High-Speed Atomic Force Microscopy Imaging of DNA Three-point-Star Motif Self Assembly Using Photothermal Off-Resonance Tapping(광열 오프-레조넌스 태핑을 이용한 DNA 3점-별 모티프 자기 조립)

요약

여기에서는 광열 오프-레조넌스 태핑(PORT)을 통한 생체 분자 상호 작용을 관찰하기 위한 이미징 프로토콜을 보여주며, 이미징 매개변수를 최적화하고, 시스템 한계를 식별하고, 이미징 3점-별 DNA 모티프 어셈블리의 잠재적 개선 사항을 조사했습니다.

초록

고속 원자력 현미경(HS-AFM)은 액체 환경의 생리학적 조건에서 이미징할 수 있는 기능으로 인해 단일 분자 생물학적 프로세스를 실시간으로 시각화하는 데 널리 사용되는 분자 이미징 기술입니다. 광열 오프 레조넌스 태핑(PORT) 모드는 구동 레이저를 사용하여 제어된 방식으로 캔틸레버를 진동시킵니다. 이 직접 캔틸레버 작동은 MHz 범위에서 효과적입니다. 공진 진폭이 아닌 시간 도메인 힘 곡선에서 피드백 루프를 작동하는 것과 결합된 PORT는 팁 샘플 힘을 직접 제어하여 초당 최대 10프레임의 고속 이미징을 가능하게 합니다. PORT는 섬세한 조립 역학의 이미징과 생체 분자에 의해 형성된 패턴의 정밀한 모니터링을 가능하게 하는 것으로 나타났습니다. 지금까지 이 기술은 이 작업에서 보여준 DNA 3점-별 모티프 조립 패턴을 포함하여 다양한 동적 체외 연구에 사용되었습니다. 일련의 실험을 통해 이 프로토콜은 HS-PORT AFM 이미징 시스템의 최적 이미징 매개변수 설정과 궁극적인 한계, 그리고 이것이 생체 분자 조립 프로세스에 미치는 영향을 체계적으로 식별합니다. 또한, 구동 레이저가 샘플과 주변 액체에 미치는 잠재적인 원치 않는 열 효과를 조사하며, 특히 스캔이 작은 영역으로 제한되는 경우 더욱 그렇습니다. 이러한 결과는 복잡한 생물학적 시스템을 연구하는 데 PORT 모드 적용의 발전을 주도할 귀중한 통찰력을 제공합니다.

서문

고속 원자력 현미경 (HS-AFM)은 빠르게 성장하는 이미징 기술입니다 1,2,3,4. 연구자가 생체 분자 상호 작용을 실시간으로 시각화할 수 있는 속도로 작동합니다 ^5,6,7,8,9. 광열 오프 공진 태핑 (PORT)은 피크 포스 태핑 10,11, 펄스 포스 모드 ^12,13 또는 점프 모드¹⁴와 유사한 오프 공진 이미징 모드입니다. 그러나 PORT는 스캐너를 수직으로 진동시키는 대신 캔틸레버에 초점을 맞춘 여기 레이저를 통해 캔틸레버만 수직으로 진동합니다(일반적으로 클램핑 포인트에 가까움). 캔틸레버는 바이모프 효과로 인해 변형됩니다: 전력 변조 여기 레이저는 코팅된 캔틸레버를 주기적으로 가열하며, 이는 캔틸레버와 코팅 재료⁽¹⁵)의 다른 열팽창 계수로 인해 구부러집니다. 캔틸레버 및 시료 가열은 완전한 정현파 드라이브⁵를 사용하는 대신 각 진동 주기 동안 주기적으로 꺼졌다가 다시 켜지는 드라이브 레이저를 사용하여 최소화할 수 있습니다.

