자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용한 수지상 척추 정량화

요약

수지상 가시는 대부분의 흥분성 시냅스의 시냅스 후 구획입니다. 수지상 척추 형태의 변화는 신경 발달, 노화, 학습 및 많은 신경 및 정신 장애 중에 발생하며, 이는 신뢰할 수 있는 수지상 척추 분석의 중요성을 강조합니다. 이 프로토콜은 자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어를 사용하여 수상돌기 척추 형태를 정확하고 재현성 있게 정량화하는 방법을 설명합니다.

초록

시냅스 연결은 뉴런 간의 정보 교환 및 처리를 가능하게 합니다. 흥분성 시냅스의 시냅스 후 부위는 종종 수지상 가시에 형성됩니다. 수지상 가시는 시냅스 가소성, 신경 발달, 신경 및 정신 질환을 중심으로 한 연구에서 큰 관심을 받는 구조입니다. 수지상 가시는 수명 동안 구조적 변형을 겪으며, 총 척추 수, 수상돌기 척추 크기 및 형태학적으로 정의된 하위 유형과 같은 속성이 다양한 과정에 따라 변경됩니다. 수지상 가시의 이러한 구조적 변화를 조절하는 분자 메커니즘을 설명하는 것은 형태학적 측정에 의존합니다. 이를 위해서는 실험적 증거를 제공하기 위해 정확하고 재현 가능한 수지상 척추 분석이 필요합니다. 본 연구는 Neurolucida 360(자동 3차원 뉴런 재구성 소프트웨어)을 사용하여 수지상 척추 정량화 및 분류를 위한 자세한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하면 총 척추 밀도, 척추 머리 부피 및 척추 아형으로의 분류와 같은 주요 수지상 척추 특성을 결정할 수 있으므로 수지상 척추 구조 표현형을 효과적으로 분석할 수 있습니다.

서문

수지상 가시는 종종 glutamatergic synapses ^1,2의 시냅스 후 부위를 구성하는 수상돌기의 돌출부입니다. 수지상 가시는 시냅스 가소성 분야에서 특히 관심이 있습니다. 척추는 시냅스 강도가 변할 때 종종 변형되어 장기적인 시냅스 강화에서 커지고 강해지거나 장기적인 시냅스 함몰에서 더 작고 약해진다 3,4,5,6,7. 시냅스 가소성(synaptic plasticity)을 넘어서, 수상돌기 가시의 프로필은 일생에 걸쳐 변화합니다. 초기 발달에는 수지상 척추 형성 및 성장의 기간이 있으며, 그 후 정상 상태에 도달 할 때까지 수지상 척추 가지 치기가 뒤따릅니다 ^8,9,10. 노화된 뇌에서 척추 손실은 뇌 수축과 인지 기능 저하를 동반한다¹¹. 또한 많은 신경학적, 신경퇴행성 및 정신 질환은 비정상적인 수지상 가시가 특징입니다. 정신분열증을 앓고 있는 개인의 여러 뇌 영역은 수상돌기 가시가 더 적은데, 이는 시냅스 가지치기의 변화로 인한 것으로 보인다¹². 자폐 스펙트럼 장애는 수상돌기 척추 병리(dendritic spine pathology)에 의해서도 특징지어진다¹³. 수지상 척추 손실은 알츠하이머병과 파킨슨병의 특징입니다^14,15. 수지상 척추 특성에 대한 연구를 포괄하는 광범위한 연구 주제를 감안할 때 정확한 척추 정량화를 위한 기술이 가장 중요합니다.

