삼차신경병증성 통증을 연구하기 위한 마우스의 원위 안와하부 신경(DIoN-CCI)의 만성 수축 손상

요약

생쥐에서 원위 안와하부 신경의 만성 수축 손상은 촉각 자극에 대한 반응으로 자발적 행동(얼굴 손질 활동 증가)과 통각 행동(von Frey 모발 자극에 대한 과민성)의 변화를 유발하며, 이는 지속적인 통증 및 이질증의 징후이며 삼차신경병증성 통증의 모델 역할을 합니다.

초록

동물 모델은 신경병증성 통증을 연구하는 데 필요한 도구로 남아 있습니다. 이 원고는 마우스의 삼차신경병증성 통증을 연구하기 위한 원위 안와하부 신경 만성 수축 손상(DIoN-CCI) 모델에 대해 설명합니다. 여기에는 만성 수축 손상을 수행하기 위한 외과적 절차와 진행 중인 통증 및 기계적 이질증의 징후인 자발적 및 유발적 행동의 변화를 평가하기 위한 수술 후 행동 검사가 포함됩니다. 이 방법과 행동 판독은 쥐의 안와하신경 만성 수축 손상(Infraorbital Nerve chronic constriction injury, IoN-CCI) 모델과 유사합니다. 그러나 IoN-CCI 모델을 마우스에 적용하기 위해서는 중요한 변경이 필요합니다. 첫째, 안와 내 접근법은 눈과 수염 패드 사이를 절개하는 보다 로스트랄 접근법으로 대체됩니다. 따라서 IoN은 안와강 외부에서 원위부로 결찰됩니다. 둘째, 생쥐의 운동 활동이 더 높기 때문에 쥐가 작은 우리에서 자유롭게 움직일 수 있도록 하는 것은 맞춤형으로 설계되고 제작된 구속 장치에 쥐를 넣는 것으로 대체됩니다. DIoN 결찰 후, 마우스는 자발적인 행동과 폰 프레이 모발 자극에 대한 반응에서 IoN-CCI 랫트와 유사한 변화, 즉 IoN 영역의 폰 프레이 모발 자극에 대한 지시성 얼굴 그루밍 증가 및 과민 반응을 보입니다.

서문

신경병증성 통증은 체성 감각 신경계의 손상으로 인해 발생하며, 이로 인해 감각 신호가 뇌에 비정상적으로 전달됩니다. 체성 감각 신경 손상이 항상 신경병증성 통증으로 이어지는 것은 아니지만, 임상적 신경병증의 중증도에 따라 유병률이 증가한다 ^1,2. 신경병증성 통증 환자는 자발적인 감각(작열감, 바늘로 찌르는 느낌, 전기 감각)과 비정상적으로 강렬하거나 오래 지속되는 통증, 무해하거나 유해한 자극과 같은 특정 증상을 경험하며, 이러한 증상은 만성화되고 기존 진통제 치료에 내성이 생기는 경향이 있다³. 신경병증성 통증 연구 분야에서 중요한 진전은 쥐의 좌골 신경 주위의 합자를 느슨하게 수축시키면 인간의 신경병증성 통증 상태와 유사한 행동이 발생한다는 발견에서 비롯된다⁴. 동물들은 열, 추위, 기계적 자극에 대한 역치가 감소하고 통각적 행동을 보인다. 인간과 설치류 사이의 통증 처리에 내재된 생물학적 차이에도 불구하고 동물 모델은 신경병증성 통증 발병의 기본 메커니즘을 연구하고 새로 제안된 치료 전략을 테스트하는 데 유용한 도구입니다.

감각 반사 기반 통증 검사 패러다임은 신경병증성 통증 모델에서 광범위하게 사용되어 왔지만, 지속적인 통증 또는 기타 자주 동반되는 장애(수면 장애, 우울증, 불안)를 측정하는 것은 삶의 질에 영향을 미치는 일반적인 임상 증상이라는 점을 고려할 때 충분한 관심을 받지 못했습니다 ^5,6,7,8. 쥐의 얼굴 그루밍 행동은 안와하 신경(IoN)의 만성 수축 손상(CCI) 후 자발적인 신경병증성 통증의 척도로 문서화되었습니다.^9,10. 또한, 쥐는 IoN 영역의 가벼운 촉각 자극에 대해 과민 반응을 보이는데, 이는 기계적 동질증을 나타냅니다.

