 RNA에 결찰합니다.
3. Linker-1-ligated RNA를 컬럼 정제합니다. DNA/RNA 회수 및 세척을 위한 키트를 사용합니다( 재료 표 참조).
   참고: 이 컬럼 정제 프로토콜은 동일한 키트를 사용하는 모든 후속 컬럼 정제에 적용됩니다. 염료 여과 기술을 사용하여 염료 종결제를 염기서열분석 반응에서 제거하는 키트( 재료 표 참조)는 이러한 키트의 PEG8000 필터와 호환되지 않으므로 여기에 사용할 수 없습니다. 정제 후에는 각 샘플의 부분 표본(1.2 μL)을 저장하는 것이 좋습니다. 필요한 경우, 이러한 부분 표본은 상용 핵산 분석기를 실행하여 연결 효율을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 추가 단계가 있을 때까지 나머지 정제된 샘플을 얼음 위에 두거나 -20 °C에서 보관하십시오.
   1. 시료 부피가 50 μL< 경우 RNase-free 물을 추가하여 50 μL가 되도록 합니다. oligo binding buffer(키트에 제공) 2 부피를 시료 1 부피에 추가합니다. 시료 1부피에 100% 에탄올 8부피를 추가합니다.
   2. 샘플(한 번에 최대 750μL)을 2mL 수집 튜브(키트에 제공) 내부에 배치된 컬럼에 로드합니다. RNA를 컬럼에 결합하려면 10,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 플로우 스루(즉, 수집 튜브의 액체)를 버립니다. 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣습니다.
   3. 컬럼에서 불순물을 씻어내기 위해 750μL의 DNA 세척 완충액(키트에 제공)을 컬럼에 추가합니다. 10,000 x g 에서 30초 동안 원심분리하고 플로우 스루를 버립니다. 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣습니다.
   4. 최대 속도(예: 벤치탑 마이크로 원심분리기의 경우 16,000 x g )로 원심분리하여 잔류 DNA 세척 완충액을 추가로 1분 동안 제거합니다.
   5. RNA를 용리하려면 컬럼을 멸균 1.5mL 튜브로 조심스럽게 옮기고 RNase가 없는 물을 컬럼에 추가합니다. 용리 과정 중 발생할 수 있는 부피 손실을 고려하기 위해 RNA를 용출할 때 필요한 것보다 더 큰 부피를 사용하십시오. 예를 들어, 다음 단계에서 15 μL가 필요한 경우 용리를 위해 17 μL의 RNase-free water를 추가합니다. 10,000 x g 에서 30초 동안 원심분리기.

3. AlkB demethylase에 의한 전사 후 메틸화 제거

참고: AlkB는 DNA와 RNA의 메틸화된 뉴클레오티드(전부는 아님)에서 메틸기를 제거하는 박테리아 효소입니다. RNA에서 여러 유형의 메틸화된 리보뉴클레오티드를 제거하면 역전사 효소의 감소를 방지하여 더 많은 전체 길이 판독 및 변형 부위 식별을 가능하게 합니다. 이 단계는 RNA의 예기치 않은 분해를 방지하기 위해 낮은 pH에서 제어해야 합니다.