염색, 즉 골지법(Golgi method) 또는 염료 충전을 통한 뉴런 라벨링 또는 형광 단백질 발현은 수지상 척추 시각화를 위한 일반적인 방법이다 16,17,18. 시각화가 완료되면 다양한 무료 및 상용 소프트웨어 클라이언트를 사용하여 스파인을 분석할 수 있습니다. 원하는 분석 결과는 어떤 소프트웨어가 가장 많이 사용될지 결정하는 데 중요한 요소입니다. Fiji는 수지상 척추 밀도에 중점을 둔 질문에 대한 실행 가능한 소프트웨어 옵션입니다. 그러나 이 기술은 편향 가능성을 도입할 수 있는 시간 소모적인 수동 계산에 크게 의존합니다. SpineJ와 같은 새로운 플러그인은 자동 정량화를 허용하며 또한 보다 정확한 척추경부 분석을 허용합니다¹⁹. 이러한 접근 방식의 단점은 SpineJ가 2차원 이미지 스택으로 제한되기 때문에 척추 부피를 결정하기 위한 3차원 분석이 손실된다는 것입니다. 또한 이러한 프로세스를 통해 척추 하위 유형 정보를 얻는 것이 어려워집니다. 4가지 주요 척추 아형인 thin, mushroom, stubby, filopodia는 모두 개별 기능을 내포하며 크게 형태학(morphology)²⁰을 통해 분류된다. 얇은 가시는 길쭉한 목과 뚜렷한 머리가 특징이다²¹. 버섯 가시는 훨씬 크고 뚜렷한 가시 머리를 가지고^{있다 22}. 뭉툭한 가시는 짧고 머리와 목 사이에 거의 차이가 없다²³. Filopodia는 길고 얇은 목과 명확하게 관찰 할 수있는 머리가 없는 미성숙한 가시입니다²⁴. 분류는 가치 있는 정보를 제공하지만, 척추는 차원의 연속체에 존재합니다. 범주로의 분류는 형태학적 측정 범위(^25,26)를 기반으로 한다. 분류를 위해 척추를 수동으로 측정하는 것은 이 접근 방식을 사용하는 연구원의 물류 부담을 가중시킵니다.

특히 3차원 수지상 척추 분석에 초점을 맞춘 다른 소프트웨어 옵션은 척추 부피 및 하위 유형 특성(27,28,29,30,31)에 대한 조사에 더 적합합니다. 낮은 z-plane 해상도 및 번짐과 같은 3차원 분석의 어려움에도 불구하고 이러한 소프트웨어 옵션을 사용하면 사용자 안내 반자동 방식으로 수상돌기 및 수상돌기 가시를 안정적으로 3차원으로 재구성할 수 있습니다. 식별된 척추를 하위 유형으로 자동 분류하는 것도 이러한 척추 분석 소프트웨어 패키지 중 일부에 있는 기능입니다. 이는 잠재적인 작업량과 실험적 편향에 대한 우려를 개선할 수 있습니다. Neurolucida 360은 신뢰할 수 있고 재현 가능한 3차원 수지상 척추 식별 및 분류를 가능하게 하는 상업적으로 이용 가능한 소프트웨어 중 하나이다³². 여기에서는 이 소프트웨어를 사용하여 고정 조직을 효과적으로 준비하고, 이미지를 획득하고, 궁극적으로 수지상 가시를 정량화하고 분류할 수 있는 포괄적인 프로토콜을 제시합니다.

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프로토콜

모든 동물 시술은 미국 국립보건원(National Institutes of Health) 지침, 교내 연구에서 동물을 사용하는 지침을 따랐으며 미국 국립정신건강연구소(National Institute of Mental Health) 동물 관리 및 사용 위원회(National Institute of Mental Health Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

