제브라피시 비늘의 세포 역학을 연구하기 위한 체외 배양 기법

요약

이 프로토콜은 간단한 체외 배양 기법을 사용하여 세포 역학을 연구하는 방법을 제공합니다. 제브라피시 연구자와 교육자들은 비늘 내에서 형광 핵 및 세포 사멸 세포를 시각화하여 뼈 항상성 및 기본 세포 생물학과 관련된 것과 같은 세포 과정을 연구할 수 있는 기회를 제공합니다.

초록

제브라피시 비늘은 교육 및 연구 목적으로 표준 실험실에서 사용할 수 있는 다양한 이점을 제공합니다. 비늘은 안락사 없이 쉽게 채취할 수 있고, 몇 주 이내에 재생되며, 반투명하고 작아서 표준 현미경으로 볼 수 있습니다. 제브라피시 비늘은 학생들이 특히 세포 역학 및 체외 배양 방법을 이해하는 데 있어 실습 학습 경험에 참여할 수 있는 독특한 기회를 제공하기 때문에 교육 환경에서 특히 유용합니다. 이 프로토콜의 주요 목적은 기본 실험실 장비를 사용하여 다양한 생물학적 연구에 사용하기 위해 배양에서 제브라피시 비늘을 수집하고 유지하는 방법을 설명하는 것입니다. 또한, 이 프로토콜은 뼈 흡수 및 침착에 관여하는 뼈 세포의 활동을 조사하여 뼈 항상성을 이해하는 데 사용하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한 핵 및 자가사멸 세포의 시각화와 같은 일반적인 기술에 대한 추가 프로토콜도 포함되어 있습니다. in vitro culturing 프로토콜은 최소한의 시약과 장비로 신뢰할 수 있는 결과를 생성합니다. 이 기사에서는 과학적 탐구를 촉진하기 위해 제브라피시 비늘의 체외 배양을 사용하는 이점에 대해 논의하고 교육 환경으로의 통합을 지원하는 데 필요한 리소스를 간략하게 설명합니다.

서문

최근 몇 년 동안 제브라피시(Danio rerio)는 유전학, 발달 생물학 및 독성학을 포함한 다양한 과학 분야에서 가치 있는 모델 유기체로 부상했습니다 ^1,2,3. 제브라피쉬는 동남아시아의 강에 서식하는 작은 열대 민물고기입니다⁴. 그들은 쉬운 유지 관리, 작은 크기, 빠른 번식주기 및 반투명 배아로 인해 생물학에서 인기있는 모델 유기체가되었습니다¹. 이를 통해 내부 발달을 쉽게 관찰할 수 있으므로 발달 생물학에서 다양한 생물학적 과정을 연구하는 데 이상적입니다. 제브라피쉬는 인간과 유전적 유사성을 공유합니다. 인간 유전자의 약 70%는 적어도 하나의 제브라피시 대응물을 가지고 있어 인간의 유전 질환 및 질병을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다 ^5,6. 제브라피쉬의 특정 유전자를 조작함으로써 연구자들은 유전자의 기능과 행동에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있으며, 이는 인간 건강 연구⁶, 유전자 편집 및 유전자 변형 계통 생성에 적용될 수 있습니다 ^7,8.

