폐포 점막 면역 반응을 연구하기 위한 면역 유능한 폐포-온-칩 모델

요약

Lung-on-chip 모델은 공기-액체 계면과 내피 세포 관류를 모방하여 폐 생리학 연구에 중요한 혈류 및 영양소 교환을 시뮬레이션함으로써 기존 2D 배양을 능가합니다. 이는 폐 연구의 관련성을 높여 호흡기 감염에 대한 이해와 치료를 촉진할 수 있는 역동적이고 생리학적으로 정확한 환경을 제공합니다.

초록

우리는 인간의 폐포 구조와 기능을 복제하도록 설계된 고급 면역 역량 있는 폐-온-칩 모델을 소개합니다. 이 혁신적인 모델은 인간 허파꽈리의 환경을 모방한 공기-액체 인터페이스를 지원하는 미세유체 관류 바이오칩을 사용합니다. 조직 공학은 내피 세포, 대식세포 및 상피 세포를 포함한 주요 세포 구성 요소를 통합하여 폐포의 대표 조직 모델을 만드는 데 사용됩니다. 이 모델은 바이러스, 박테리아 및 곰팡이를 포함한 다양한 병원체에 대한 점막 면역 반응에 대한 심층적인 검사를 용이하게 하여 폐 면역에 대한 이해를 증진합니다. 이 프로토콜의 주요 목표는 이 폐포-온-칩 모델을 감염 연구를 위한 강력한 체외 플랫폼으로 확립하기 위한 세부 정보를 제공하여 연구원이 폐 환경 내에서 병원체와 숙주의 면역 체계 간의 복잡한 상호 작용을 면밀히 관찰하고 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 이는 혈류 및 내피 세포의 생체 역학적 자극을 포함한 인간 폐포의 주요 생리학적 상태를 시뮬레이션하기 위한 미세유체 기반 기술의 적용을 통해 달성되며, 상피 세포가 공기에 사실적으로 노출되는 데 중요한 공기-액체 인터페이스를 유지함으로써 달성됩니다. 이 모델 시스템은 면역형광 염색, 사이토카인 프로파일링, 콜로니 형성 단위(CFU)/플라크 분석과 같은 다양한 표준화된 분석법과 호환되므로 감염 중 면역 역학에 대한 포괄적인 통찰력을 얻을 수 있습니다. 폐포-온-칩은 다공성 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET) 막으로 분리된 인간 원위 폐 상피 세포(H441) 및 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 포함한 필수 세포 유형으로 구성되며, 상피층과 내피층 사이에 1차 단핵구 유래 대식세포가 전략적으로 배치되어 있습니다. 조직 모델은 체외에서 폐 면역 반응과 관련된 미묘한 요인을 해부하고 분석하는 능력을 향상시킵니다. 가치 있는 도구로서 폐 연구의 발전에 기여해야 하며, 호흡기 감염의 발병 기전을 연구하고 잠재적인 치료 개입을 테스트하기 위한 보다 정확하고 역동적인 체외 모델을 제공해야 합니다.

서문

인간의 폐는 폐포 점막의 면역 반응 사이의 복잡한 상호 작용과 함께 호흡과 면역 방어에 놀라운 역할을 합니다¹. 효율적인 면역 반응을 생성하는 폐포의 능력은 폐 감염을 예방하고 폐 건강을 확보하는 데 매우 중요합니다. 폐는 박테리아, 바이러스, 곰팡이, 알레르기 및 미립자 물질을 포함한 광범위한 잠재적 위험에 지속적으로 노출되어 있기 때문에 폐포 점막 면역 반응의 복잡성을 이해하는 것은 호흡기 감염, 염증성 질환의 메커니즘을 발견하고 폐 질환을 치료하는 데 매우 중요합니다¹.

in vitro에서 호흡기의 감염 및 염증 관련 과정을 연구하려면 폐포 환경과 면역 반응을 충실하게 모방할 수 있는 모델이 필요합니다. 2D 세포 배양 및 동물 모듈은 폐 면역 반응에 대한 생물의학 연구를 위한 필수 도구로 수십 년 동안 사용되어 왔습니다. 그러나 그들은 종종 인간 상황에 대한 번역 잠재력에 한계가 있습니다. Lung-on-chip 모델은 기존의 in vitro 모델과 in vivo 모델 간의 격차를 메우는 데 기여할 수 있으며 인간 특이적 면역 반응을 연구하는 새로운 접근 방식을 제공할 수 있습니다

프로토콜

HUVEC 세포는 탯줄에서 분리되어 4번 통로까지 사용됩니다. 일차 단핵구는 전혈에서 건강한 기증자로부터 분리됩니다. 이 연구는 독일 예나에 있는 예나 대학병원의 윤리 위원회(3939-12/13)의 승인을 받았다. 헬싱키 선언에 따르면, 연구를 위해 세포를 기증한 모든 개인은 정보에 입각한 동의를 했습니다.

