로즈 벵골 매개 광역학 요법을 통한 칸디다 글라브레이트의 쁘띠 콜로니 유도

요약

Candida spp. 약물 내성에서 몸집이 작은 군집의 중요성은 완전히 탐구되지 않았습니다. 항균 광역학 요법(aPDT)은 약물 내성 진균 감염에 대한 유망한 전략을 제공합니다. 이 연구는 로즈 벵골 매개 aPDT가 칸디다 글라브라타(Candida glabrata) 를 효과적으로 비활성화하고 몸집이 작은 콜로니를 유도하여 독특한 절차를 제시한다는 것을 보여줍니다.

초록

칸디다혈증 환자의 사망률이 40%에 달하는 약물 내성 칸디다균과 그들의 작은 돌연변이는 여전히 주요 치료 과제로 남아 있습니다. 항균 광역학 요법(aPDT)은 항생제/항진균제와 달리 여러 진균 구조를 표적으로 하여 내성을 억제할 수 있습니다. 몸집이 작은 콜로니를 유도하는 전통적인 방법은 에티듐 브로마이드 또는 플루코나졸에 의존하는데, 이는 약물 감수성과 스트레스 반응에 영향을 미칠 수 있습니다. 이 연구는 약물 내성 칸디다 글라브라타 분리물(Candida glabrata isolate)과 싸우기 위해 녹색광(피크 520nm)과 로즈 벵골(RB) 광감작제의 적용을 조사했습니다. 그 결과, aPDT 치료는 세포 성장을 크게 억제하고(≥99.9% 감소) 몸집이 작은 콜로니 형성을 효과적으로 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 미토콘드리아 산화 환원 지시자 염색의 크기 감소와 손실로 입증되었습니다. 이 연구는 aPDT가 시험관 내에서 다제내성 C. glabrata 균주에서 몸집이 작은 콜로니를 유도할 수 있다는 초기 증거를 제공하여 내성 진균 감염과 싸우기 위한 잠재적으로 혁신적인 접근 방식을 제공합니다.

서문

진균 감염, 특히 칸디다 알비칸스(Candida albicans)와 점점 더 약물 내성이 강해지는 칸디다 글라브라타(Candida glabrata)에 의한 감염은 전 세계적으로 심각한 위협이 되고 있습니다¹. 이러한 감염은 특히 입원 환자와 면역 체계가 약한 환자에게 치명적일 수 있습니다. 항진균제 내성이 증가하면 특히 칸디다 알비칸스(Candida albicans)로 인한 사망률이 높은 중증 진균 감염인 침습성 칸디다증(invasive candidiasis)의 통제를 위협합니다 ². 내성 균주는 효과적인 치료를 방해하여 잠재적으로 복잡성과 사망률을 증가시킬 수 있습니다. 미국 캘리포니아주 알라메다 카운티에서는 C. glabrata가 가장 널리 퍼진 침입종이 되었다³. 칸디다 종의 유병률 및 분포에 대한 이러한 변화는 지역 의료 관행, 환자 인구 통계, 항진균제의 활용 및 칸디다 감염에 대한 위험 요인의 유병률에 의해 영향을 받을 수 있습니다.

기능적 미토콘드리아가 없는 칸디다의 몸집이 작은 돌연변이는 이 세포소기관이 약물 반응, 독성 및 스트레스 저항성에 어떻게 영향을 미치는지 보여줍니다 ^4,5. C. glabrata는 이러한 군체를 쉽게 형성하여 폴리엔에 대한 민감성을 얻는 동시에 아졸에 대한 민감성을 잃는다⁶. 아졸 민감성과 호흡 기능은 복잡하게 연결되어 있으며, 호흡 감소는 미토콘드리아 DNA 손실을 통해 저항성을 유발한다⁷. 아졸 저항성을 가진 C. glabrata의 몸집이 작은 집락은 플루코나^{졸 치료를 받는} 골수 이식 수혜자의 인간 대변 샘플에서 분리되었습니다8 및 혈류 감염 환자의 혈액 배양 병에서 분리되었습니다⁹. 약물 내성, 독성 및 스트레스 반응에 대한 잠재적 영향은 임상적 중요성을 강조합니다. 또한, 이들의 뚜렷한 특성은 미토콘드리아 생물학⁵의 근본적인 질문을 조사하는 데 유용한 도구가 된다. 몸집이 작은 돌연변이에 대한 연구가 계속됨에 따라 임상 및 기초 연구에서의 응용 분야가 확대될 것으로 보입니다.

이 연구는 광역학 요법(PDT)이 C. glabrata의 몸집이 작은 집락을 유도할 수 있음을 발견하여 C. glabrata 를 에티듐 브로마이드 또는 플루코나졸에 노출시키는 전통적인 기술을 넘어 방법의 범위를 확장할 수 있음을 발견했습니다.