DNA는 수년 동안 생물학적으로 관련성이 있고 구조적으로 흥미롭고 생화학적으로 유용한 모티프를 형성하는 데 사용되어 왔습니다 16,17,18,19,20. 또한 DNA 구조는 AFM 이미징 품질²¹을 특성화하고 고속 AFM²²의 팁 효과를 평가하는 데 이상적으로 적합한 것으로 입증되었습니다. 무연턱 DNA 3점별(3PS)은 복잡한 생물학적 시스템에서 유사하게 구조화된 분자의 초분자 조직을 조사하기 위한 프로그래밍 가능한 모델 시스템으로 실용화되었습니다¹⁹. 이전에는 무턱말 삼중체 DNA 단량체에 의해 형성된 격자의 자체 조립을 HS-AFM²³을 통해 추적했습니다. 결국, 이들은 육각형 순서를 가진 큰 네트워크로 조직됩니다. 여기서, DNA 3-점 별⁽¹⁹)의 자기 조립은 공정 또는 샘플 손상의 중단을 최소화하면서 자기 조립 및 그 보정 메커니즘(²⁴)을 추적할 수 있을 만큼 충분히 빠른 스캔 속도로 PORT 기술로 이미지화됩니다. 모든 HS-AFM 모드와 마찬가지로 달성 가능한 이미징 품질, 이미징 속도 및 샘플의 원치 않는 방해 사이에는 절충점이 있습니다. 올바른 절충안을 선택함으로써, 초분자 어셈블리의 자기 조직화 패턴을 더 잘 이해할 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 DNA 3PS와 유사한 설정을 모델 시스템으로 사용하여 PORT에 특정한 매개변수를 최적화합니다. 이를 통해 충분히 큰 스캔 크기에서 빠른 이미징 속도로 작동하면서 샘플 손상을 최소화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 샘플 및 버퍼

참고 :이 연구에 사용 된 DNA 타일은 퍼듀 대학교 (Purdue University)의 마오 (Mao) 실험실에서 개발 된 3 점 별 모티프입니다^19,25. 이 연구에 사용된 모든 올리고뉴클레오티드는 Integrated DNA Technologies, Inc.에서 구입했습니다. 필요한 재료와 시약을 수집합니다.

1. 어닐링 버퍼(5mM TRIS, 1mM EDTA 및 10mM MgAc₂)에서 1:3:3 몰비(S1 0.6 μM, S2의 경우 1.8 μM, S3의 경우 1.8 μM)로 단일 가닥 DNA(ssDNA)를 혼합합니다. DNA 모티프의 최종 농도는 0.6 μM (49 ng / μL, 3PS의 분자량은 82020.3 g / mol)이어야합니다.
2. DNA 용액을 내열 용기에 넣고 80°C로 가열합니다. DNA 용액을 4시간 동안 80°C에서 20°C까지 천천히 냉각합니다. 이 어닐링 과정은 ssDNA 올리고뉴클레오티드가 원하는 이중 가닥 DNA 모티프를 형성하는 데 도움이 됩니다.
3. 정제를 위해 어닐링된 DNA 용액을 3% 아가로스 겔에 로드하여 과도한 ssDNA와 원치 않는 부산물을 제거합니다. 3x Tris-Borate-EDTA(TBE) 및 10mM Mg(CH₃COO)₂를 포함하는 실행 버퍼에서 약 2.5시간 동안 60V에서 2% 젤을 실행합니다.
4. DNA 모티프를 포함하는 젤의 밴드를 식별하고 찾습니다. 밴드가 크기에 따라 특정 위치로 이동했는지 확인합니다.
5. 겔에서 DNA 모티프가 포함된 밴드를 조심스럽게 절제합니다. 절제된 겔 조각을 겔 추출 스핀 컬럼에 넣고 3,000 x g 및 4°C에서 10분 동안 원심분리하여 DNA 모티프를 추출합니다.
6. 추출된 DNA 모티프의 완충액을 원심 농축기를 사용하여 어닐링 완충액으로 교체합니다. 농축 용액이 100μL 미만이 될 때까지 실온(또는 그 이하)에서 3000 x g 의 원심분리기. 그런 다음 300μL의 어닐링 버퍼를 추가하고 이 단계를 두 번 반복하여 버퍼가 교체되었는지 확인합니다.
7. 이미징을 위해 DNA 모티프를 6nM로 희석합니다. 분광 광도계 또는 기타 적절한 방법을 사용하여 농도를 정확하게 결정하고 조정하십시오. 이제 DNA 모티프를 이미징할 준비가 되었습니다.
   참고: 프로토콜의 모든 버퍼는 pH 8.0입니다. 세 개의 개별 대역에 대한 시퀀스 정보는 다음과 같습니다.
   S1: AGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGT
   AGGTTTCTTGCCAGGCACCATCGTAGGTTTCTTGCC
   S2: ACTATGCAACCTGCCTGGCAAGCCTACGATGGACA
   CGGTAACG
   S3: CGTTACCGTGTGGTTGCATAGT