1. 1일차: 바이오칩 준비

1. 바이오칩은 다양한 크기와 모델로 제공됩니다. 여기서 실험하려면 BC002 모델을 사용합니다. 바이오칩을 유리 페트리 접시에 넣고 접시를 채우고 모든 구멍을 멸균 70% 에탄올(EthOH)로 씻어냅니다. 실온에서 45분 동안 배양합니다. 그 후, 멸균 ddH₂O로 충치를 2배 세척하고 ddH₂O를 제거합니다.
2. 파란색 팁이 있는 1,000μL 피펫을 사용하여 콜라겐 IV 용액을 양쪽 캐비티를 통해 콜라겐 IV 용액을 부드럽게 세척하여 멸균 콜라겐 IV 용액(0.5mM 아세트산에서 0.5mg/mL, 마그네슘 및 칼슘 PBS(+/+)이 함유된 Dulbecco의 인산염 완충 식염수에 1:100 농도 사용)로 양쪽 캐비티의 바이오칩 멤브레인을 코팅합니다. 37 °C 및 5 % CO₂에서 15 분 동....

토론

폐포-온-칩(alveolus-on-chip) 모델은 인간 폐포의 다층 조직 모델을 나타내며, 폐 상피 세포, 내피 세포 및 대식세포를 포함한 하부 호흡기의 필수 세포 유형을 통합하며, 내피 내벽의 중간 관류와 함께 ALI에서 기관형 배열로 배양됩니다. 서로 다른 층의 세포는 폐 상피 세포의 칼슘 의존성 접착 분자인 E-cadherin과 같은 특정 세포 마커 단백질을 발현하며, 이는 세포 간 상피 장벽을 형성하는 데 핵심적입.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Cellcounting chamber slides (Countess)	Invitrogen	C10283
Cell culture Multiwell Plates, 24 Well, steril	Greiner Bio-One	662 160
Cell culture Multiwell Plates, 6 Well, steril	Greiner Bio-One	657 160
Coverslips (24x40mm; #1.5)	Menzel-Gläser	15747592
Eco wipes	Dr. Schuhmacher	00-915-REW10003-01
Eppies 2.0	Sarstedt	72.691
Eppis 0.5	Sarstedt	72.699
Eppis 1.5	Sarstedt	72.690.001
Falcons 15mL	Greiner Bio-One	188 271-TRI
Falcons 50mL	Greiner Bio-One	227 261-TRI
Gauze swab	Noba	PZN 2417767
Gloves Nitril 3000	Meditrade	1280
Microscope slides	Menzel-Gläser	AAAA000001##12E
Multiwell Plates 24 Well, sterile	Greiner Bio-One	662 160
Pasteur pipettes (glass) 150mm	Assistent	40567001
Pasteur pipettes (glass) 230mm	Assistent	40567002
Round-bottom tubes (PS, 5mL)	Falcon	352052
Safety-Multifly-Set, 20G, 200mm	Sarstedt	85.1637.235
Scalpels	Dahlhausen	11.000.00.715
Serological pipettes 10mL	Greiner Bio-One	607 160-TRI
Serological pipettes 25mL	Greiner Bio-One	760 160-TRI
Serological pipettes 2mL	Greiner Bio-One	710 160-TRI
Serological pipettes 50mL	Greiner Bio-One	768 160-TRI
Serological pipettes 5mL	Greiner Bio-One	606 160-TRI
S-Monovette, 7,5ml Z-Gel	Sarstedt	1.1602
S-Monovette, 9,0ml K3E	Sarstedt	02.1066.001
Softasept N	Braun	3887138
T25 flask	Greiner Bio-One	690 960
Tips sterile 10µL	Greiner Bio-One	771 261
Tips sterile 1250µL	Greiner Bio-One	750 261
Tips sterile 300µL	Greiner Bio-One	738 261
Tips unsterile 10µL	Greiner Bio-One	765 290
Tips unsterile 1000µL	Greiner Bio-One	739 291
Tips unsterile 200µL	Greiner Bio-One	686 290
Tweezers (Präzisionspinzette DUMONT abgewinkelt Inox08, 5/45, 0,06 mm)	Roth	K343.1
Chemicals
Descosept AF	Dr. Schuhmacher	N-20338
Ethanol 96%	Nordbrand-Nordhausen	410
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran (3-5kDa)	Sigma Aldrich	FD4-100MG
Fluorescent Mounting Medium	Dako	S3023