프로토콜

1. C. glabrata의 배양

참고: 플루코나졸을 포함한 대부분의 항진균제에 내성이 있는 다제내성 C. glabrata (C2-1000907)가 실험에 사용됩니다. 실험 조건은 다른 균주 간에 변동이 존재할 수 있으므로 특정 균주에 맞게 조정해야 할 수 있습니다. 모든 실험은 일관성을 위해 25°C(자연 감염 모방)에서 자란 로그 단계 칸디다를 사용했습니다. C. glabrata의 균사 부족은 37 °C에서 균사를 형성하는 C. albicans에 비해 정량화를 단순화합니다¹⁰.

1. C. glabrata의 로그상 배양을 준비하려면 한천 플레이트에서 단일 콜로니를 선택하고 3mL의 멸균 효모 펩톤 덱스트로스(YPD) 배지가 있는 유리 시험관으로 옮깁니다(재료 표 참조). 25°C에서 14-16시간 동안 진탕하여 배양합니다(155rpm, 45° 각도로 배지로의 공기 투과율을 높임).
2. 배양 후 멸균 기술을 사용하여 신선한 YPD로 배양액을 0.1의 OD₆₀₀으로 희석합니다. 25°C에서 155rpm에서 진탕하여 6시간 동안 배양합니다. OD₆₀₀을 측정하여 C. glabrata의 로그 위상을 확인합니다. 1 × 10 7-1.5 × 10⁷ cells/mL에 해당하는 0.65-1.00을 목표로 합니다.