1. 1.4611g의 2-케토글루타레이트(M당 146.11g)를 RNase가 없는 물 10mL에 용해시켜 1M 2-케토글루타레이트 원액을 준비합니다. 필터는 0.2μm 주사기 필터를 통해 용액을 살균합니다. 원액을 2mL 멸균 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
2. 0.88g의 L-아스코르브산(M당 176.12g)을 RNase가 없는 물 10mL에 용해시켜 0.5M L-아스코르브산 원액을 준비합니다. 필터는 0.2μm 주사기 필터를 통해 용액을 살균합니다. 원액을 2mL 멸균 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
3. 0.9835g의 황산제일철 암모늄(M당 392.14g)을 RNase가 없는 물 10mL에 용해시켜 0.25M 황산철 암모늄 육수화물 원액을 준비합니다. 필터는 0.2μm 주사기 필터를 통해 용액을 살균합니다. 원액을 2mL 멸균 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
4. 2.383g의 HEPES(M당 238.30g)를 RNase가 없는 물 10mL에 용해시켜 1M HEPES의 원액을 준비합니다. NaOH를 사용하여 용액의 pH를 8로 조정하고 0.2μm 주사기 필터를 통해 용액을 여과하여 살균합니다. 원액을 2mL 멸균 튜브에 분취하고 -20°C에서 보관합니다.
5. 2x AlkB 반응 완충액을 준비합니다. 완충액 10mL를 만들기 위해 1.5μL의 1M 2-케토글루타레이트(3.1단계에서 제조), 80μL의 0.5M L-아스코르브산(3.2단계에서 제조), 6μL의 0.25M 황산철암모늄 육수화물(3.3단계에서 제조), 10mg/mL BSA 100μL, 1M HEPES 1000μL(3.4단계에서 제조, 마지막에 추가)를 결합하고, 및 8812.5 μL의 RNase-free 물. 필터: 0.2μm 주사기 필터를 통해 완충액을 멸균합니다.
   참고: 2x AlkB 반응 완충액은 구성 요소의 화학적 안정성으로 인해 각 실험 직전에 새로 준비해야 합니다.
6. Linker-1-ligated RNA 20μL(2단계 제품) 20μL, 2x AlkB 반응 완충액 50μL(3.5단계에서 제조), AlkB 탈메틸화효소 2μL, RNase 억제제 1μL 및 RNase-free 물 27μL를 첨가하여 멸균 PCR 튜브에서 AlkB 분해 반응을 준비합니다.
7. RNA에서 전사 후 메틸화를 제거하기 위해 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
8. 반응에서 AlkB를 제거하려면 아래 설명된 단계를 따르십시오.
   1. 깨끗한 상 분리를 위해 AlkB 반응에 RNase가 없는 물 50μL를 첨가한 다음 100μL 페놀: 클로로포름: 이소아밀 알코올 25:24:1(pH = 5.2)을 추가합니다.
   2. 10초 동안 손으로 흔든 다음 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다. 탁상형 원심분리기의 로터가 PCR 튜브와 호환되는지 확인하십시오. 필요한 경우 어댑터를 사용하십시오.
   3. RNA(즉, 상단의 수성층, 약 140μL)를 멸균된 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 클로로포름(즉, 바닥층)이 수성층에 혼합되면 동일한 설정으로 다시 원심분리합니다.
   4. 추출된 RNA에 클로로포름 100μL를 첨가하여 잔류 페놀을 제거합니다. 10초 동안 손으로 흔든 다음 16,000 x g 에서 10분 동안 원심분리합니다.
   5. RNA(즉, 상단의 수성층, 약 120μL)를 멸균된 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
9. 추출된 RNA를 컬럼 정제합니다. DNA/RNA 회수 및 세척을 위한 키트를 사용합니다( 재료 표 참조). 2.3단계에서 자세히 설명한 프로토콜에 따라 컬럼 정제를 수행합니다.

4. 여분의 링커 1 제거

참고: 정제 후에는 각 샘플의 부분 표본(1.2 μL)을 저장하는 것이 좋습니다. 필요한 경우, 이러한 부분 표본은 상용 핵산 분석기를 실행하여 RecJf 분해 효율성을 확인하는 데 사용할 수 있습니다. 정제된 샘플을 즉시 진행하여 역전사를 수행합니다.

1. 15 μL의 Linker-1-ligated RNAs(3단계 제품), 1 μL의 40 U/μL RNase inhibitor, 2 μL의 10x kit buffer 2( 재료 표 참조) 및 2 μL의 50 U/μL 5'-deadenylase를 첨가하여 멸균 PCR 튜브에서 데데닐화 반응을 준비합니다.
2. 30°C에서 1시간 동안 배양하여 링커 1의 5' 말단에 있는 아데닌을 제거합니다. 2μL의 30U/μL RecJf를 데드데닐화 반응에 첨가합니다.
3. 37°C에서 30분 동안 배양하여 여분의 Linker 1을 분해합니다. 2μL의 30U/μL RecJf를 반응에 추가합니다.
4. 37 °C에서 30 분 동안 배양하여 여분의 Linker 1의 분해를 계속한 다음 65 °C에서 20 분 동안 효소를 변성시킵니다.
5. Linker-1-ligated RNA를 컬럼 정제합니다. 겔 여과 기술을 사용하여 염료 종결 물질을 염기서열분석 반응에서 제거하는 키트를 사용하십시오( 재료 표 참조). 이는 짧은 잔류물(예: 2 - 10 bp 길이의 올리고뉴클레오티드)을 제거하는 데 효과적입니다. 정제를 위해 아래에 설명된 단계를 따르십시오.
   1. 제조업체의 프로토콜에 따라 겔 필터 컬럼을 준비합니다. 컬럼을 멸균 1.5mL 튜브에 넣고 컬럼에 24μL의 시료를 로드합니다.
   2. RNA를 정제하려면 800 x g 에서 3분 동안 원심분리하고 컬럼을 버립니다. 정제된 RNA는 용리액에 있습니다.