제브라피시 비늘은 제거 후 재생됩니다 ^9,10 실험에 사용되는 동안 기본(non-CO₂) 인큐베이터로^1-3일 동안 배양할 수 있습니다 11. 제브라피쉬 비늘의 사용은 안락사 없이 마취된 물고기에서 제거할 수 있기 때문에 기본 실험실에서 유리합니다. 제브라피시 비늘은 주로 두 개의 층으로 구성된 진피 골격의 구성 요소입니다: 내부 층은 두껍고 콜라겐 섬유소 층으로 형성된 부분적으로 광물화된 조직으로 이루어져 있고, 외부 층은 고도로 광물화되어 있으며 짜여진 콜라겐 섬유소 네트워크를 포함하고 있습니다^12,13 (그림 1A-C). 스케일의 이러한 형태학적 및 세포적 특징은 표준 복합 현미경으로 쉽게 관찰할 수 있습니다. 이러한 특성으로 인해 제브라피시 비늘은 세포 및 분자를 연구하기 위한 좋은 모델입니다. 예를 들어, 제브라피시 비늘은 뼈 세포 활동을 포함한 뼈 항상성을 연구하는 데 사용되었습니다^11,12. 또한^{조직 재생}9,14,15, 유전자 경로 및 신호전달(^14,16), 대사(¹⁷), 미생물군 연구⁽¹⁸) 등을 이해하는 데 사용되어 왔습니다. 제브라피쉬는 다른 텔레오스트와 마찬가지로 오염 물질 및 독소와 같은 환경 요인에도 매우 민감합니다 19,20,21,22. 따라서 물고기 비늘은 물고기 개체군의 독소에 대한 노출을 연구하는 데 사용됩니다. 이러한 특성으로 인해 저울은 환경 요인이 살아있는 유기체에 미치는 영향에 대해 학생들에게 가르치는 훌륭한 모델입니다. 또한 Tg(osterix:mCherry) 및 Tg(runx2a:GFP)와 같은 유전자 변형 제브라피시 계통의 비늘은 학생 실험에 또 다른 수준의 복잡성을 추가할 수 있습니다.

요약하면, 제브라피시 비늘을 사용하여 연구자들은 세포 메커니즘에서 환경 변화에 이르기까지 생물학의 다양한 측면을 연구하기 위한 실험을 설계하고 수행할 수 있습니다. 제브라피시는 실험 설계, 데이터 수집 및 분석에 대한 실습 경험을 제공할 수 있기 때문에 고등 교육에서도 귀중한 자원입니다. 제브라피쉬는 특정 관심 분야를 탐색하기 위한 고급 과정 및 연구 중심 프로그램에서도 활용할 수 있습니다. 이 문서에서는 연구 및 교실 학습 환경에서 제브라피시 스케일을 사용하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

여기에 설명된 모든 프로토콜은 캐나다 동물 관리 위원회(Canadian Council on Animal Care) 지침을 따르며 프로토콜 번호 20-14 및 21-12에 따라 Saint Mary's University/Mount Saint Vincent University Animal Care 위원회에서 매년 승인했습니다. 이 프로토콜을 수행하기 전에 사용자는 연구 또는 교육에 동물을 사용하는 것에 대한 연방 및 주정부 지침을 따라야 합니다²³. 이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 스케일 배양을 위한 시약의 준비

1. HEPES(DMEM 분말 10g, HEPES 5.95g, 증류수 1L 또는 dH_2O, pH: 6.91)로 DMEM 배지를 준비하고 분취액을 넣고 4°C에서 보관합니다.
2. 배양 배지 작업 용액(HEPES, 10% 소 태아 혈청 및 2% 페니실린-스트렙토마이신[mL당 5000 단위 페니실린 및 5mg 스트렙토마이신]이 포함된 88% DMEM 배지)을 실험이 수행되는 날 필요한 부피에 맞게 조정합니다.
   알림: 작업 용액은 매일 신선하게 준비해야 하며 보관할 수 없습니다. 배양 배지는 사용할 때까지 차갑게(4°C 또는 얼음 위에서) 보관해야 합니다.
3. 배양 배지 작업 용액을 실험이 수행될 용기에 Aliquot합니다. 이 경우 0.2mL 튜브 또는 96웰 플레이트를 사용했습니다. 필요할 때까지 이 부분 표본을 얼음에 유지하십시오.
   알림: 이 용액은 신선하게 준비해야 하며 1일 이상 보관할 수 없습니다. 모든 시약에 대해서는 표 1 을 참조하십시오.