2. ethidium bromide, fluconazole 및 photodynamic therapy에 의한 몸집이 작은 콜로니 유도

1. 에티듐 브로마이드 쁘띠 콜로니 유도
   1. YPD를 사용하여 효모 현탁액을 0.1의 OD₆₀₀(5 × 10⁶세포/mL)으로 조정하여 최종 부피 3mL로 조정한 다음 30μL의 브롬화 에티듐 스톡(10mg/mL)을 첨가하여 최종 농도 100μg/mL를 만듭니다.
   2. 효모 현탁액을 25 °C, 155 rpm, 45 ° 각도에서 밤새 (16-18 시간) 배양합니다. 0.65(1 × 10⁷ cells/mL)의 OD₆₀₀으로 조정합니다. 웰당 20μL의 조정된 효모 현탁액을 180μL의 PBS에 추가하여 96웰 플레이트에서 10배 희석 시리즈를 수행합니다. 이것은 ^{10-1에서 10-5}에 이르는 6개의 희석액을 생성합니다.
   3. 4개의 희석 계수(예: 10⁰, 10¹, 10² 및 10³)와 YPD 한천 플레이트의 4개 사분면(삼중)에서 각각 플레이트 3방울(20μL)을 선택합니다.
   4. 플레이트를 37°C에서 밤새 배양합니다. 트리페닐테트라졸륨 클로라이드(TTC) 염색¹¹ 을 위해 이전에 선택한 희석액에서 5-80개의 콜로니가 있는 사분면을 선택합니다(3단계 참조). 48비트 풀 컬러 광학 스캐너를 사용하여 1200dpi로 플레이트를 스캔합니다.
2. Fluconazole 쁘띠 콜로니 유도
   참고: 이 과정을 신속하게 진행하려면 플루코나졸 유도 쁘띠 콜로니 형성을 위해 T3 세포(3회 RB-PDT 처리 후 얻은 정상 세포와 몸집이 작은 세포의 혼합물, 2.3단계 참조)를 사용하십시오. 이는 표준 치료법이 일반적으로 형성 속도를 늦추기 때문입니다.
   1. 단계 2.1.1에 설명된 대로 효모 세포 현탁액을 준비하고 조정합니다.
   2. 25 °C에서 하룻밤(16-18시간) 배양합니다. OD₆₀₀ 을 다시 0.1로 조정합니다.
   3. 조정된 현탁액 1mL를 멸균 5mL 튜브로 옮깁니다.
   4. 멸균 면봉(길이 15cm, 팁 0.9cm x 2.6cm, 재료 표 참조)을 효모 현탁액에 담그고 튜브 바닥과 접촉하도록 하고 비틀어 튜브 벽에서 과도한 액체를 제거합니다.
   5. Mueller-Hinton 한천을 사용하여 후드의 플레이트를 준비합니다( 재료 표 참조).
   6. 한천에 면봉을 앞뒤로 닦고 60° 두 번 회전한 다음 주변을 면봉으로 닦아 균일하게 덮습니다.
   7. 화염 위에서 집게를 1-2초 동안 살균하여 잠시 식힌 다음 빈 디스크를 집는 데 사용합니다.
   8. 마커를 사용하여 플레이트를 세 개의 동일한 섹터로 나눕니다. 각 섹터의 중앙에 하나의 빈 디스크를 놓습니다.
   9. 각 디스크(25μg/디스크)에 12.5μL 플루코나졸 스톡(2mg/mL, 재료 표 참조)을 추가하고 기포가 발생하지 않도록 철저히 혼합한 다음 37°C에서 20-24시간 동안 배양합니다.
   10. TTC 염색을 수행합니다(3단계 참조). 48비트 풀 컬러 광학 스캐너를 사용하여 1200dpi로 플레이트를 스캔합니다.
3. PDT 몸집이 작은 콜로니 유도
   참고: 다른 곰팡이는 PDT 후에 다른 수의 몸집이 작은 식민지를 생성할 수 있습니다. 일부 균주는 전혀 생성하지 않을 수 있습니다.
   1. aPDT 시스템을 준비합니다.
      참고: aPDT 시스템 장치의 설정 절차는 Hung et al¹²에서 보고한 방법을 따릅니다. 간단히 말해서, aPDT 시스템은 520nm에서 피크를 갖는 녹색 LED 어레이로 구성되며( 재료 표 참조), 96웰 플레이트의 각 웰과 잘 정렬되어 바닥에서 빛을 비춥니다.
   2. YPD 배지의 효모 세포 현탁액을 OD₆₀₀ 0.65(약 1 × 10⁷ cells/mL)로 조정합니다.
   3. 이스트 현탁액 1mL를 111μL의 2% 로즈 벵골(RB, 그림 1)( 재료 표 참조)과 혼합하여 최종 RB 농도를 0.2%로 만듭니다. 혼합물을 25°C에서 15분 동안 배양하고 155rpm에서 45° 각도로 회전시킵니다.
   4. 혼합물을 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮기고 16,100 x g 에서 2.5분 동안(실온에서) 원심분리합니다.
   5. 상층액을 버리고 후드 바닥에서 튜브를 5번 부드럽게 긁어 펠릿을 부유시킵니다.
   6. 1x PBS로 서스펜션을 4번 세척하여 모든 RB를 제거합니다. 각 세척 후에는 철저한 재현탁을 위해 짧은 볼텍싱 또는 피펫팅으로 펠릿을 재현탁시킵니다.
      1. 최종 세척 후 1000μL의 PBS를 추가합니다. 해결책은 밝은 분홍색입니다. 세척된 RB 로딩 효모 현탁액 200μL를 96웰 플레이트(삼중)의 3웰 각각으로 옮깁니다.
   7. 아래에서 녹색 빛을 비추는 LED 전구가 있는 광역학 조명 시스템에 96웰 플레이트를 배치합니다. 균일한 조명을 보장하고 간섭을 방지하기 위해 실내 조명을 끄십시오. LED 조명 시스템을 활성화하여 2분 동안 4.38J/cm² 의 PDT 선량을 전달합니다. 시스템이 웰과 올바르게 정렬되었는지 확인하십시오.
   8. 방사선 조사 후 효모 현탁액을 96웰 플레이트에 희석합니다. 180 μL PBS가 들어있는 웰에 20 μL의 효모 현탁액을 첨가하여 10배 희석을 생성합니다. 나머지 희석액에 대해 반복하여 ^10-1 에서 ^10-5 범위를 얻습니다.
   9. 효모 세포 농도 조정에 따라 4가지 희석 계수(예: ^10-2 에서 ^10-5)를 선택합니다.
   10. 각 희석 계수에 대해 YPD 한천 플레이트에서 사분면당 3방울(각 20μL)을 플레이트합니다.
   11. 효모 현탁액이 완전히 흡수된 후 한천 플레이트에서 약 10분 동안 뒤집어 37°C에서 밤새 배양합니다.
   12. T0를 PDT 치료가 없는 대조군 부모 C. glabrata 로 정의합니다. 위에서 설명한 대로 로그 성장 단계에서 T0 곰팡이를 준비하고 0.2% RB의 존재 하에 4.38J/^cm2 녹색 빛에 노출시킵니다. 이 PDT 상태는 3-3.5 log의 곰팡이 성장을 일관되게 억제합니다.
       1. 살아남은 곰팡이를 T1으로 표시하고 체외에서 로그 성장 단계로 확장 된 후 동일한 PDT 용량에 다시 노출시킵니다. 두 번째 PDT 이후에 살아남은 곰팡이는 T2 등으로 표시됩니다.
   13. 다음 날에는 콜로니 수가 5에서 80 사이인 사분면을 선택합니다. 각 사분면의 콜로니 수를 세고 다음 공식으로 역가를 계산합니다: 콜로니 형성 단위(CFU)/mL = 콜로니 수(삼중 콜로니의 평균) × 희석 계수 × 50.
   14. TTC 염색을 수행합니다(3단계 참조). 앞에서 설명한 대로 플레이트를 스캔합니다(2.2단계).