5. 역전사(RT) 반응

참고: 다음 RT( 재료 표 참조) 반응 설정은 AQRNA-seq 호환성을 허용하기 위해 약간의 수정을 가한 제조업체의 프로토콜을 따릅니다.

1. 24 μL의 템플릿 RNA(4단계 제품), 1 μL의 2 μM RT 프라이머(표 1) 및 1 μL의 dNTP(각 유형의 뉴클레오티드 10 mM)를 첨가하여 멸균 PCR 튜브에서 RT 프라이머 어닐링 반응을 준비합니다.
2. 80°C에서 2분 동안 배양하여 RT 프라이머를 템플릿 RNA에 어닐링한 다음 즉시 얼음에서 2분 동안 냉각합니다.
3. 어닐링 반응 튜브에 6 μL의 5x RT 반응 완충액, 1 μL의 40 U/μL RNase 억제제 및 1 μL의 역전사 효소를 첨가하여 RT 반응을 준비합니다.
4. 50°C에서 2시간 동안 배양하여 RNA 템플릿을 역전사한 다음 70°C에서 15분 동안 배양하여 효소를 비활성화합니다. RT 산물(즉, RNA-cDNA 하이브리드)은 4°C 또는 -20°C에서 밤새 보관할 수 있습니다.

6. RNA 가수분해

1. 1μL의 5M NaOH를 RNA-cDNA 하이브리드(5단계의 제품)에 추가합니다. RNA-cDNA 하이브리드의 RNA 가닥을 가수분해하기 위해 93°C에서 3분 동안 배양합니다.
2. 0.77μL의 5M HCl을 첨가하여 반응을 중화합니다. HCl을 첨가한 후 튕겨서 섞고 튜브를 아래로 회전시킵니다. 중화는 즉각적입니다.
   참고: 완충 조건에서 1μL의 NaOH를 중화하는 데 필요한 5M HCl의 정확한 양을 테스트하는 것이 좋습니다(예: pH 스트립 사용).
3. 단일 가닥 cDNA를 컬럼 정제합니다. DNA/RNA 회수 및 세척을 위한 키트를 사용합니다( 재료 표 참조). 2.3단계에서 자세히 설명한 프로토콜에 따라 컬럼 정제를 수행합니다.
   참고: 염기서열분석 반응에서 염료 터미네이터를 제거하기 위해 겔 여과 기술을 사용하는 키트( 재료 표 참조)는 이전 단계의 pH 변화로 인해 여기에서 사용할 수 없습니다.
4. 정제된 cDNA를 5 μL< 빠르게 진공 투여한 다음 RNase가 없는 물을 추가하여 부피를 다시 5 μL로 만듭니다. cDNA를 완전히 건조시키기 위해 빠르게 진공 청소기로 청소하지 않도록 주의하십시오.
5. 정제된 cDNA를 멸균 PCR 튜브에 전달합니다. 정제된 cDNA는 -20°C에서 최대 1주일 동안 보관할 수 있습니다.

