수모세포종(Medulloblastoma)의 페롭토시스 표현형(Ferroptotic Phenotype) 밝혀짐

요약

지질 하이드로퍼옥사이드 함량은 페롭토틱 세포 사멸의 가장 일반적으로 사용되는 지표를 나타냅니다. 이 기사는 페롭토시스 유도 시 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 함량에 대한 단계별 유세포 분석을 보여줍니다.

초록

철과 산소의 상호 작용은 지구상의 생명 발달에 필수적인 부분입니다. 그럼에도 불구하고 이 독특한 화학 물질은 계속해서 매혹적이고 당혹스러워하며 새로운 생물학적 모험으로 이어지고 있습니다. 2012년, 컬럼비아 대학의 한 연구팀은 이러한 상호작용을 "페롭토시스(ferroptosis)"라는 새로운 유형의 조절 세포 사멸로 이끄는 중심 사건으로 인식했습니다. 페롭토시스의 주요 특징은 (1) 항산화 방어 기능 장애 및/또는 (2) 압도적인 산화 스트레스로 인한 지질 하이드로퍼옥사이드의 축적이며, 이는 세포 내 유리 불안정한 철 함량 증가와 가장 빈번하게 일치합니다. 이는 일반적으로 시스틴 수송체 xCT, 글루타티온(GSH) 및 GSH 퍼옥시다제 4(GPx4)로 구성된 표준 항페롭토틱 축에 의해 방지됩니다. 페롭토시스(ferroptosis)는 프로그래밍된 유형의 세포 사멸이 아니기 때문에 세포사멸(apoptosis)의 특징적인 신호 전달 경로를 포함하지 않습니다. 이러한 유형의 세포 사멸을 증명하는 가장 일반적인 방법은 친유성 항산화제(비타민 E, 페로스타틴-1 등)를 사용하여 예방하는 것입니다. 이 분자는 원형질막의 산화 손상에 접근하여 해독할 수 있습니다. 페롭토틱 표현형을 밝히는 또 다른 중요한 측면은 특정 염료 BODIPY C11이 사용되는 지질 하이드로퍼옥사이드의 선행 축적을 검출하는 것입니다. 본 논문은 야생형 수모세포종 세포에서 에라스틴(erastin), RSL3, 철 공여체(iron-donor) 등 다양한 유도 인자를 사용하여 페롭토시스(ferroptosis)를 유도하는 방법을 보여줍니다. 마찬가지로, NAC가 있는 곳에서 성장하고 NAC가 제거된 후 페롭토시스(ferroptosis)를 겪는 xCT-KO 세포가 사용됩니다. 특징적인 "버블링(bubbling)" 표현형은 페롭토시스(ferroptosis)가 촉발되는 순간으로부터 12-16시간 이내에 광학 현미경으로 볼 수 있습니다. 또한 BODIPY C11 염색 후 FACS 분석을 통해 PI 염색법을 사용하여 지질 하이드로퍼옥사이드의 축적과 그에 따른 세포 사멸을 보여줍니다. 세포 사멸의 페롭토시스 특성을 입증하기 위해 페로스타틴-1은 특정 페롭토시스 예방제로 사용될 것입니다.

