공동 배양에서 Desmoplastic Three-dimensional Pancreatic Cancer Spheroids 성장

요약

췌장암은 여전히 치료하기 가장 어려운 암 중 하나입니다. 따라서 치료 효능을 평가하는 전임상 모델은 재현 가능하고 임상적으로 관련성이 있어야 합니다. 이 프로토콜은 재현 가능하고 임상적으로 유의미한 탈형성 스페로이드를 생성하기 위한 간단한 공동 배양 절차를 설명합니다.

초록

췌관 선암(PDAC)은 5년 생존율이 <12%인 가장 치명적인 암 중 하나입니다. 치료의 가장 큰 장벽은 종양을 둘러싸고 있는 조밀한 박형성 세포외 기질(ECM)로, 일반적으로 박형성이라고 하는 혈관화를 감소시킵니다. 암을 치료하기 위해 다양한 약물 조합과 제형이 테스트되었으며, 그 중 많은 약물이 전임상에서는 성공을 보이지만 임상적으로는 실패합니다. 따라서 치료에 대한 종양의 반응을 예측할 수 있는 임상적으로 유의미한 모델을 보유하는 것이 중요합니다. 이 모델은 이전에 절제된 임상 종양에 대해 검증되었습니다. 여기에서는 자연적으로 강력한 ECM을 생성할 수 있고 성장을 지원하기 위해 외부 매트릭스 소스나 스캐폴드가 필요하지 않은 탈형성 3차원(3D) 공동 배양 스페로이드를 성장시키기 위한 간단한 프로토콜에 대해 설명합니다.

간단히 말해서 인간 췌장 성상 세포(HPaSteC) 및 PANC-1 세포를 사용하여 각각 1:2 비율로 세포를 포함하는 현탁액을 제조합니다. 셀은 폴리-HEMA 코팅된 96-웰 저부착 U-웰 플레이트에 도금됩니다. 플레이트는 세포가 초기 펠릿을 형성할 수 있도록 원심분리됩니다. 플레이트는 5% CO₂ 와 함께 37°C의 인큐베이터에 보관하고 배지는 3일마다 교체합니다. 스페로이드 부피를 측정하기 위해 지정된 간격으로 플레이트를 이미지화할 수 있습니다. 14일간의 배양 후 성숙한 탈형성 스페로이드가 형성되고(즉, 평균 부피 0.048 + 0.012mm3(451μm x 462.84μm)) 실험적 치료 평가에 사용할 수 있습니다. 성숙한 ECM 성분에는 콜라겐-I, 히알루론산, 피브로넥틴 및 라미닌이 포함됩니다.

서문

췌장암의 나쁜 예후는 다양한 이유와 관련이 있으며, 그 중 하나는 쉽게 감지할 수 있는 바이오마커가 부족하여 늦게 발견된다는 것입니다. 또 다른 주요 원인은 조직을 둘러싸고 있는 두꺼운 기질로 인해 혈액 공급이 감소하기 때문입니다. 다량의 세포외기질(ECM)의 침착, 세포-세포 상호작용, 내피세포, 다양한 면역세포, 주위세포, 증식하는 근섬유아세포 및 섬유아세포 집단, 비종양 세포의 존재(함께 탈형성 반응을 구성)¹는 PDAC의 화학요법 및 방사선 치료 내성을 담당하는 두꺼운 기질을 구성합니다². 암과 기질 세포는 복잡하고 동적이며 양방향 상호 작용을 합니다. 일부 요소는 질병 진행을 약화시키거나 가속화하지만, 대부분의 과정은 종양의 발달 과정에서 적응합니다¹. 이는 성장 인자, 전구 혈관 생성 인자, 프로테아제 및 접착 분자가 풍부한 환경을 제공합니다. 이러한 요인은 혈관 신생, 세포 증식, 전이 및 침입을 촉진합니다 ^3,4. 이들은 함께 종양에 대한 면역 및 약물 특권의 피난처가 되어 약물 내성을 ....

프로토콜

1. 2D 세포 배양

1. 멸균 상태에서 10% 소 태아 혈청(FBS)이 보충된 Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)에서 PANC-1 세포를 성장시킵니다. 통로 전에 최대 70%-80%의 밀도를 키우고 20^{번째 통로 이상} 은 사용하지 마십시오. 4.2.1단계에 설명된 프로세스를 참조하십시오.
   참고: 기준점으로, 20mL 배지에 있는 1 x 10⁶ 세포는 70-80% 밀도에 도달하는 데 약 2-3일이 필요합니다.
2. 멸균 조건에서 제조업체에서 제공한 키트를 사용하여 2% FBS, 1% PenStrep 및 1% SteCGS(Stellate Cell Growth Supplement)가 보충된 성상 세포 배지에서 HPaSteC 세포를 성장시킵니다. 4.2.2단계에 표시된 대로 제조업체의 지침(일부 수정 포함)에 따라 Poly-L-Lysine 코팅 플라스크에서 성장합니다.
   1. 트립신 중화 용액(TNS)이 사용되므로 제조업체의 프로토콜에서 트립신화 중 FBS 중화 단계를 건너뜁니다. 단계 4.2.2.2에 설명된 대로 TNS 10mL의 전체 부피로 세포 현탁액을 중화합니다.
      참고: 기준점으로, 20m....

토론

스페로이드를 성장시키기 위해 선택된 지속 시간 및 세포 비율은 이전에^{보고된 38}건의 연구를 기반으로 했습니다. HPaSteC 세포를 NIH3T3 세포로 대체하여 이러한 연구를 최적화하려고 시도했을 때, PANC-1: HPaSteC 비율이 120:60일 때 스페로이드 부피 및 세포사멸 패턴이 보고된 최적화된 매개변수(PANC-1: NIH3T3:: 120:12에 대해 보고됨)와 매우 유사한 것으로 나타났?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Axio Observer inverted microscope	Carl Zeiss	0450-354
Cellometer Auto T4	Nexcelom Bioscience LLC	Auto-T4
DMEM, powder, high glucose	Gibco	12100046
Donkey anti-sheep conjugated with Alexa Fluor 568	Abcam	ab175712
Fetal Bovine Serum	Cytiva	SH3091003HI
Goat antirabbit IgG labeled with Alexa Fluor 488	Abcam	ab150077
Hanks Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco	14175145
Human Pancreatic Stellate Cells (HPaSteC)	ScienCell	3830
Microscope Nikon	Nikon	Eclipse Ts 100
Nunc 96-Well Polystyrene Round Bottom Microwell Plates	Thermo Scientific	12-565-331
Olympus Fluoview FV1200 confocal laser	Olympus	N/A	Discontinued product
PANC-1	ATCC	CRL-1469
Poly-HEMA	Sigma	P3932
Rabbit polyclonal anti-laminin antibodies	Abcam	ab11575
Rabbit polyclonal anti-type I collagen antibodies	Abcam	ab34710
Sheep polyclonal anti-hyaluronic acid antibodies	Abcam	ab53842
Stellate cell media complete kit	ScienCell	5301
Trypsin	MP Biomedicals, LLC	153571	Trypsin solution prepared according to manufacturers protocol and used at 0.25%w/v
Trypsin Neutralization Solution (TNS)	ScienCell	103