2. 살아있는 물고기에서 비늘 제거

1. 4-5마리의 성체 물고기를 위해 약 2L의 물 부피를 가진 제브라피시를 위한 용기 또는 탱크를 준비하십시오.
   참고: 제브라피쉬에 적합한 물의 일반적인 매개변수는 pH 7.5, 온도 28.5°C, 전도도 640-781μS 및 12-12시간 암광 주기입니다. 탱크의 온도가 지속적으로 유지되는지 확인하십시오.
2. 어망을 사용하여 4-5마리의 성체 제브라피시를 포획하고 위에 준비된 제브라피시 보관 탱크에 넣습니다.
3. 물고기를 마취할 최소 60mL의 물이 담긴 용기를 준비합니다.
   알림: 물고기는 컨테이너 안에서 움직일 수 있어야 하며 튀어나오지 않을 만큼 충분히 깊어야 합니다. 이 용기는 제브라피시 물로 구성되어야 하는 완충된 0.01% 트리카인 메탄-설포네이트(MS222)를 포함해야 합니다(300mL의 제브라피시 수계에 0.3g의 MS222, 1M NaOH 615μL로 제조된 0.1% MS222를 10회 희석).
   주의: 이러한 실험을 수행하는 개인은 제브라피시를 포획, 마취 및 취급하기 위해 기관 동물 윤리 위원회의 승인을 받아야 합니다. 마찬가지로, 사용되는 마취제는 저농도의 트리카인 메탄-설포네이트(MS222)로, 이는 어류 생물학에서 일반적으로 사용되는 화학 물질이지만 일회용 니트릴 장갑, 보안경/스플래시 고글 및 실험실 가운을 포함한 적절한 개인 보호 장비와 같이 적절한 취급이 필요합니다(자세한 내용은 MS222의 안전 데이터 시트 참조).
4. 이전에 1단계에서 사용한 것과 동일한 사양의 회수 용기(최소 2L의 물)를 준비하여 비늘 제거 후 물고기를 놓습니다. 이 용기에는 위에서 언급한 것처럼 충분한 공간과 올바른 물 매개변수가 있어야 합니다.
5. 그물을 사용하여 성인 제브라피시 한 마리를 0.01% MS222가 있는 용기에 조심스럽게 옮깁니다. 물고기가 완전히 움직이지 않고 최소한의 수술적 움직임을 가질 때까지 기다립니다(보통 10분 미만 소요).
   알림: 이 전체 단계는 한 번에 한 마리의 물고기로 수행됩니다. 취급 중인 물고기에서 비늘이 성공적으로 제거되고 해당 물고기가 회수 용기로 옮겨질 때까지 다음 물고기를 마취하지 마십시오.
6. 젖은 종이 타월을 깐 거꾸로 된 페트리 접시에 성인 제브라피시를 개별적으로 놓습니다.
7. 해부 실체 현미경으로 미세한 집게를 사용하여 개별 물고기에서 최대 10-12 개의 비늘을 제거하십시오. 비늘은 물고기의 측면 영역에서 제거되며, 비늘은 신체의 다른 부분에 비해 더 크고 더 일정한 크기를 갖습니다(그림 2). 물고기의 양면을 사용할 수 있습니다.
   1. 스케일의 자연스러운 방향(즉, 앞쪽에서 뒤쪽 방향으로)으로 부드럽게 잡아당겨 스케일을 한 번에 하나씩 제거합니다. 이 작업은 가능한 한 빨리 수행해야 합니다.
8. 스케일이 분해되는 것을 방지하기 위해 스케일 배양 배지 작업 용액(1.1단계에서 준비)이 들어 있는 별도의 0.2 mL 튜브에 각 개별 스케일을 넣습니다. 96웰 플레이트를 대안으로 사용할 수 있습니다.
   참고: 개별 저울을 별도의 튜브 또는 웰에 격리하면 저울이 서로 달라붙는 것을 방지하고 여러 실험에 필요할 수 있는 개별 저울을 추적할 수 있습니다.
9. 특정 실험에 스케일 처리가 필요한 경우 이 단계에서 적용합니다. 일부 프로토콜의 예는 4단계와 5단계를 참조하십시오.
10. 스케일이 있는 튜브를 28°C의 인큐베이터 내부에 넣습니다. 배양 배지는 24시간마다 교체해야 합니다(배양 배지 작업 솔루션 사용). 여기에 설명된 실험에는 non-CO₂ 인큐베이터가 사용되었습니다.
11. 비늘을 제거한 후 제브라피시를 조심스럽게 회수 탱크에 넣고 움직임이 재개될 때까지 모니터링합니다. 피펫 또는 폭기석은 회수 속도를 높이기 위해 탱크에 공기를 제공하는 데 사용됩니다.
12. 움직임이 회복되면 제브라피시를 일반 사육 수조로 되돌려 놓습니다. 사용한 물고기는 다른 물고기와 별도로 보관하여 별도로 회복할 수 있도록 하고 어떤 물고기가 비늘을 활발하게 재생하는지 추적하는 것을 잊지 마십시오.
13. 이 동일한 물고기에서 스케일 제거를 반복하기 전에 ~2주를 기다리십시오. 이렇게 하면 비늘을 자연스럽게 재생할 수 있는 시간이 생깁니다.