1. 고정 된 해마 절편의 준비

1. 케타민/자일라진(케타민: 100mg/kg; 자일라진: 8mg/kg). tail pinch를 통해 마취를 확인하고 마우스를 관류판에 부착합니다.
2. 큰 수술용 가위를 사용하여 가슴에서 피부와 털을 제거하여 밑에 있는 흉곽을 더 쉽게 시각화할 수 있습니다.
3. 간과 횡격막을 피하여 흉곽 너비 아래로 수평으로 절단합니다. 가는 집게를 사용하여 xiphoid 돌기를 위로 당기고 흉곽의 각 측면을 자릅니다. 흉곽을 목 부분까지 뒤집고 지혈 겸자를 사용하여 제자리에 고정합니다.
4. 21G의 나비 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고 약 5mL/분에서 실온 1x PBS로 관류를 시작합니다. 작은 수술 용 가위로 오른쪽 심방을 작게하십시오. 아트리움을 떠나는 용액이 맑아질 때까지 PBS로 관류합니다.
5. 관류 펌프를 꺼서 튜브에 기포가 들어가지 않도록 합니다. PBS의 튜브를 PBS의 얼음처럼 차가운 4% 파라포름알데히드(PFA)에 넣습니다. 동물이 완전히 굳어질 때까지 약 25mL의 속도로 PFA를 관류합니다.
   알림: 최적의 고정을 위해 PFA가 신선한지 확인하십시오(재고가 1°C에서 보관된 경우 4주일 이내).
6. 작은 수술용 가위로 두개골 표면의 피부를 제거합니다. 두개골의 중앙 균열을 따라 작은 수술용 가위로 중간 시상을 자릅니다. 후각구와 소뇌 위로 측면 절개를 합니다.
7. 미세한 집게로 두개골을 열어 뇌를 노출시킵니다. 주걱을 사용하여 후각구에서 뇌를 부드럽게 퍼내고 밤새 PBS에 4% PFA를 넣습니다.
   참고: 설치류 관류에 대한 보다 포괄적인 프로토콜은 Gage et ^al.33을 참조하십시오.
8. PBS에서 1일 동안 4% PFA를 15% 자당으로 대체하여 고정 뇌를 냉동 보호합니다. 그 후, 뇌가 용액에 가라 앉을 때까지 1 일 동안 PBS 용액의 15 % 자당을 30 % 자당으로 교체하십시오.
9. 자당 용액에서 뇌를 제거하고 PBS가 있는 페트리 접시에 넣습니다. 메스 칼날을 사용하여 소뇌와 후각구를 잘라냅니다.
10. 직경 1-2cm의 소량의 최적 절삭 온도 화합물(OCT)을 시편 홀더 표면에 놓습니다. OCT의 꼬리 절단면이 있는 표본 홀더에 뇌를 관상적으로 장착합니다. 표본 홀더를 분쇄된 드라이아이스에 넣어 뇌를 눈에 띄게 얼릴 때까지 약 5-7분 동안 빠르게 얼립니다.
11. 저온 유지 장치의 블레이드 각도가 0°에서 5° 사이로 설정되어 균일한 단면을 생성하는지 확인하십시오. 최적의 슬라이스 평탄화를 위해 롤 플레이트 각도를 조정합니다. 구체적인 지침은 장비 설명서를 참조하십시오.
12. 검체 홀더를 블레이드에 가장 가까운 뇌의 복부 표면이 있는 냉동 장치에 놓습니다. 뇌를 30μm 등쪽 해마 절편으로 자르고 해마 앞쪽에 있는 모든 조각을 버립니다.
    참고: 프로토콜의 이 부분은 원하는 뇌 영역에 맞게 조정할 수 있습니다. 1.9-1.12단계는 관심 지역에 따라 변경됩니다.
13. 등쪽 해마 절편을 PBS로 옮깁니다. 붓을 사용하여 해마 부분을 현미경 슬라이드에 부드럽게 장착합니다. 면봉이나 섬세한 작업용 물티슈로 과도한 용액을 제거하십시오.
14. 100 μL의 하드 세트 장착 매체를 모든 뇌 절편을 덮고 있는 현미경 슬라이드에 적용합니다. 기포를 방지하려면 집게를 사용하여 장착 매체에 커버슬립을 천천히 내립니다. 거품이 생기면 집게로 커버슬립을 가볍게 두드려 거품이 빠져나갈 수 있도록 합니다. 이미징하기 전에 슬라이드를 하룻밤 동안 굳히십시오.