7. cDNA의 3' 말단에 대한 링커 2의 결찰

1. 5 μL의 cDNAs(단계 6의 제품), 1 μL의 50 μM Linker 2(표 1), 2 μL의 10x T4 DNA ligase 반응 완충액, 10 mM ATP의 1 μL, 9 μL의 PEG8000(50% 용액) 및 2 μL의 400 U/μL T4 DNA 리가아제를 첨가하여 멸균 PCR 튜브에서 Linker 2 ligation 반응을 준비합니다.
   참고: 시약은 샘플 처리를 용이하게 하기 위해 마스터 믹스로 만들 수 있습니다. 마스터 믹스에 PEG8000 및 T4 DNA 리가아제를 포함하지 마십시오.
2. 16°C에서 16시간 동안 배양하여 Linker 2를 cDNA에 결찰합니다.
3. Linker-2-ligated cDNA를 컬럼 정제합니다. DNA/RNA 회수 및 세척을 위한 키트를 사용합니다( 재료 표 참조). 2.3단계에서 자세히 설명한 프로토콜에 따라 컬럼 정제를 수행합니다.

8. 여분의 링커 2 제거

1. 16 μL의 Linker-2-ligated cDNA, 2 μL의 10x kit buffer 2 및 2 μL의 50 U/μL 5'-deadenylase를 첨가하여 멸균 PCR 튜브에서 데데닐화 반응을 준비합니다. 30°C에서 1시간 동안 배양하여 링커 2의 5' 말단에 있는 아데닌을 제거합니다.
2. 2μL의 30U/μL RecJf를 데드데닐화 반응에 첨가합니다. 37°C에서 30분 동안 배양하여 여분의 Linker 2를 소화합니다. 2μL의 30U/μL RecJf를 반응에 추가합니다.
3. 37 °C에서 30 분 동안 배양하여 과잉 Linker 2의 분해를 계속한 다음 65 °C에서 20 분 동안 효소를 변성시킵니다.

9. 시퀀싱 프라이머를 이용한 cDNA의 PCR 증폭

1. PCR 프라이머를 샘플에 할당합니다. 각 시료는 효과적인 멀티플렉싱을 위해 정방향 및 역방향 프라이머의 고유한 조합이 필요합니다(표 1).
2. RNase가 없는 물을 추가하여 시료 부피를 25 μL로 늘리고, PCR을 반복해야 하는 경우 각 시료의 5 μL를 멸균 PCR 튜브에 백업으로 저장합니다.
3. 20 μL의 cDNA(8단계 제품), 1 μL의 2.5 μM 포워드 프라이머, 1 μL의 2.5 μM 리버스 프라이머, 25 μL의 2x DNA 중합효소 완충액, 2 μL의 RNase-free water 및 1 μL의 DNA polymerase를 첨가하여 PCR 반응(PCR 키트용 재료 표 참조)을 준비합니다.
   참고: 시약은 샘플 처리를 용이하게 하기 위해 마스터 믹스로 만들 수 있습니다. 마스터 믹스에 DNA 중합효소를 첨가하지 마십시오.
4. 94°C에서 1분 동안 초기 변성으로 PCR을 수행한 다음 98°C에서 20초 동안 18주기 변성-58°C에서 20초 동안 어닐링-68°C에서 1분 동안 연장합니다.
   참고: 선형 범위를 넘어 증폭하는 PCR을 하지 마십시오. 총 18개의 주기가 대부분의 실험에 최적이지만 상황에 따라 다를 수 있습니다.
5. PCR 산물을 25 μL 미만으로 빠르게 진공 투여한 다음 RNase-free water를 첨가하여 부피를 다시 25 μL로 만듭니다. PCR 산물 5 μL를 멸균 0.5 mL 튜브에 옮겨 크기 분포를 확인합니다(단계 9.6 참조). 추가 단계까지 나머지 20μL의 PCR 산물을 -20°C에서 보관합니다.
6. 아래에 설명된 대로 PCR 산물의 크기 분포를 확인하십시오.
   1. TAE 완충액에 3% 아가로스 겔을 준비한다.
      참고: 이 프로토콜에서 브롬화 에티듐(EtBr)은 전기영동 후 겔 염색에 사용됩니다(9.6.5단계 참조). 이 단계에서 적절한 DNA 염색을 겔 용액에 추가하거나 나중에 겔 염색에 사용할 수 있습니다.
   2. 1 μL의 6x 로딩 염료를 5 μL의 PCR 산물에 혼합하고(단계 9.5에서) 혼합물로 겔을 로드합니다.
   3. 5 μL의 DNA ladder를 첫 번째 샘플 앞의 웰과 마지막 샘플 뒤의 웰에 로드합니다. 50 bp 또는 100 bp DNA ladder를 사용하여 150 bp 및 300 bp 사이의 PCR 산물의 크기 구분을 개선할 수 있습니다.
   4. 겔 전기영동을 실행하여 PCR 산물을 찾습니다. 적절한 실행 조건은 상황에 따라 달라질 수 있습니다. 여기에서 17.78cm(너비) x 10.16cm(높이) x 1cm(두께) 겔 슬래브에 대해 120V, 400mA에서 75분 동안 실행합니다.
   5. 젤을 상자에 넣고 겔이 완전히 잠길 때까지 상자에 탈이온수(DI)를 채웁니다. 겔을 담근 DI 물에 EtBr 10μL를 추가합니다. 상자를 호일로 싸서 셰이커에 놓습니다. 흔들면서 30분 동안 젤을 염색합니다.
   6. EtBr이 포함된 폐기물을 흄 후드에 넣은 폐기물 병에 버리십시오. DI 물로 겔을 한 번 헹구고 EtBr 함유 물을 쓰레기통에 버립니다.
   7. 젤이 완전히 잠길 때까지 상자에 DI 물을 채웁니다. 상자를 호일로 싸서 셰이커에 놓습니다. 흔들면서 10분 동안 젤을 씻으십시오.
   8. EtBr 함유 물을 흄 후드의 폐기물 병에 버리십시오. 젤 이미저를 사용하여 밴드를 시각화합니다. 겔의 고해상도 이미지를 획득합니다.