3. 비늘의 고정

1. 10x PBS로 제조 된 인산염 완충 식염수 (PBS) 1x 200 μL로 스케일을 3 회 세척합니다 (1L의 경우 NaCl 80g, KCl 2g 및 Na₂HPO₄ 11.2g을 추가하고 1 L까지 dH₂O를 추가).
2. 1x PBS를 제거하고 4°C에서 밤새 200μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 추가합니다. PFA 100ml에 파라포름알데히드 4g과 NaOH 0.1g을 넣은 다음 100mL가 될 때까지 1x PBS를 추가합니다. 약한 불로 설정된 핫 플레이트에서 혼합하고 용액이 맑아질 때까지 저어준 다음 용액을 식히고 pH를 7.4로 안정화시킵니다. -20 °C에서 보관하십시오. 자세한 내용은 보충 파일 1 (표 1)을 참조하십시오.
3. 고정 후 200μL의 1x PBS로 스케일을 3회 세척합니다. 저울을 4 °C에서 보관하십시오.
   주의: PFA는 해롭습니다. 자세한 내용은 물질안전보건자료를 참조하십시오. 이러한 모든 프로세스에는 일회용 니트릴 장갑, 보안경/스플래시 고글 및 실험실 가운을 포함한 적절한 개인 보호 장비와 같은 적절한 취급이 필요합니다.

4. 뼈 항상성

참고: 두 가지 뼈 항상성 절차가 아래에 설명되어 있습니다. 주석산염 저항성 산성 인산가수분해효소(TRAP) 및 알칼리성 인산가수분해효소(AP) 염색은 일반적으로 각각 활성 파골세포와 조골세포를 식별하는 데 사용됩니다. 파골세포는 뼈 기질을 재흡수하고 조골세포는 뼈 기질을 침착합니다. AP는 골이 형성되는 동안 조골세포가 분비하는 주요 효소이며, TRAP은 파골세포가 파골세포와 뼈 기질 사이의 산성 공간으로 분비하여 뼈 파괴 및 흡수를 돕습니다 24,25,26. 이 프로토콜은 제브라피시 정보 네트워크(The Zebrafish Information Network^{) 27}에서도 사용할 수 있으며 이전에²⁸에 게시되었습니다. 알칼리성 인산가수분해효소(Alkaline phosphatase)는 대사 과정의 일부로 여러 세포 유형에서 생성되는 효소입니다. 이 과정은 조골세포에만 국한된 것은 아니지만 뼈 조직에서는 조골세포 기능의 마커로 사용됩니다.