2. 고해상도 컨포칼 이미징

1. 저배율 접안렌즈를 사용하여 형광 세포를 식별합니다. 63x(NA = 1.4) 이상의 대물렌즈로 전환하여 대물렌즈에 적절한 이멀젼 매체를 적용합니다.
   참고: 최상의 결과를 얻으려면 63x 이상의 대물렌즈를 가진 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하십시오.
2. 이미지 획득을 위해 겹침이 제한된 잘 표지된 수지상 세그먼트를 식별합니다. 레이저 출력과 게인을 설정하여 형광 수상돌기가 포화되지 않도록 합니다. 또한 스캔 속도를 줄이면 더 나은 이미지 해상도를 제공할 수 있습니다.
3. 향후 분석을 위해 전체 수지상 세그먼트를 포괄하는 z-stack을 획득합니다. 10μm보다 큰 Z-스택은 z-평면에서 수지상 중첩이 발생할 가능성이 추가되기 때문에 바람직하지 않습니다.
   알림: 사용 가능한 가장 작은 z-step 크기(0.2-0.7μm)와 1개의 통풍이 잘되는 장치 핀홀 크기를 활용하십시오. 스텝 크기가 작을수록 z 스택에 더 많은 이미지가 생성되어 많은 현미경의 제한된 Z 해상도를 보상합니다.
4. 선택 사항: 사용 가능한 경우 현미경의 해당 디콘볼루션 소프트웨어 기능을 활용하여 이미지를 디콘볼루션합니다. 이렇게 하면 더 높은 해상도의 이미지를 얻을 수 있습니다.