쥐에 비해 쥐는 크기가 더 크기 때문에 외과 부상에 더 적합합니다. 그러나 마우스는 비용 및 공간 효율성을 제공하고 더 적은 양의 약물을 필요로 합니다. 또한, 형질전환 기술의 출현은 마우스의 사용을 더욱 촉진시켰다^11,12. 따라서 이 절차의 전반적인 목표는 쥐와 유사한 생쥐에서 외과적 안와 하부 신경 손상을 수행하여 삼차신경병증성 통증 연구를 위해 자발적이고 유발된 행동의 변화를 유도하는 것입니다.

프로토콜

동물은 국제 통증 연구 협회(International Association for the Study of PAIN)의 의식 있는 동물의 통증 연구 지침과 동물 연구에 대한 플랑드르 및 유럽 규정 및 ARRIVE 지침에 따라 치료되고 보살핌을 받습니다. 이 프로토콜은 기관 윤리 위원회(institutional Ethical Committee)의 승인을 받습니다.

1. 동물

1. 수컷 및 암컷 C57BL/6J 마우스(Janvier, 도착 시 10주령)를 사용하십시오.
2. 습도가 40%-60%이고 실온(RT)이 21 ± 1 °C인 식민지 방의 표준 단단한 바닥 마우스 케이지에 수컷과 암컷 마우스를 따로 수용합니다.
3. 물과 음식을 즉시 제공 하십시오.
4. 정상적인 12:12 h 어둡고 밝은 주기(08:00에 켜짐)로 마우스를 유지하십시오.

2. 수술

1. 마우스 당 약 6cm 길이의 크롬 내장 합자(6-0) 한 조각을 준비하고 건조 및 뻣뻣하고 부서지기 쉬운 것을 방지하기 위해 멸균 식염수에 넣습니다.
2. 케타민/자일라진(75/15mg/kg, 복강내, 주입량 10mL/kg)으로 마우스를 마취합니다. 발가락 사이의 피부를 끼어 마취의 깊이를 확인합니다. 마우스가 다리를 구부리지 않도록 합니다. 필요한 경우 동물이 완전히 마취될 때까지 기다리거나 추가 케타민/자일라진을 투여합니다.
   참고: 삼차신경병증성 통증의 발병을 방해할 수 있는 선제적 진통 효과를 피하기 위해 보조 진통제를 투여해서는 안 됩니다.
3. 수염 패드와 눈 사이의 협털을 부드럽게 면도하여 안와하공까지 약 4mm를 절개합니다. 수염이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이는 행동 테스트에 영향을 미칠 수 있습니다.
4. 마우스의 머리를 입체 프레임에 고정하거나 그렇지 않으면 머리를 고정합니다. 가열된 패드에 마우스를 올려 놓거나 그렇지 않으면 체온을 유지하도록 주의하십시오.
5. 건조하지 않도록 양쪽 눈에 연고를 바릅니다. 면도한 머리 부분을 알코올로 문지른 다음 베타딘으로 문지릅니다. 면도한 머리 부위를 노출시키는 수술용 드레이프를 놓습니다.
6. 2.7-2.14단계에서 현미경을 사용합니다.
7. 수염 패드의 가장자리와 눈 사이의 대략 중간 지점의 정중선에 수직으로 4mm의 피부 절개를 하고 안와 하부 구멍에 바로 돌출되어 눈 중심과 수염 패드 중심 사이의 선을 중심으로 합니다.
8. 표재성 결합 조직을 뭉툭하게 분리하여 IoN을 노출시킵니다. 근육 손상을 최소화하고 운동 신경 섬유를 피하도록 주의하십시오. IoN의 몸통(직경 1-1.5mm)이 두개골에서 나오는 위치와 수염 패드로 뻗어 나가는 위치 사이에서 약 3mm 깊이로 접근할 수 있는지 확인합니다(그림 1).
9. 회전 동작을 사용하여 신경이 손상되지 않도록 주의하면서 갈고리 결찰 보조기의 머리를 IoN 아래로 밀어 넣습니다.
10. 결찰 보조기구 끝에 있는 구멍을 통해 크롬 내장 합자를 놓고 결찰 보조기구를 집어넣어 합자가 IoN 아래에 남아 있고 합자의 양쪽 끝이 IoN에서 다소 등거리에 있도록 합니다.
11. 합자의 양쪽 끝에서 "슬립 매듭"을 묶고 매듭을 IoN에 밀어 넣습니다. 수축 정도를 정확하게 제어할 수 있도록 슬립 매듭이 부드럽게 작동하는지 확인하십시오. 매듭을 더 밀어 IoN을 조입니다. 신경의 직경을 눈에 띄는 양으로 줄인다⁴. 슬릿 매듭이 미끄러지지 않도록 슬릿 매듭 위에 일반 매듭을 놓습니다.
12. 매듭이 풀리지 않도록 약 1.5mm의 자유 끝을 남기고 합자의 끝을 자릅니다.
13. 2.2-2.8단계에 따라 가짜 수술을 수행합니다.
14. 합성 흡수성 봉합사(6-0)를 사용하여 피부 절개 부위를 봉합하고 동물이 가열된 패드 또는 적외선 가열 램프 아래에서 회복할 수 있도록 합니다.