1. 주석산염 저항성 산성 인산가수분해효소(TRAP) 염색
   1. 각 고정 스케일을 0.2 mL 튜브 또는 200 μL의 dH₂O가 있는 96웰 플레이트에 넣고 약 150 μL의 dH₂O를 15분 동안 세 번 추가 및 제거하여 스케일을 세척합니다. 자세한 내용은 보충 파일 1 (표 2)을 참조하십시오.
   2. 0.2 mL 튜브 또는 웰에서 스케일을 제거하고 200 μL의 50 mM 주석산염 완충액이 들어 있는 새 튜브에 넣습니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      1. 100mM의 주석산염 완충액의 경우 유리 용기를 준비하고 주석산 2.3g을 첨가하고 0.2M 아세테이트 완충액(pH 5.5)과 100mL의 용액이 될 때까지 혼합합니다. 잘 젓고 4 °C에서 보관합니다. 50mM의 주석산염 완충액을 제조하려면 동일한 부피의 dH_2O및 100mM 주석산염 완충액을 추가합니다. 자세한 내용은 보충 파일 1 (표 3 및 표 4)을 참조하십시오.
   3. 튜브에서 주석산염 완충액을 제거하고 200μL의 TRAP 기질 용액을 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 샘플을 배양합니다. 샘플이 어둠 속에 남아 있는지 확인하십시오.
      1. 어두운 유리 용기를 준비하고 100mM 주석산염 완충액 30mL, 육각화 PRS(파라로사닐린 염산염 용액) 1mL, 효소 기질 용액 2mL를 추가합니다. 잘 저어주세요.
         참고: 이 솔루션은 저장할 수 없습니다. 사용중에는 실온의 어두운 곳에 보관하십시오. TRAP 기판 용액을 제조하는 데 필요한 용액은 보충 파일 1 (표 5-9)을 참조하십시오.
   4. TRAP 기질 용액을 제거하고 약 150μL의 dH_2O를 15분 동안 3회 추가 및 제거하여 스케일을 세척합니다.
   5. 튜브에서 스케일을 제거하고 퇴색을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 싸인 80% 글리세롤 200μL(100mL의 경우 글리세롤 80mL와 dH_2O20mL를 혼합)가 있는 새 튜브 또는 웰에 넣고 4°C에서 보관합니다.
   6. 현미경으로 비늘을 시각화하려면 움푹 들어간 곳이나 오목한 슬라이드를 사용하십시오.
2. 알칼리성 인산염(AP) 염색
   1. 각 고정 스케일을 200 μL의 dH₂O가 있는 0.2 mL 튜브 또는 96웰 플레이트에 넣고 약 150 μL의 dH₂O를 15분 동안 3회 추가 및 제거하여 세척합니다. 자세한 내용은 보충 파일 1 (표 2)을 참조하십시오.
   2. 0.2mL 튜브 또는 웰에서 스케일을 제거하고 200μL의 트리스-말레산염 완충액이 들어 있는 새 튜브에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
      1. 이 완충액의 경우 유리 용기를 준비하고 트리스 완충액 0.605g과 말레산 0.55g을 추가합니다. 25mL가 될 때까지 dH₂O를 넣고 잘 저어줍니다. pH 8.3으로 안정화합니다. 4 °C에서 보관하십시오. 자세한 내용은 보충 파일 1 (표 10)을 참조하십시오.
   3. 튜브에서 트리스-말레산염 완충액을 제거하고 200μL의 AP 기판 용액을 추가합니다. 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 샘플이 어둠 속에 남아 있는지 확인하십시오.
      1. 이 용액의 경우 어두운 유리 용기를 준비하고 디아조늄 염 8mg을 넣고 N,N-디메틸포름아미드의 나프톨-AS-TR-인산염 0.1mL 및 트리스-말레산염 완충액(pH 8.3) 10mL와 혼합하고 잘 저어줍니다. 이 용액을 새로 준비하십시오. 자세한 내용은 보충 파일 1(표 11)을 참조하십시오.
   4. AP 기질 용액을 제거하고 200μL의 dH_2O를 15분 동안 3회 추가 및 제거하여 스케일을 세척합니다.
   5. 튜브에서 스케일을 제거하고 퇴색을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 감싼 80% 글리세롤 200μL가 있는 새 튜브 또는 웰에 넣습니다. 4 °C에서 보관하십시오.
   6. 현미경을 사용하여 비늘을 시각화하려면 비늘을 오목하거나 움푹 들어간 슬라이드에 놓습니다.
      주의: TRAP 및 AP 염색에 사용되는 대부분의 시약은 유해할 수 있습니다. 각 화학 물질에 대한 안전 보건 자료를 참조하십시오. 이러한 모든 절차에는 일회용 니트릴 장갑, 보안경/스플래시 고글 및 실험실 가운을 포함한 적절한 개인 보호 장비와 같은 적절한 취급이 필요합니다.

5. 제브라피시 비늘의 세포 역학 시각화

참고: 다양한 염색 방법을 사용하여 스케일 간의 차이를 시각화하고 스케일 내 세포를 라벨링할 수 있습니다(그림 3B). 예를 들어, 스케일의 세포 내에서 핵과 리소좀을 염색하는 방법은 아래에 요약되어 있습니다.