10. 젤 정화

1. TAE 완충액에 3% 아가로스 겔을 준비한다. 넓은 빗(두께 1mm, 너비 5mm, 깊이 15mm)이 있는 1cm 두께의 겔을 만들어 각 웰에 최소 25μL의 시료 로딩 염료 혼합물을 포함할 수 있습니다.
2. 4 μL의 6x 로딩 염료와 20 μL의 PCR 산물(단계 9.5에서)을 혼합하고 혼합물로 겔을 로드합니다. 겔 절제 중 교차 오염을 최소화하기 위해 시료 사이에 빈 레인을 남겨 둡니다.
3. DNA ladder를 로드하고, 겔 전기영동을 실행하고, 겔을 염색 및 세척하고, 9.6단계에 설명된 대로 겔 이미지를 촬영합니다.
4. 표적 크기 범위 내에서 PCR 산물을 포함하는 겔 블록을 절제합니다. primer dimer(insert가 없는 175 bp linker)로 인한 오염을 최소화하려면 195 bp (175 bp linker + 20 bp miRNAs) 이상의 크기의 PCR 산물을 추출합니다.
5. 겔 추출을 사용하여 PCR 산물을 정제합니다. 겔 추출 키트를 사용하십시오( 재료 표 참조). 정제 프로토콜은 제조업체의 프로토콜을 기반으로 하며, AQRNA-seq 호환성을 위해 약간의 수정이 가미되었습니다. 모든 원심분리 단계는 달리 명시되지 않는 한 실온에서 탁상형 원심분리기를 사용하여 17,900 x g 에서 1분 동안 수행해야 합니다. 아래에 설명된 단계를 따릅니다.
   1. 튜브 내부의 겔 블록의 무게를 측정합니다. 6 부피의 Buffer QG(키트에 제공)를 1 부피의 겔 블록(1mg 겔은 약 1μL)에 추가합니다.
   2. 50°C에서 10분 동안 또는 겔 블록이 완전히 용해될 때까지 배양합니다. 겔 용해를 용이하게 하기 위해 2분마다 Vortex 튜브를 만듭니다. 겔을 용해시킨 후, 혼합물은 용해된 겔이 없는 완충액 QG의 색상과 유사해야 합니다. 색상이 주황색 또는 보라색인 경우 3M 아세트산 나트륨(pH = 5.0) 10μL를 넣고 잘 섞습니다.
   3. 혼합물에 이소프로판올 1겔을 넣고 잘 섞는다. 스핀 컬럼을 2mL 수집 튜브(키트에 제공)에 넣습니다.
   4. DNA를 결합하려면 샘플(매번 최대 750μL)을 컬럼과 원심분리기에 적용합니다. 플로우 스루를 버리고 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣습니다. 스핀 컬럼당 겔의 최대 양은 400mg입니다.
   5. 500μL의 Buffer QG를 컬럼과 원심분리기에 추가합니다. 플로우 스루를 버리고 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣습니다.
   6. 불순물을 세척하려면 750μL의 Buffer PE(키트에 제공)를 컬럼에 추가하고 컬럼을 5분 동안 그대로 둔 다음 원심분리기를 합니다. 플로우 스루를 버리고 컬럼을 동일한 수집 튜브에 다시 넣습니다. 잔류 세척 버퍼를 제거하기 위해 다시 한 번 원심분리기합니다.
   7. 컬럼을 멸균된 1.5mL 튜브에 넣습니다. DNA를 용리하려면 컬럼 멤브레인 중앙에 30μL의 Buffer EB(키트에 제공)를 추가하고 컬럼을 4분 동안 그대로 둔 다음 원심분리합니다.
   8. 겔 정제된 PCR 산물을 12 μL의 완충액 EB에서 Speed-vac 및 재현탁시킵니다.
6. UV-Visible 분광광도법 및/또는 형광 정량화로 구성된 라이브러리의 농도를 측정합니다.