3. 행동 테스트

1. 수술 전 테스트 전에 최소 8일 동안 쥐를 주거 환경에 적응시킵니다.
2. 수술 전 테스트 전에 3일 동안 하루에 한 번 이상 마우스를 테스트 절차에 익숙히게 하십시오.
3. 정상적인 조명 조건에서 테스트를 수행합니다. 필요한 경우 외부 소음으로 인한 방해를 최소화하기 위해 배경 소음을 제공하십시오.
4. 얼굴 그루밍 행동 관찰
   1. 침구 재료가 없는 덮개가 있는 플라스틱 케이지에 넣어 하우징에서 시험실까지 마우스 한 마리를 운반합니다. 동물을 운송하는 동안 외부 자극을 피하십시오.
   2. 침구가 없는 덮개가 있는 투명한 플라스틱 케이지(l x w x h: 12cm x 12cm x 17cm)에 마우스를 넣고 비디오 카메라 앞에 놓습니다. 거울을 놓으면 등이 카메라를 향할 때 동물의 얼굴을 볼 수 있습니다.
   3. 10분 동안 마우스의 동작을 기록합니다. 녹음하는 동안 실험자가 방에 없는지 확인하십시오.
   4. 다음 동물을 기록한 후 관찰 케이지를 청소합니다.
   5. 쥐의 실험 조건에 눈이 먼 관찰자가 기록된 행동을 분석하도록 합니다.
   6. 10분 분량의 녹화를 분석하는 동안 각 얼굴 손질 에피소드를 기록하십시오. 얼굴 손질은 동물이 앞발을 얼굴 부위에 접촉시키는 움직임 패턴입니다.
   7. 신체 그루밍 중 고립된 얼굴 그루밍과 얼굴 그루밍 행동을 구분한다⁹. 시퀀스가 바디 그루밍 앞이나 뒤에 오지 않으면 에피소드는 고립된 얼굴 그루밍으로 표시됩니다. 신체 그루밍은 발, 혀 또는 앞니가 얼굴이나 앞발 이외의 신체 부위에 닿도록 하는 움직임 패턴으로 정의됩니다. 얼굴 그루밍 시퀀스 전이나 후에 신체 그루밍이 있는 경우 에피소드는 신체 그루밍 중 얼굴 그루밍으로 레이블이 지정됩니다.
   8. 4 s cut-off 기준을 적용하여 얼굴 정리 에피소드 수를 결정합니다. 그루밍 작업 사이의 시간이 4초 미만인 경우 단일 에피소드 내의 일시 중지로 정의됩니다. 4초보다 큰 기간은 두 에피소드 사이에 그루밍 작업이 완전히 중단된 것으로 정의됩니다.
5. 기계적 자극 테스트
   1. 최대 6마리의 동물로 구성된 그룹으로 마우스를 하우징에서 침구가 있는 덮개가 있는 케이지에 넣어 시험실로 운반합니다. 다시 말하지만, 외부 자극을 피하도록 주의하십시오.
   2. 마우스를 한 번에 하나씩 테이블 위에 놓습니다.
      1. 마우스 꼬리를 부드러운 실리콘 클램프에 넣고 클램프를 테이블의 금속판에 자기적으로 부착합니다. 실리콘 소재는 꼬리에 가해지는 압력을 최소화하면서 꼬리가 클램프에서 미끄러지는 것을 방지합니다.
      2. 세 개의 벽으로 된 플라스틱 홀더(65mm x 25mm x 23mm)를 동물 위에 놓고 쥐의 머리만 용기에서 튀어나오도록 합니다. 홀더의 크기는 머리와 앞발을 움직일 수 있지만 동물이 그 안에서 회전하는 것을 방지합니다. 마지막으로 홀더 위에 추를 올려 홀더를 제자리에 고정합니다(그림 2).
   3. 4개의 von Frey 헤어로 구성된 등급별 시리즈를 사용합니다. 머리카락을 구부리는 데 필요한 힘은 0.02g, 0.16g, 0.4g 및 1.0g입니다.
   4. 쥐를 구속 장치에 넣고 10분 동안 손을 뻗는 습관을 들입니다. 30초마다 동물 한 마리당 손을 뻗는 움직임을 만듭니다.
   5. 동물이 편안한 상태에 있을 때 von Frey 털이 구부러질 때까지 vibrissae 중앙 근처의 IoN 영역 내에서 가장 가벼운 von Frey 털을 천천히 적용합니다. 자극이 1초 이상 걸리지 않도록 하십시오.
   6. 자극에 대한 동물의 반응을 다음 반응 범주 중 하나에 맞게 점수를 매깁니다.
      1. 응답이 없는 경우 0점을 부여합니다.
      2. 감지를 위해 1점을 줍니다(예: 마우스가 자극 물체를 향해 머리를 돌린 다음 자극 물체를 탐색합니다).
      3. 금단 반응에 대해 2점을 줍니다(예: 자극이 가해질 때 마우스가 머리를 부드럽게 돌리거나 빠르게 뒤로 당깁니다). 때때로, 자극된 부위에 동측으로 한 번의 얼굴 닦음이 발생합니다.
      4. 공격, 즉 마우스가 자극 대상을 공격하여 물거나 잡는 움직임을 보이는 것에 대해 3점을 줍니다.
      5. 비대칭 얼굴 그루밍에 대해 4점을 부여합니다(즉, 마우스는 자극된 얼굴 영역을 향해 최소 3번의 연속적인 얼굴 세척 스트로크를 연속으로 보여줍니다).
   7. 각 마우스에 대해 von Frey 머리카락을 강도의 오름차순으로 적용하고 동측과 반대쪽을 무작위로 자극합니다. 각 자극 강도를 양쪽에 한 번씩 적용합니다.
   8. 각 동물에 있는 4개의 폰 프레이 털에 대한 반응의 평균 점수를 계산합니다. 동측측(ipsilateral side)과 반대측(oppositionlateral)에 대한 별도의 점수를 계산합니다.