2. 캔틸레버 팁 성장

1. SEM 캔틸레버 홀더에 캔틸레버 장착: 캔틸레버가 깨끗하고 오염 물질이 없는지 확인하십시오. 캔틸레버를 SEM 시스템과 호환되는 적절한 홀더에 장착합니다. 맞춤형 캔틸레버 홀더 디자인은 요청 시 공유할 수 있습니다.
2. 가스 주입: 가스 주입 시스템에 사용할 전구체 가스(예: 비정질 탄소 팁용 페난트렌 C₁₄H₁₀ 전구체)를 가열하여 새 팁을 성장시킵니다. 진공이 ^10-5mbar 미만이 되자마자 가스 주입 라인을 10초 동안 2회 퍼지하여 노즐 라인에 원치 않는 잔류 공기가 없는지 확인합니다(건 챔버에 대한 밸브를 닫은 상태에서 수행해야 함).
3. 팁 위치 조정: 주사 전자 현미경(SEM)을 사용하여 캔틸레버 끝을 찾습니다. 캔틸레버 홀더를 표면에 대해 AFM 캔틸레버 홀더에 놓았을 때 캔틸레버가 표시되는 각도와 동일한 각도(예: 이 경우 11°)로 기울여 이미징하는 동안 성장된 팁이 표면에 수직이 되도록 합니다. SEM의 위치와 초점을 조정하여 날카로운 탄소 나노 팁이 자랄 캔틸레버 팁의 명확한 시야를 확보하십시오.
4. 집속 전자빔 유도 증착(FEBID):
   1. 선택한 소프트웨어(이 경우 SmartFIB)에서 빔 전류(I) 및 가속 전압(V), 작동 거리(WD), 배율, 노출 형상, 선량/증착 시간 및 체류 시간과 같은 증착 매개변수를 설정합니다. 다음 매개변수는 AFM 이미징에 우수한 기계적 특성을 나타내는 비정질 탄소 팁을 성장시키는 데 사용되었으며, 이는 약 130nm의 길이와 2-4nm 범위의 반경으로 이어집니다.
      스폿/점을 노출된 형상으로 선택
      WD = 5mm
      I = 78pA 및 V = 5kV
      체류 시간 = 1μs
      선량 = 0.05 nC, 증착 시간 = 0.64 s
      배율 = 20000x
   2. 한 지점의 전자빔을 캔틸레버 팁에 조사하는 동시에 전구체 가스를 주입하고 증착이 완료되면 가스를 닫아 팁을 성장시키는 증착 공정을 시작합니다. 이 경우 SmartFIB 소프트웨어는 위에서 언급한 레시피를 설정한 후 자동으로 이를 수행합니다.
5. 성장 후 분석: 성장 후 SEM 이미징을 수행하여 새로 자란 팁을 검사하고 품질과 특성(팁 반경 및 길이)을 확인합니다. 팁 성장 후 1-2분 동안 기다렸다가 SEM 이미징 중 재증착을 방지하기 위해 모든 전구체 가스가 펌핑되었는지 확인합니다. SEM 챔버에서 샘플 홀더를 제거합니다.
6. 캔틸레버 재활용: SEM 시스템에 결합된 집속 이온 빔(FIB)이 설치된 경우 낮은 FIB 전류(예: 캔틸레버 손상을 방지하기 위해 1pA)를 사용하여 FIB 시스템으로 밀링하여 손상되거나 더러워진 팁을 제거합니다. 팁 붕괴를 방지하기 위해 팁 끝에서 베이스까지 단면 형태로 밀링하여 팁 제거를 수행합니다. 이것은 새로운 것을 다시 자라게 할 것입니다.