11. 라이브러리 시퀀싱

1. 생성된 라이브러리를 외부 염기서열분석 센터에 제출하여 품질 평가 및 Illumina 염기서열분석을 수행합니다. small RNA landscape의 정량적 매핑에서 충분한 감도를 보장하려면 각 방향(즉, PE75)에서 75-bp read를 사용하는 paired-end sequencing을 선택하여 각 샘플에 대해 각 방향에서 최소 1.5M raw sequence read를 목표로 합니다. NextSeq 염기서열분석에는 맞춤형 프라이머(표 1)를 사용하지만, MiSeq 염기서열분석에는 선택 사항입니다.
   참고: 염기서열분석은 MiSeq 또는 NextSeq500 플랫폼을 사용하여 수행할 수 있습니다. 플랫폼 선택은 샘플의 특성과 총 샘플 수에 따라 달라질 수 있습니다.

12. 데이터 분석 파이프라인

참고: 그림 2 는 원시 염기서열 읽기(FASTQ 형식)를 입력으로 사용하고 관심 있는 작은 RNA 종의 구성원을 나타내는 행과 샘플을 나타내는 열이 있는 풍부도 행렬을 생성하는 데이터 분석 파이프라인과 관련된 간소화된 절차를 그래픽으로 보여줍니다. paired-end sequencing의 경우 각 샘플은 두 개의 FASTQ 파일에 해당하며, 하나는 정방향 읽기용이고 다른 하나는 역방향 읽기용입니다. 모든 관련 스크립트와 각 단계에 대한 광범위한 주석이 포함된 설명서가 포함된 전체 데이터 분석 파이프라인은 GitHub(https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git)에서 사용할 수 있습니다.

1. 외부 염기서열분석 센터에서 판독한 원시 염기서열을 검색하고 FastQC¹⁴ 또는 fastp¹⁵와 같은 오픈 소스 프로그램을 사용하여 염기서열분석 품질을 평가합니다.
2. FASTA 형식의 참조 시퀀스 라이브러리를 생성합니다.
   참고: 다양한 small RNA 클래스에 대한 파이프라인의 적응성의 핵심은 적절한 참조 서열 라이브러리입니다. 특정 관심 RNA 클래스(예: miRNA)의 구성원에 대한 정확한 존재도 추정치를 달성하기 위해 사용자는 파이프라인과 함께 사용할 참조 서열 라이브러리를 꼼꼼하게 선별해야 합니다. 파이프라인 실행을 위한 다른 모든 지침은 서로 다른 작은 RNA 클래스에서 일관되게 유지됩니다.
3. 데이터 분석 파이프라인을 구현하기 위해 AQRNA-seq라는 디렉토리를 작성하고 모든 스크립트, 품질 필터링된 시퀀스 읽기 및 참조 시퀀스 라이브러리를 이 디렉토리에 배치하십시오. GitHub(https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git)의 자세한 지침에 따라 하위 디렉터리를 준비하고 다른 유기체 및/또는 작은 RNA 종을 대상으로 하는 파일과 운영 체제 및/또는 작업 스케줄러의 호환성을 위한 필수 수정을 수행합니다.
4. GitHub(https://github.com/Chenrx9293/AQRNA-seq-JoVE.git)의 설명서에 설명된 단계에 따라 데이터 분석 파이프라인을 구현하며, 여기에는 설명, 입력 및 출력 파일, 각 단계에 대한 명령줄이 포함되어 있습니다. 요약하면, 파이프라인은 (i) read에서 링커 서열과 무작위 뉴클레오티드를 트리밍하고, (ii) 길이에 따라 read를 필터링하고, (iii) read를 참조 염기서열에 매핑하고, (iv) 모호한 매핑을 해결하고, (v) abundance matrix를 생성하는 것을 포함합니다.