3. 미토콘드리아 기능 분석 (TCC 염색 검사)

알림: TTC는 산화 환원 지시자이자 전자 수용체입니다. 백색 화합물이 전자¹¹에 의해 파괴되면 빨간색으로 변합니다. 모든 세포가 한천 플레이트에서 배양 후 24시간 이내에 눈에 보이는 콜로니를 형성해야 하는 것은 아닙니다. 기능성 미토콘드리아가 있는 콜로니는 붉게 변하는 반면, 비기능성 미토콘드리아가 있는 콜로니는 흰색으로 유지됩니다. 이를 통해 서로 다른 미토콘드리아 기능을 가진 콜로니를 구별할 수 있습니다.

1. 처리 후에는 원하는 세포 밀도에 따라 YPD 한천 플레이트의 칸디다 현탁액을 희석하여 쉽게 시각화하고 염색할 수 있는 뚜렷한 콜로니를 얻습니다.
2. 37 °C에서 24 시간 성장 후 단일 세포에서 눈에 보이는 콜로니가 형성됩니다. 20% TTC 20μL를 각 콜로니의 중앙에 직접 피펫팅합니다.
3. 콜로니에 의한 TTC의 완전 흡수 후 약 10분 동안 37°C에서 30-40분 동안 배양합니다.

4. 정상 및 몸집이 작은 C. glabrata의 성장 역학

참고: C. glabrata C2-1000907 T0(PDT 처리 없이 임상적으로 분리), T3n(부모 세포와 유사한 평균 직경이 1.5 ± 0.8mm인 콜로니를 3회 연속 RB-PDT 전시 후 C. glabrata C2-1000907) 및 T3p(3회 연속 RB-PDT 후 C. glabrata C2-1000907의 몸집 콜로니).

1. YPD 배지의 효모 세포 현탁액을 3mL 튜브에서 0.1의 OD₆₀₀ (5 × 10⁶ cells/mL)으로 조정합니다.
2. 24시간 동안 다중 모드 마이크로플레이트 리더(재료 표 참조)를 사용하여 20분마다 정적 배양의 OD₆₀₀을 자동으로 측정합니다.

결과

데이터는 표준 오차가 ± 평균으로 표시되며 각 그룹에서 최소 3배의 독립적인 실험에서 얻어졌습니다. 콜로니 수, OD₆₀₀ 측정 및 TTC 염색 결과를 포함한 실험 데이터는 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 그래프로 작성되고 통계적으로 분석되었습니다( 재료 표 참조). 데이터를 분석하기 위해 일원 분산 분석 또는 t-검정 이 사용되었으며 p-값 <0.05가 유의한 것?...

토론

이 연구는 PDT가 칸디다에서 몸집이 작은 콜로니 형성을 유도하는 첫 번째 보고 방법으로 밝혀졌으며, 이는 에티듐 브로마이드 및 플루코나졸의 확립된 효과를 능가합니다. 이 새로운 관찰은 독성을 감소시킴으로써 곰팡이 박멸과 저항 메커니즘의 출현에 대한 의미를 밝히기 위해 추가 연구를 필요로합니다.

RB 매개 PDT는 C. glabrata의 성장을 효과적으로 억제하여 칸디다 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm filter	Merck, Taipei, Taiwan	Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube	Neptune, San Diego, USA	#3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)	Sigma-Aldrich, MO, USA	T8877
5 mL polypropylene round bottom tube	Corning, AZ, USA	352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap	Corning, AZ, USA	Falcon, #352235
96-well plate	Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan	#16196
Agar	BRS, Tainan, Taiwan	AG012
Blank disk	Advantec, Tokyo, Japan	49005040
Centrifuge	Eppendorf, UK	5415R
Ethidium bromide solution	Sigma-Aldrich, MO, USA	E1510
Fluconazole, 2 mg/mL	Pfizer, NY, USA	BC18790248
GraphPad Prism	GraphPad Software	Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip	Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan	5050	Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators	Yihder, Taipei, Taiwan	LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs	Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan	161357
Muller Hinton II agar	BD biosciences, California, USA	211438
Multimode microplate reader	Molecular Devices	SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer	Biochrom, London, UK	Ultrospec 10
Rose Bengal	Sigma-Aldrich, USA	330000	stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube	Sunmei, Tainan, Taiwan	AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium	HIMEDIA, India	M1363