3. HS-AFM 기계설비

1. 이미징 셋업은 맞춤형-내장 포트 헤드^{(5, 26, 도} 1A), 상단에 운모가 있는 샘플 디스크가 있는 고속 스캐너(²⁶ ), 호환 가능한 컨트롤러⁽²⁷), 고속 이미징에 필요한 고대역폭을 갖는 고전압 증폭기, AFM 베이스, 및 앞서 언급한 장비⁽²⁷)를 제어하기 위해 필요한 소프트웨어를 갖춘 PC로 구성된다.
   참고: 이 경우, 이는 EPFL^{27, 28}의 Laboratory for Bio- and Nano- Instrumentation에서 계획을 얻을 수 있는 오픈 소스 구성 요소입니다. 또한 PORT 헤드 및 컨트롤러²⁹를 구축하는 방법에 대한 워크샵에 참석하고 LabView 기반 소프트웨어를 다운로드하여 사용할 수 있습니다.
2. 핀셋을 사용하여 캔틸레버 홀더의 스프링 클립 아래에 매우 짧은 캔틸레버(예: AC10DS 또는 이와 동등한 것)를 조심스럽게 놓습니다. 캔틸레버 칩이 고정되고 안정적인지 확인하십시오.
3. 그림 1B와 같이 왼쪽 유체 접근 포트를 통해 주사기를 사용하여 50μL의 액체를 추가합니다. 여기 레이저가 꺼진 상태에서 그림 1A에 표시된 AFM 헤드에 있는 세 개의 전용 손잡이를 사용하여 캔틸레버의 판독 레이저를 정렬합니다. 이를 위해 흰 종이에서 캔틸레버의 그림자를 관찰하면서 합계를 최대화합니다(그림자 방법). 그런 다음 두 개의 전용 손잡이를 사용하여 레이저 스폿을 포토다이오드의 중앙에 놓습니다.
4. Excitation VI에서 Excitation Enable 상자를 선택하여 구동 레이저를 켜고 정렬하여 캔틸레버를 작동시키고 진동시킵니다. 캔틸레버 여기 신호와 캔틸레버 편향 신호를 연결된 오실로스코프에 표시합니다. 편향 진동이 너무 낮으면(또는 존재하지 않는 경우) 구동 레이저가 캔틸레버에서 매우 멀리 떨어져 있을 수 있습니다. 이 경우 그림자 방법을 사용하고 편향 레이저를 꺼서 쉽게 정렬할 수 있습니다. 진동 최대화 amp그림 1A에 표시된 드라이브 레이저 조정 손잡이를 사용하여 위도.
5. PORT에서 캔틸레버 발진 진폭을 조정하려면 Excitation VI에서 레이저 다이오드 제어 회로(지금부터 피크 대 피크 AC 입력)로 전송되는 피크 대 피크 전압을 소프트웨어의 해당 컨트롤에 입력합니다. 레이저 다이오드를 전도 영역으로 유지하고 레이저를 렌더링하려면 레이저 다이오드 제어 회로(이제부터 DC 오프셋 입력)에 DC 전압을 추가하며, 이는 Excitation VI의 구성 상자에서도 수행됩니다. 둘 다 레이저 출력에도 영향을 미치며, 레이저 파워 미터로 측정할 수 있으며 캔틸레버 진동 진폭을 조정하는 데 사용됩니다.
6. 캔틸레버에 적용할 수 있는 최대 광열 여기 주파수를 결정하며, 이는 캔틸레버의 공진 주파수보다 낮아야 합니다. 공진 주파수는 Thermal Tune 또는 Frequency Sweep으로 결정합니다. 이 연구에 사용된 캔틸레버(AC10DS)는 액체의 공진 주파수가 약 400kHz(공기 중 1MHz)³⁰이며 300kHz 미만의 준정적 굽힘 영역을 갖습니다⁵. 따라서 해당 제한(약 100-200kHz) 미만의 PORT 주파수를 사용해야 합니다.
7. PORT rate 및 scan rate에 대한 이미징 매개변수와 설정을 Excitation 및 Scan Vis에서 각각 필요한 값으로 조정합니다(이 문서에 사용된 매개변수는 그림 설명에 명시되어 있음). 설정 및 이미징 매개변수가 구성되면 분자 상호 작용을 관찰하고 추적하는 데 필요한 이미징 실험을 수행합니다.
   참고: AC10DS 캔틸레버는 더 이상 판매되지 않으므로 동등한 캔틸레버가 제공될 때까지 Fastscan D 또는 BioLever³¹ 과 같은 대안을 사용해야 할 수 있습니다.