서문

페롭토시스(Ferroptosis)는 새롭게 맥락화된 활성산소종(ROS) 의존적 유형의 세포 사멸이다¹. ROS 외에도 철은 이러한 유형의 세포 사멸에서 중요한 역할을 하므로²라는 이름이 붙었습니다. 페롭토시스(ferroptosis)의 마지막 단계는 원형질막에서 지질의 산화적 손상이 철 촉매로 축적되는 것으로, 이는 결국 막의 무결성 손상과 선택적 투과성, 그리고 마지막으로 기포에 의한 세포 사멸로 이어집니다. 지질 하이드로퍼옥시드 현상은 자연적으로 발생하는 현상입니다. 그러나 세포막을 통한 증식은 세포의 항산화 방어에 의해 방지됩니다. 이러한 맥락에서 주요 역할을 하는 것은 Se-protein glutathione peroxidase 4 (GPx4)로, 막에 접근하여 지질 하이드로퍼옥사이드를 독성이 덜한 알코올 유도체로 전환할 수 있습니다³. GPx4의 환원력은 주로 비필수 아미노산인 글리신, 글루타메이트, 시스테인으로 구성된 트리펩타이드인 글루타치온(GSH)에 의해 제공되지만 배타적이지는 않습니다. GSH의 생합성을 위한 속도 제한 아미노산은 시스테인⁴입니다. 시스테인은 비필수 아미노산으로 분류되지만, 그 요구량은 증식성이 높은 세포(예: 암세포)에서 내부 생성을 쉽게 초과할 수 있습니다. 따라서 그것은 semi-essential 아미노산 그룹으로 재분류되었습니다. 시스테인의 필요한 수입은 주로 Xc- 시스템을 통해 발생하며, 이는 글루타메이트 수출을 희생하면서 산화된(우성) 형태의 시스테인(일명 시스틴)을 수입할 수 있게 해준다⁵. Xc- 시스템은 xCT로 알려진 Na+-독립, Cl--종속 수송 소단위와 CD98로 알려진 샤페론 소단위로 구성됩니다. 최근까지 xCT-GSH-GPx4 축의 반-페롭토틱 특성은 독특하고 복제할 수 없는 것으로 여겨져 왔다⁶. 그러나 2019년에는 유비퀴놀(코엔자임 Q10)과 그 재생 효소인 페롭토시스 억제 단백질 1(FSP1)로 구성된 대체 항페롭토틱 경로가 설명되었습니다 ^7,8. 그 직후, GTP 사이클로하이드로라제-1/테트라하이드로바이오프테린(GCH1/BH4)과 관련된 또 다른 지질 하이드로퍼옥사이드 해독 시스템이 보고되었다⁹. 그럼에도 불구하고 페롭토시스 예방에서 xCT-GSH-GPx4 축의 중심적인 역할은 도전받지 않는 것으로 보입니다.

지난 10년 동안 페롭토시스는 다양한 종양 유형에서 광범위하게 연구되어 항암 전략으로서 큰 잠재력을 보여주었습니다(Lei et ^al.10 검토). 또한, 기존의 화학요법제에 대한 저항성이 높거나 전이 성향을 보이는 암세포는 GPx4 11,12,13 억제제와 같은 페롭토시스 유도제에 놀라울 정도로 민감하다는 보고가 있었습니다. 그러나 뇌종양의 맥락에서 페롭토시스 유도제의 잠재력은 대체로 연구가 부족한 상태로 남아 있습니다. 이러한 유형의 세포 사멸은 대뇌 허혈-재관류 손상(cerebral ischemia-refusion injury)¹⁴및 신경퇴행성 질환(neurodegenerative^diseases)15과 밀접한 관련이 있지만, 뇌종양의 맥락에서 그 잠재력은 주로 가장 흔한 악성 두개뇌 종양인 교모세포종(glioblastoma)에 국한되어 있다(Zhuo et al.16에 의해 검토됨). 한편, 가장 흔한 악성 소아 뇌종양이자 소아 사망률의 주요 원인인 수모세포종(medulloblastoma)이 페롭토시스 유발인자에 대한 민감성은 대부분 연구되지 않은 상태로 남아 있습니다. 우리가 아는 한, 페롭토시스와 수모세포종을 연결하는 동료 심사 문헌은 거의 없습니다. 그럼에도 불구하고 일부 연구에서는 철분이 수모세포종과 교모세포종 암 줄기 세포(CSC)의 생존, 증식 및 종양 생성 가능성에 중요한 역할을 한다는 것을 밝혀냈습니다.^17,18 이로 인해 페롭토시스 유도에 더 취약해질 수 있습니다. 이는 수모세포종(medulloblastoma)이 종양 화학저항성, 전파 및 재발의 주요 원인이 되는 것으로 보이는 CSC(tumor-initiating/propagating cells)의 하위 집단으로 악명이 높기 때문에 특히 중요하다¹⁹.