1. 세포핵 시각화를 위한 DAPI 염색
   참고: DAPI는 DNA에 라벨을 붙여서 모든 세포의 핵을 표시하는 데 사용됩니다. DAPI는 DNA 염기서열에서 아데닌과 티민이 풍부한 영역에 강하게 결합하는 형광 마커입니다.
   1. DAPI를 사용하기 전에 스케일이 4% 파라포름알데히드에 고정되어 있는지 확인하십시오(3단계). 고정 후 200μL 1x PBS로 스케일을 5분 동안 세척합니다.
   2. 다음과 같이 1:10 희석으로 DAPI 작업 용액을 준비합니다. 1μL의 DAPI와 9μL의 1x PBS를 혼합하여 총 부피가 10μL가 됩니다.
   3. DAPI 용액을 준비한 후 겸자 또는 플라스틱 피펫을 사용하여 스케일을 오목한 슬라이드에 놓고 과도한 PBS를 제거한 다음 준비된 DAPI 용액 약 10μL를 추가합니다.
      참고: DAPI는 스케일을 즉시 염색하므로 여기 파장이 352-402 nm이고 방출 파장이 417-477 nm인 형광 현미경을 사용하여 시각화할 수 있습니다. DAPI는 모든 세포핵을 밝은 파란색으로 염색합니다. 시야에서 전체 스케일을 보기 위해 4x 대물렌즈가 사용되었습니다. 단일 염색된 핵은 20x 대물렌즈를 사용하여 볼 수 있습니다.
   4. 스케일의 세포 수를 결정하기 위해 DAPI 염색된 핵의 수를 계산합니다.
2. 살아있는 샘플에서 세포 사멸 시각화를 위한 Apoptotic 염색
   참고: 형광 염색은 자가사멸 세포를 라벨링하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 여기에 사용된 형광 마커 프로토콜은 산성 환경을 위한 것이며 리소좀과 같은 산성 소기관을 라벨링하고 추적하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 세포 소기관의 수의 증가는 세포 사멸 증가와 상관 관계가 있습니다. 이 염색은 갓 뽑았거나 최대 2일 동안 배양한 고정되지 않은 비늘에 적용해야 합니다.
   1. 배양 배지를 희석제로 사용하여 제조업체의 지침에 따라 세포 사멸 추적을 위한 형광 염색 용액을 준비합니다.
      참고: 형광 염색의 농도는 사용된 세포사멸 방법에 따라 크게 변할 수 있습니다. 권장 농도에 대한 구체적인 세부 정보는 선택한 염색에 대한 상용 프로토콜을 참조하십시오.
   2. 각 0.2mL 튜브에서 배양 배지를 조심스럽게 제거하거나 스케일이 이전에 배양된 경우 96웰 플레이트에서 웰을 제거합니다.
   3. 전체 스케일(약 50 μL)을 덮을 수 있을 만큼 충분한 형광 염색 용액을 추가합니다.
   4. 색이 바래지 않도록 모든 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 30분 동안 그대로 두십시오.
   5. 튜브 또는 웰에서 형광 염색 용액을 제거합니다.
   6. 200μL의 1x PBS를 튜브 또는 웰에 5분 동안 추가하여 샘플을 세척합니다.
   7. PBS를 제거하고 200μL의 4% PFA를 튜브 또는 웰에 추가하여 실온에서 1시간 동안 샘플을 고정합니다.
   8. 200 μL 1x PBS를 튜브 또는 웰에 5분 동안 추가하여 샘플을 세척합니다.
   9. 스케일을 새 0.2mL 튜브 또는 웰로 옮기고 200μL의 새로운 1x PBS를 추가합니다. 퇴색을 방지하기 위해 이 튜브/웰을 알루미늄 호일로 덮으십시오. 4 °C에서 보관하십시오.
   10. 형광 현미경으로 스케일을 시각화하려면 오목 또는 함몰 슬라이드와 올바른 필터를 사용하십시오. 여기에 사용된 형광 신호는 최대 577-590nm의 여기 및 방출을 갖습니다. 형광 염색은 빨간색으로 리소좀을 포함하는 자가사멸 세포를 보여줍니다.
   11. 세포사멸이 진행되는 세포의 수를 결정하기 위해 염색된 세포의 수를 세십시오.
       알림: 알루미늄 호일은 변색을 방지하기 위해 염색 및 보관 중에 사용됩니다. 샘플은 사용되는 형광 염색제에 따라 몇 시간 또는 며칠 동안 어두운 곳에 보관할 수 있습니다. 형광 샘플을 더 오래 보관하려면 형광 염색제와 호환되는 고정 및 장착 프로토콜을 사용하십시오. 모든 형광 염색은 최소 20배 배율의 형광 현미경을 사용하여 시각화되었습니다. 사용된 필터는 다음과 같습니다: DAPI 417-477 nm의 경우; 세포 사멸 추적용 577-590 nm.