3. 수지상 척추 정량화

1. Neurolucida 360(v2022.1.1 이상)을 엽니다. 척추 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다 (파일 > > 이미지 열기). 이미지 파일이 기본 창과 3D 환경에서 보이는지 확인합니다. 3D 환경 창이 나타나지 않으면 Trace 탭의 기본 창 상단 도구 모음에서 3D Environment를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다(보충 그림 1).
   참고: 프로토콜의 이 섹션은 마우스 조직의 수상돌기뿐만 아니라 모든 수지상 이미지에 적용할 수 있습니다.
2. 3D 환경 창의 [이미지 표시 변경] 탭에서 [이미지 표시 형식] 상자에 이미지가 3D 볼륨으로 표시되어 있는지 확인합니다. 이미지(Image) 탭의 이미지 스택 설정(Image Stack Settings) 상자에 있는 표면 표시 형식(Show Surface As) 드롭다운 메뉴에서 최대 투영(Max Projection)을 선택합니다. (보충 그림 2)
3. 추적에 적합한 수지상 세그먼트를 식별합니다.
   1. 3D 환경 창의 상단 도구 모음에서 피벗 포인트 이동 도구를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 원하는 덴드라이트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 새 피벗점을 설정합니다. 이렇게 하면 효과적으로 확대할 수 있도록 방향이 변경됩니다.
   2. Reset Orientation 아이콘을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 원래 방향을 다시 설정합니다. 피벗 포인트를 설정한 후 Move Pivot Point 도구를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 수상돌기 추적을 시작합니다. (보충 그림 2).
      참고 : 이상적인 수상돌기는 좌표 평면의 다른 수상돌기와 겹치는 부분이 제한되어 있고 다른 수상돌기와 교차하지 않거나 아래의 다른 수상돌기에 표면적이지 않은 수상돌기입니다. XY 평면에서 다른 수상돌기에 대한 근접성이 낮은 수상돌기는 추적된 수상돌기에 인접한 척추를 부적절하게 할당하는 것을 방지하기 위해 바람직합니다. 또한 소마로부터의 두께, 순서 및 거리가 다른 수상돌기는 다른 수지상 척추 밀도를 갖는다는 점에 유의해야 한다(^34,35). 이는 실험 설계에서 고려되어야 합니다. 두께가 1.5μm< 2차 수상돌기는 추적에 이상적인 후보입니다(그림 1).
4. 3D 환경 창의 트리 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 추적 모드에 대해 User-Guiduration을 클릭하고 User-Guided Tracing Options의 방법으로 Directional Kernels를 클릭합니다.
5. 원형 커널이 나타날 때 수상돌기를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 추적을 시작합니다. 수지상 세그먼트를 따라 커서를 이동합니다. 이렇게 하면 커널이 자동으로 채워집니다. 커널이 자동으로 채워지지 않는 경우 3.51단계를 참조하십시오.
   1. 커널이 채워질 때까지 덴드라이트에서 커서를 앞뒤로 부드럽게 움직입니다. 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 기존에 감지된 커널을 보존합니다. 커널이 더 이상 채워지지 않으면 커널이 수상돌기 아래로 더 채워질 때 마우스 왼쪽 버튼을 클릭하여 수동으로 배치합니다. 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하여 추적을 종료합니다. 추적된 수상돌기의 길이가 최소 7μm인지 확인합니다(보충 그림 3).
6. 3D 환경 창을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 드래그하여 3D 환경, 피치, 요, 롤의 세 방향을 모두 사용하여 수상돌기 추적의 정확성을 확인합니다. 수상돌기 추적이 수상돌기의 적절한 위치 밖에 있는 점을 식별합니다. 위에서 아래로 정확하게 추적되는 것처럼 보이지만 z 차원에서는 점이 수상돌기에 있지 않은 경우가 있을 수 있습니다(그림 2).
7. 부적절하게 추적된 수지상 세그먼트를 수정하려면 Tree 메뉴에서 Edit 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 관심 있는 덴드라이트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭한 다음 Points를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
8. 잘못 배치된 점을 클릭하고 드래그하여 덴드라이트 세그먼트로 다시 이동합니다. 점을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 Delete 버튼을 클릭하여 관련 없는 점을 삭제합니다. 수상돌기가 적절하게 채워지지 않은 경우 점의 크기를 변경합니다. 점의 크기를 변경하려면 점을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 두께 슬라이더를 조정하여 크기를 변경합니다(보충 그림 4).
   참고: 부적절하게 채워진 수상돌기는 수지상 세그먼트의 구성 요소인 잘못된 척추를 식별하는 결과를 초래할 수 있습니다. 반대로, 수상돌기를 과도하게 채우면 실제 가시를 가릴 수 있습니다.
9. 3.10단계에서 척추 식별을 진행하기 전에 이미지의 여러 수상돌기에 대해 3.3-3.8단계를 반복합니다.
10. 3D 환경 창에서 Spine 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 외부 범위, 최소 높이 및 최소 복셀 수에 대한 감지 설정을 지정합니다. 준비에 따라 변경에 대한 명확하고 구체적인 근거가 있는 경우 사전 설정된 값을 변경해야 할 수도 있습니다. 사전 설정 조건은 외부 범위: 2.5μm, 최소 높이: 0.3μm, 최소 복셀 수: 10복셀입니다.
    참고: 세포 배양 대 급성 조직과 같은 다양한 제제와 다양한 발달 시점에는 기존 문헌에서 파생되어야 하는 다른 기준이 필요합니다. 감지 설정을 변경하면 결과가 크게 변경될 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 예를 들어, 최소 높이가 높을수록 짧은 스파인을 제외할 수 있습니다. 검출 설정은 실험의 전체 과정에서 일관되게 유지되어야 합니다.
11. Detector Sensitivity(감지기 감도)를 70%로 설정하고 Detect All(모두 감지)을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 이것은 모든 수상돌기에서 이 검출기 민감도로 식별된 척추를 채울 것입니다. 수상돌기 특정 방식으로 스파인을 선택하려는 경우 가장 가까운 분기에서 모두 감지하려면 이미지 클릭 상자를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 다른 검출기 감도를 가진 각 덴드라이트를 수동으로 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
    참고: 이 단계에서는 모든 수지상 가시가 채워지지 않는 것이 정상입니다. 마찬가지로, 비가시가 부적절하게 채워질 수 있습니다. 초기 70% 감도도 유연합니다. 이것은 준비에 따라 변경 될 수 있습니다.