4. 적절한 상호 작용 곡선 얻기

1. 처음에는 접촉 모드로 설정된 Z-컨트롤러 VI에서 시작을 클릭하여 접촉 모드에서 샘플 표면에 접근합니다.
   1. 이 모드에서는 AFM 팁이 샘플과 직접 접촉합니다. 표면에 도달하면 Ramp VI에서 힘 대 거리 곡선을 수행하여 캔틸레버 편향 감도 보정을 얻습니다.
   2. 또한 간섭계로 얻은 캔틸레버 공급자 사양(덜 정확함) 또는 편향 감도 보정 후 열 조정 기반 보정을 통해 캔틸레버 스프링 상수를 추정합니다. 정확한 캔틸레버 교정은 정확한 팁-샘플 힘 제어를 위해 필수적입니다.
2. Z 컨트롤러 VI에서 Up 을 클릭하여 팁이 표면에 닿을 수 없는 표면에서 Z-piezo를 완전히 후퇴시킨 후 Z 컨트롤러 VI에서 PORT 모드로 전환하고 Excitation VI 확인란에서 여기 레이저를 켭니다. 시작하려면 AC10DS 캔틸레버를 사용하여 Excitation VI(이 실험의 경우 100kHz)에서 원하는 주파수로 작동하도록 PORT 모드를 설정합니다.
3. 캔틸레버가 없는 진동을 가까이에서 기록하되 표면에 닿지 않도록 기록합니다. 그런 다음 기록할 표면과 접촉하는 Z 컨트롤러의 피드백을 켜고 수정을 클릭하여 캔틸레버가 표면과 간헐적으로 접촉할 때 캔틸레버의 진동을 나노미터 단위로 얻습니다. 간헐적 접촉 곡선에서 자유 진동 곡선을 빼서 실제 교호작용 곡선을 구하고 캔틸레버 스프링 상수(이 경우 0.1N/m)를 사용하여 pN으로 변환합니다.

5. HS-AFM 이미징

1. 10mM 농도의 Mg(CH₃COO)₂ 용액을 준비합니다. 해밀턴 주사기를 사용하여 준비된 10mM Mg(CH₃COO)₂ 용액 50μL를 캔틸레버 홀더의 유체 채널에 주입하여 캔틸레버를 둘러싸는 액체 방울을 만듭니다.
2. Z 컨트롤러 VI에서 시작을 클릭하여 캔틸레버를 표면에 서서히 접근합니다. 표면이 감지되면 피드백을 켜고 ORT Force Curves VI에서 상호 작용 곡선의 피크를 찾습니다. 적절한 추적이 가능한 가장 낮은 힘 설정값을 찾습니다(깨지기 쉬운 바이오 샘플의 손상을 방지하기 위해 300pN 미만).
3. Scan VI의 Scan Size 를 800 nm x 800 nm로 설정하고 Line Rate 를 100 Hz로 설정합니다. Scan VI에서 프레임 (아래쪽) 화살표를 클릭하여 표면을 스캔하여 표면 품질을 확인합니다. 오염이 감지되면 계속하기 전에 표면, 캔틸레버 및/또는 캔틸레버 홀더를 청소하여 문제를 해결하십시오.
4. 스캔 후 Z 컨트롤러 VI에서 Withdraw 를 클릭하여 표면에서 캔틸레버를 집어넣습니다. 데드 볼륨 문제를 방지하기 위해 Hamilton 주사기로 캔틸레버 홀더의 구멍에서 완충 용액을 제거합니다.
5. 프로토콜의 part 1에서 희석된 DNA 3PS 용액을 준비합니다. 희석된 DNA 3PS 용액 50μL를 캔틸레버 홀더의 전용 채널에 주입합니다.
6. 5.2-5.3단계를 반복하여 기본 라인 속도 100Hz(256라인 × 256픽셀)로 800nm x 800nm 영역을 스캔하여 이미징 프로세스를 시작합니다. 초기 스캔 후 추가 데이터 수집을 위해 Scan VI의 이미징 크기와 속도를 지정된 값으로 조정합니다.
7. 달리 명시되지 않는 한 샘플 손상/방해를 최소화하기 위해 이미징 프로세스 전반에 걸쳐 Z Controller VI Setpoint 상자에 있는 팁-샘플 상호 작용의 입력 힘 설정점을 적절한 추적에 필요한 가장 낮은 수준(300pN 미만)으로 유지하십시오. 필요한 모든 샘플 영역에 대해 이 프로세스를 반복합니다.