결과

최근에는 이 스케일 배양 프로토콜이 뼈 항상성¹¹을 연구하는 데 사용되었습니다. 비늘은 배양 배지에서 최소 2일 동안 생존할 수 있습니다. apoptotic cell의 수는 라벨링된 세포를 계수하여 최대 3일까지 배양일마다 분석되었습니다. 이러한 결과는 배양 3일째에 자가사멸 세포가 크게 증가했음을 보여주었으며, 이는 여기에 설명된 방법을 사용하여 배양 시...

토론

제브라피시 비늘은 자연 환경을 시뮬레이션하기 위해 배양 방법과 인큐베이터를 사용하여 최대 2일 동안 유지할 수 있는 다양한 생물학적 과정을 연구하기 위해 쉽게 접근할 수 있는 시험관 내 모델입니다¹¹. 스케일은 존재하는 세포의 규칙적이고 비례적인 분포를 가지고 있어 연구원이 세포를 보고, 계수하고, 라벨링할 수 있으며, 기본 실험실 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL tubes	n/a	n/a
37% HCl	EMD	HX0603-4	For pH stabilization and prepration of PRS
Concave slide	n/a	n/a
DAPI	Vectashield	H-1200	For cell nuclei visualization
Diazonium salt (Fast Blue B)	Sigma	D9805	For AP substrate solution
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) powder	Sigma	D5523	For scale culture media
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MS222)	Sigma	E10521	For preparation of 0.1% MS222
Fetal bovine serum	Sigma	F4135	For scale culture media
Fluorescence microscope	n/a	n/a
Glacial acetic acid	Fisher	A38 212	For acetate buffer
Glycerol	VWR	BDH1172-4LP	For 80% glycerol - storage scales
HEPES	ThermoFisher	15630106	For scale culture media
Hot plate	n/a	n/a
KCl	Sigma	P217-10	For preparation of PBS
Lysotracker	ThermoFisher	L7528	For lysosomes  visualization
Maleic acid	Sigma	M0375	For Tris-Maleate buffer
Micropipette	n/a	n/a
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For AP substrate solution
N,N-dimethylformamide	Sigma	319937	For Enzyme Substrate Solution
Na2HPO4	EMD	SX0720-1	For preparation of PBS
NaCl	Sigma	S9888	For preparation of PBS
NaNO2	Sigma	S-2252	For 4% NaNO2
NaOH	Sigma	S5881	For preparation of 4% PFA
NaOH	Sigma	S5881	For scale fixation and pH stabilization
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For AP substrate solution
Napthol-AS-TR-phosphate	Sigma	N6125	For Enzyme Substrate Solution
Pararosaniline hydrochloride	Sigma	P3750	For PRS
Penicillin-streptomycin 5000 units penicillin and 5mg streptomyocin/ml	ThermoFisher	15140122	For scale culture media
Personal protective equipment (PPE): disposable nitrile gloves, safety glasses/splash goggles and lab coat.	n/a	n/a
PFA	Sigma	P6148	For scale fixation
Sodium acetate	Sigma	S2889	For acetate buffer
Standard compound microscope	n/a	n/a
Stir plate	n/a	n/a
Tartaric acid	Sigma	T6521	For Tartrate buffer
Tris base	Roche	03 118 142 001	For Tris-Maleate buffer