결과

마이코박테리움 보비스 기하급수적 성장을 겪고 있는 BCG(bacilli de Calmette et Guérin) 균주 1173P2는 영양 결핍의 시계열(0, 4, 10 및 20일)을 거친 후 이전에 Hu et ^al.7에서 제시된 바와 같이 영양이 풍부한 배지에서 6일 동안 소생시켰습니다. Small RNA는 5개의 지정된 시점 각각에서 3개의 생물학적 복제를 통해 박테리아 배양에서 분리되었습니다. Illumina 라이브러리는 위에서 설명한 AQ...

토론

AQRNA-seq 라이브러리 준비 워크플로우는 시료 내 RNA의 캡처를 극대화하고 역전사 중 중합효소 감소를 최소화하도록 설계되었습니다⁷. 2단계 링커 결찰을 통해 새로운 DNA 올리고(링커 1 및 링커 2)가 과도하게 결찰되어 시료 내 RNA를 완전히 보완합니다. 과잉 링커는 단일 가닥 DNA에 특이적인 5' 내지 3' 엑소뉴클레아제인 RecJf를 사용하여 효율적으로 제거할 수 있으며, 접합된 산물은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-ketoglutarate	Sigma-Aldrich	75890	Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer Instrument	Agilent	G2938C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)	New England Biolabs	M0437M (component #: N0437AVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LE	AmericanBio	AB00972-00500	Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	F2262	Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA Analysis	Agilent	5067-1548	The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL)	New England Biolabs	B9000	This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform	Macron Fine Chemicals	4441-10
Demethylase	ArrayStar	AS-FS-004	Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix	New England Biolabs	N0447L (component #: N0447LVIAL)	This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat Block	VWR Scientific Products	13259-052	Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
DyeEx 2.0 Spin Kit	Qiagen	63204	Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power Supply	Bio-Rad Labrotories	PowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)	Eppendorf	022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)	Eppendorf	022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)	Eppendorf	022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), Pure	Sigma-Aldrich	E7023	The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging System	Alpha Innotech	FluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS	New England Biolabs	N0556S (component #: B7025SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	840-309000	The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl)	VWR Scientific Products	BDH3028	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), Pure	Macron Fine Chemicals	3032-16	Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit
L-Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A5960	Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
Microcentrifuge	Eppendorf	5415D
NanoDrop 2000 Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-2000
NEBuffer 2 (10X)	New England Biolabs	M0264L (component #: B7002SVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)	Thermo Fisher Scientific	AM9938
Oligo Clean & Concentrator Kit	Zymo Research	D4061	Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution)	New England Biolabs	M0437M (component #: B1004SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal Cycler	MJ Research	PTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2	Thermo Fisher Scientific	J62336
PrimeScript Buffer (5X)	TaKaRa	2680A
PrimeScript Reverse Transcriptase	TaKaRa	2680A
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704	This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder	New England Biolabs	N0556S (component #: N0556SVIAL)	NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL)	New England Biolabs	M0264L (component #: M0264LVIAL)	NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL)	New England Biolabs	M0314L (component #: M0314LVIAL)	Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X)	TaKaRa	638509	TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL)	New England Biolabs	M0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)	Sigma-Aldrich	S5881	Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL)	New England Biolabs	M0202L (component #: M0202LVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0202L (component #: B0202SVIAL)	NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL)	New England Biolabs	M0437M (component #: M0437MVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X)	New England Biolabs	M0437M (component #: B0216SVIAL)	NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)