결과

DIoN-CCI 마우스는 수술 후 고립된 얼굴 그루밍에 소요되는 시간과 고립된 얼굴 그루밍 에피소드 횟수가 크게 증가한 것으로 나타났습니다(그림 3). 가장 강한 증가는 수술 후 첫 주에 발생하고 그 다음 주에 작아지지만 적어도 6주 동안은 크게 증가합니다. 바디 그루밍 중 얼굴 그루밍은 거의 영향을 받지 않습니다.

DIoN-CCI 마우스?...

토론

랫트의 경우, 진동촉각 판별에서 복잡한 휘젓는 패턴을 제어하는 온전한 미세한 근육 조직의 중요성과 피부 안와하 신경 영역까지의 정중선 절개의 상대적 거리를 고려할 때, IoN에 대한 안와내 접근법이 바람직하다는 주장이 이전에 제기되어 왔다¹⁰. 다른 사람들은 털이 많은 피부, 꼬리에서 진동 패드까지 절개를 통한 원위 접근법이 여러 가지 이점이 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromic catgut (6-0)	Dynek	CG602D	ligatures
Cotton applicator	Pharmacy
Digital video camera	Sony	HDR-CX330E
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-10
Dumont forceps - Micro-blunted tips (#5/45)	Fine Science Tools	11253-25
Duratears	Alcon	0037-820	ophthalmic ointment
Hooked ligation aid	Fine Science Tools	18062-12
Ketalar	Pfizer		ketamine (50 mg/mL)
Operation microscope	Kaps	SOM 62
Precision cotton swab	Qosina	10225
Precision trimmer	Philips	HP6392/00
Rompun	Bayer		xylazine (2%)
Scissors - blunt tips	Fine Science Tools	14574-09
Semmes-Weinstein Von Frey Aesthesiometer kit	Stoelting	58011
Vicryl Rapide	Ethicon	MPVR489H	sutures