Methanol	VWR	20847.295
Saponin	Fluka	47036
Tergazyme	Alconox	1304-1
Cell culture
Collagen IV	Sigma-Aldrich	C5533-5MG
Dexametason	Sigma-Aldrich	D4902
DPBS (-/-)	Lonza	BE17-516F
DPBS (+/+)	Lonza	BE17-513F
EDTA solution	Sigma-Aldrich	E788S
Endothelial Cell Growth Medium	Promocell	C-22020
Endothelial Cell Growth Medium supplement mix	Promocell	C-39225
Fetal bovine Serum	Sigma-Aldrich	E2129-10g
H441	ATCC
Human recombinant GM-CSF	Peprotech	300-30
Lidocain	Sigma-Aldrich	L5647-15G
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140-122 /-163
RPMI	Gibco	72400047
Trypane blue stain 0.4%	Invitrogen	T10282
Trypsin	Gibco	15090-046
Primary antibodies
Cadherin-5 / VE-Cadherin (goat)	BD	610252
CD68 (rabbit)	CellSignaling	76437
E-Cadherin (goat)	R&D	AF748
SP-A (mouse)	Abcam	ab51891
Secondary antibodies
AF488 (donkey anti mouse)	Invitrogen	R37114
AF647 (donkey anti mouse)	invitrogen	A31571
AF647 (donkey anti rabbit)	Invitrogen	A31573
Cy3 (donkey anti goat)	jackson research	705-165-147
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dilactate)	Invitrogen	D3571
Microfluidic
Chip	Dynamic 42	BC002
Male Luer Lock (small)	ChipShop	09-0503-0270-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, green	Microfluidic chipshop	09-0558-0336-11
Male mini luer plugs, row of four,PP, opaque	Microfluidic chipshop	09-0556-0336-09
Male mini luer plugs, row of four,PP, red	Microfluidic chipshop	09-0557-0336-10
Plugs	Cole Parmer	GZ-45555-56
Reservoir 4.5mL	ChipShop	16-0613-0233-09
Tubing	Dynamic 42	ST001
Equipment
Autoclave	Tuttnauer	5075 ELV
Centrifuge	Eppendorf	5424
CO2 Incubator	Heracell	150i
Countess automated cell counter	Invitrogen	C10227
Flowcytometer	BD	FACS Canto II
Freezer (-20 °C)	Liebherr	LCexv 4010
Freezer (-80 °C)	Heraeus	Herafreeze HFU 686
Fridge	Liebherr	LCexv 4010
Heraeus Multifuge	Thermo Scientific	X3R
Microscope	Leica	DM IL LED
Orbital shaker	Heidolph	Reax2000
Peristaltic pump	REGLO Digital MS-4/12	ISM597D
Pipettes 10µL	Eppendorf Research plus	3123000020
Pipettes 100µL	Eppendorf Research plus	3123000047
Pipettes 1000µL	Eppendorf Research plus	3123000063
Pipettes 2.5µL	Eppendorf Research plus	3123000012
Pipettes 20µL	Eppendorf Research plus	3123000039
Pipettes 200µL	Eppendorf Research plus	3123000055
Scale	Sartorius	6101
Scale	Sartorius	TE1245
Sterile bench	Kojair	Biowizard SL-130
Waterbath	Julabo	SW-20C
Fluorescence Microscope Setup
Apotome.2	Zeiss
Illumination device	Zeiss	HXP 120 C
Microscope	Zeiss	Axio Observer 5
Optical Sectioning	Zeiss	ApoTome
Power Supply Microscope	Zeiss	Eplax Vp232
Software
ZEN Blue Edition	Zeiss