6. 이미지 처리

1. 사용자 정의된 Pygwy (Python for Gwyddion) 일괄 처리 코드를 실행하기 위한 환경을 설정하여 Python 및 필요한 모든 라이브러리를 확인합니다. 자세한 내용은 Gwyddion의 웹 사이트³² 시스템에 올바르게 설치되어 있습니다. 이렇게 하면 코드가 원활하게 실행되고 필요한 기능에 액세스할 수 있습니다.
2. 사용자 지정된 Pygwy 일괄 처리 코드(요청 시 제공됨)를 엽니다. 이를 통해 이미지 처리 및 분석에 필요한 도구와 기능에 액세스할 수 있습니다.
3. 이미지에 대해 수평 중앙값 선 보정을 수행하여 이미지 처리를 시작합니다. 이 단계는 스캔 라인에 존재하는 불규칙성이나 아티팩트를 제거하여 후속 처리 단계가 정확한 데이터를 기반으로 하도록 하는 것을 목표로 합니다. 평면 배경을 제거한 후 선 보정을 적용합니다. 흉터 제거를 사용하면 외부 요인으로 인한 원치 않는 표시나 결함을 제거하여 이미지를 더욱 향상시킬 수 있습니다. 이 단계는 이미지의 전체적인 시각적 모양을 개선합니다.
4. 색상 높이 맵을 조정하여 이미지의 가시성과 대비를 향상시킵니다. 이렇게 하면 관심 있는 기능이 명확하게 시각화되고 이미지에서 눈에 띄게 됩니다.
5. 비디오로 결합해야 하는 처리된 이미지를 선택합니다. 비디오에 대해 원하는 프레임 속도를 결정합니다. 이 경우 초당 7프레임(fps)으로 설정합니다.
6. 각 프레임의 지속 시간을 계산합니다. 피지(ImageJ)를 사용하여 처리된 이미지를 비디오로 결합합니다. 프레임 속도와 프레임 지속 시간이 올바르게 설정되었는지 확인합니다.

결과

이 조사에서 DNA 3점-별 모티프가 안정된 섬으로 동적으로 조립되는 과정을 HS-PORT AFM의 기능을 활용하여 성공적으로 관찰되었습니다. 이 기술을 통해 이러한 구조물의 조립을 실시간으로 캡처할 수 있었습니다. 그림 2A,B에서는 100kHz PORT 속도(800nm x 800nm 스캔 크기)에 대해 각각 100Hz 및 200Hz 라인 속도로 선명한 이미지 스캔을 얻을 수 있습니다.

토론

섬세한 생물학적 샘플을 이미징할 때 AFM의 오프레조넌스 태핑 이미징 모드는 팁-샘플 상호 작용력⁽¹⁰)을 직접 제어할 수 있기 때문에 특히 유용합니다. 그 중 PORT 모드는 도달할 수 있는 더 높은 발진율로 인해 더 높은 스캔 속도를 가능하게 하기 때문에 두드러집니다. PORT는 레이저로만 캔틸레버를 직접 작동시키기 때문에 특히 공진 주파수가 높은 초단 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
AC10DS	Olympus	BL-AC10FS-A2	Discontinued
Biometra Compact XS/S	Biometra GmbH	846-025-199	Electrophoresis  unit
Biometra TRIO	Biometra GmbH	207072X	thermocycler for annealing
Custom AFM setup	Laboratory for Bio-Nano Instrumentation, Interfaculty Bioengineering Institute, School of Engineering, Ecole Polytechnique Fédérale Lausanne		Obtainable through Laboratory for Bio-Nano Instrumentation
EDTA	ITW Reagents	A5097	In annealing buffer
Laser Power Meter	Thorlabs	PM100D	Digital Handheld Optical Power and Energy Meter Console
Lively 3AP Power Supply, MP-310	Major Science	MP-310	Electrophoresis Power Supply
MgAc2	ABCR GmbH	AB544692	In annealing buffer
TBE	Thermo Scientific	327330010	Running buffer for electrophoresis
TRIS	Bio-Rad	1610719	In annealing buffer