12. 이 검출기 민감도에 의해 선택된 척추를 세 방향 모두에서 수상돌기를 클릭하고 드래그하여 검사합니다. 감지된 스파인의 대부분이 완전히 채워지지 않은 경우 3.12.1단계로 진행합니다. 감지된 스파인이 과도하게 채워진 경우 3.12.2단계로 진행합니다. 감지된 스파인이 적절하게 채워진 것으로 나타나면 3.13단계로 진행합니다.
    1. 감지기 감도를 5%-10% 높이고 Detect All을 다시 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 이렇게 하면 이전에 감지된 모든 척추가 더 높은 감도의 새 척추로 교체됩니다. 감지된 가시가 적절하게 채워질 때까지 필요에 따라 반복합니다.
    2. 감지기 감도를 5%-10% 낮추고 모두 감지를 다시 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 이렇게 하면 이전에 감지된 모든 척추가 더 낮은 감도의 새 척추로 교체됩니다. 감지된 가시가 적절하게 채워질 때까지 필요에 따라 반복합니다.
13. 3D 환경의 Spine 탭에서 Keep Existing Spines를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 가장 가까운 분기에서 모두 감지하려면 이미지 클릭을 선택한 경우 선택을 취소합니다.
    참고: Keep Existing Spines(기존 스파인 유지 )를 선택하면 새로 식별된 수지상 스파인이 수동으로 이전에 식별된 스파인을 덮어쓰지 않도록 합니다. 이전 작업을 덮어쓰지 않도록 계속하기 전에 이 상자가 선택되어 있는지 확인하십시오.
14. Move Pivot Point 를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 피벗 포인트를 설정하기 위해 추가 척추 감지가 필요한 덴드라이트를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
    1. 피벗 포인트 이동을 선택 취소합니다. 채워지지 않은 수지상 척추를 식별합니다. 감지기 감도를 이전 감지보다 10%-20% 높이고 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 감지된 스파인이 부족하거나 과도하게 채워진 경우 3.14.3 또는 3.14.4단계로 진행합니다. 스파인이 채워지지 않으면 Unable to detect a spine at the selected location(선택한 위치에서 스파인을 감지할 수 없음) 메시지가 나타납니다. 이 경우 3.14.2단계로 진행합니다.
    2. 척추가 감지되고 적절하게 채워질 때까지 감지기 감도 를 100% 이상으로 점진적으로 높입니다. 스파인이 감지되었지만 부적절하게 채워진 경우 3.14.3단계로 진행합니다. 스파인이 과도하게 채워진 경우 3.14.4단계로 진행합니다(그림 3).
    3. Edit(편집) 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 언더filled spine을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 마우스 왼쪽 버튼 클릭 제거. 편집 탭을 선택 취소합니다. 감도를 5%-10% 높이고 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 척추가 여전히 충분히 채워지지 않은 경우 이 단계를 반복합니다.
    4. Edit(편집) 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 과도하게 채워진 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 마우스 왼쪽 버튼 클릭 제거. 편집 탭을 선택 취소합니다. 감도를 5%-10% 낮추고 척추를 클릭합니다. 척추가 여전히 과도하게 채워진 경우 이 단계를 반복합니다.
15. 시각적 식별로 식별된 모든 척추가 감지될 때까지 3.14-3.14.4단계를 반복합니다. 인접 수상돌기에 속하는 척추, 참 신호가 없는 거짓 척추 또는 척추로 잘못 레이블이 지정된 수상돌기의 잠재적 세그먼트가 있는지 수상돌기를 다시 확인하십시오. Remove 함수를 사용하여 이러한 잘못된 척추를 삭제하십시오.
16. 수상돌기에서 식별된 가시를 검사합니다. 경우에 따라 여러 개의 척추가 하나의 대기업 척추로 나타날 수 있습니다. 스파인이 두 개를 둘러싸고 있는 것처럼 보이면 Edit 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 척추를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 Hide Selection을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. 대기업 스파인을 확인한 후 Edit(편집 ) 탭에서 Show Selection(선택 항목 표시 )을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하고 Split(분할)을 선택합니다. 한 대기업에 두 개 이상의 척추가 있는 경우 이 단계를 반복해야 할 수 있습니다(그림 4).
    참고: 3.16단계 후에도 역모 척추가 분리되지 않으면 척추를 제거합니다. 그런 다음 더 낮은 감도에서 대기업의 더 강렬한 척추를 선택하십시오. 더 강렬한 척추가 채워지면 민감도를 높여 채워지지 않은 다른 척추를 선택합니다. 또는 역모 척추를 삭제한 다음 민감도를 높이면 적절한 분할이 가능할 수 있습니다.
17. 시각적으로 식별할 수 있는 모든 가시가 감지되고 적절하게 채워지면 Spine 탭에서 Classify All 을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 척추를 thin, mushroom, stubby 및 filopodia의 네 가지 하위 유형으로 분류합니다(그림 5).
    참고: Spine 분류 매개변수는 Spine 탭의 Classification(분류) 상자에 있는 Settings(설정) 창에서 변경할 수 있습니다. 감지기 설정과 마찬가지로 기존 매개변수를 변경하기 위한 명확한 근거가 강력히 권장됩니다. 사전 설정 값은 머리와 목의 비율: 1.1, 길이와 머리 비율: 2.5, 버섯 머리 크기: 0.35μm, 필로포디움 길이: 3μm입니다.
18. 3D 환경 창의 상단 도구 모음에서 Neurolucida Explorer에서 저장 및 보기를 선택합니다. Neurolucida Explorer는 추적에서 데이터를 수집하는 곳입니다. 작업은 모든 추적 및 스파인을 포함하는 .dat 파일로 저장됩니다.
19. 탐색기 창의 View 탭에서 Select All 을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭하여 모든 수상돌기와 척추를 강조 표시합니다.
20. 위쪽 도구 모음에서 Analyze 탭을 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. Structure(구조 ) 드롭다운 메뉴를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다. Branched Structure Analysis를 마우스 왼쪽 버튼으로 클릭합니다.
21. 관심 있는 변수에 따라 모든 분석을 선택할 수 있습니다. 척추 밀도와 평균 척추 부피를 중심으로 한 질문에 가장 유용한 두 가지는 각 나무> 각 수상돌기와 척추 세부 정보를 > 척추입니다. 확인을 선택하면 데이터가 두 개의 별도 창에 나타납니다.
22. 추가 편집 및 분석을 위해 데이터를 스프레드시트에 복사합니다.
    알림: 개별 나무는 수상돌기로 분리되지만 척추 부피는 그렇지 않습니다. 스프레드시트의 정렬 기능을 사용하여 척추 세부 정보를 피처별로 필터링할 수 있습니다.

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결과

이 분석 방법을 효과적으로 활용하는 것은 추적을 위한 수지상 세그먼트를 선택하는 것으로 시작됩니다. 그림 1에서 설명한 바와 같이, 추적을 위한 이상적인 수상돌기는 다른 수상돌기에 근접하지 않습니다. 병렬로 실행되는 수상돌기는 인접한 수상돌기에서 척추를 부적절하게 식별하는 결과를 초래할 수 있습니다. 다른 z 평면에서 직접 교차하거...

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토론

이 프로토콜은 3차원 재구성 소프트웨어를 사용하여 시료 준비, 이미징, 수상돌기 척추 정량화 및 분류 과정의 특정 단계를 자세히 설명합니다. 이 소프트웨어는 다양한 조사에 기여하는 강력한 구조 데이터를 생성할 수 있는 강력한 도구입니다. 프로세스 전반에 걸쳐 이 프로토콜의 방법론적 부담을 줄이고 데이터의 전체 출력을 향상시키는 몇 가지 중요한 단계가 있습?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
518F Immersion Oil	Zeiss	444960-0000-000
Cryostat	Leica	CM3050S	For slice preparation
Fine Forceps	FST	11150-10
Hemostat Forceps	FST	13020-12
Large Surgical Scissors	FST	14002-16
LSM 880 Confocal Microscope	Zeiss	LSM 880
Microscope Cover Glass	Fisherbrand	12-541-035
Mini-Peristaltic Pump II	Harvard Apparatus	70-2027	For perfusions
Neurolucida 360	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
Neurolucida Explorer	MBF Bioscience	v2022.1.1	Spine Analysis Software
OCT Compound	Sakura Finetek	4583	For cryostat sectioning
Paraformaldehyde (37%)	Fisherbrand	F79-1
Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC	Zeiss	440762-9904-000
Scalpel Blade	FST	10022-00
Small Surgical Scissors	FST	14060-09
Spatula	FST	10091-12
Sucrose	FIsherbrand	S5-500
Superfrost Plus Microslides	Diagger	ES4951+
Vectashield HardSet Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1400-10