페롭토시스 유도에 대한 민감도는 일반적으로 세포 사멸로 이어질 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 지질 하이드로퍼옥사이드 함량/축적을 측정하여 조사합니다. 가장 일반적으로 사용되는 페롭토시스 유도제는 (1) xCT 수송체²⁰의 억제제인 에라스틴, (2) GPx4 효소²의 억제제인 RSL3 및/또는 (3) 구연산제철암모늄(FAC)²¹과 같은 철 공여체입니다. 지질 하이드로퍼옥사이드 함량은 선택적 프로브 BODIPY 581/591 C11²²를 사용하여 평가하며, 이 프로브는 감소된 상태에서 581/591nm에서 여기 및 방출 최대값을 갖습니다. 지질 하이드로퍼옥사이드와의 상호 작용 및 산화에 의해 산화되면 프로브는 여기 및 방출 최대값을 488/510nm로 이동합니다. 전형적으로, 지질 하이드로퍼옥사이드 함량의 현저한 증가는 페롭토틱 세포 사멸에 선행합니다. 페롭토시스는 프로그래밍된 세포 사멸이 아니기 때문에 페롭토시스 실행으로 이어지는 분자 신호 전달 캐스케이드가 없습니다. 따라서 이를 확인할 수 있는 유일한 방법은 지질 하이드로퍼옥사이드 함량을 모니터링하고 이러한 유형의 세포 사멸에 대해 페로스타틴 1²³과 같은 특정 억제제를 사용하는 것입니다. 페로스타틴 1은 세포의 지질 구획에 침투하여 지질 하이드로퍼옥사이드를 해독하여 페롭토시스 사건을 예방할 수 있는 친유성 항산화제입니다.

프로토콜

본 연구는 8% FBS가 보충된 DMEM 배지에서 5% CO₂ 로 37°C에서 배양한 DAOY 야생형(WT) 수모세포종 세포주를 사용하여 수행되었습니다. xCT 결실 세포주는 1mM N-아세틸시스테인(NAC)이 보충된 배지에서 실험을 수행하여 동일한 조건에서 유지되었습니다. 세포는 상업적으로 이용 가능한 마이코플라스마 검출 키트( 재료 표 참조)를 사용하여 마이코플라스마에 대해 정기적으로 스크리닝하고 10^번째 통로까지 배양했습니다.

1. 세포 수확 및 파종

알림: 모든 단계는 조직 배양 층류 후드에서 멸균 무균 기술을 사용하여 수행됩니다. DAOY 수모세포종 세포는 부착성이 있어 부착되지 않은 모든 세포는 Ca²⁺ 및 Mg²⁺ 없이 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하여 폐기할 수 있습니다.

1. 셀과 함께 스톡 접시(페트리 접시, 직경 100mm)를 취하고 흡인기기를 사용하여 플레이트에서 부유 셀과 매체를 제거합니다.
2. 접시에 5-10mL의 PBS를 추가하고 접시를 원을 그리며 바닥을 씻은 다음 흡인기기를 사용하여 접시에서 PBS를 제거합니다.
3. 접시에 트립신 1mL(10배 희석)를 추가합니다. 접시를 부드럽게 두드리면 세포가 제거될 때까지 접시를 배양합니다. 8% FBS가 보충된 DMEM 배양 배지 10mL를 취하고 접시에서 세포를 기계적으로 수확합니다.
4. 세포 현탁액을 15mL 튜브에 옮깁니다.
5. 셀 현탁액 500μL를 취하여 계수를 위해 큐벳에 넣습니다. 세포 현탁액의 mL당 세포 수를 계산합니다. 이 연구에는 자동화된 세포 계수기가 사용되었습니다( 재료 표 참조).
6. 1,00,000개의 세포를 갖기 위해 세포 현탁액에서 취하는 데 필요한 부피를 계산합니다.
7. 6-웰 플레이트를 가져와서 계산된 세포 현탁액의 부피를 각 웰에 추가한 다음 각 웰에 2mL에 8% FBS가 보충된 DMEM 배양 배지를 추가합니다.

2. 세포의 처리

알림: 제어 및 치료는 세 번에 걸쳐 수행됩니다. 그룹은 다음과 같습니다 : 대조군 (DMSO), 에라스틴 1 μM, RSL3 0.3 μM, FAC 250 μM, 페로 스타틴 1 2 μM, 에라스틴 1 1 μM 1 μM 1 μM 0.3 μM RSL3 + 페로 스타틴 1 2 μM, FAC 250 μM + 페로 스타틴 2 μM 1. 표 1)에 표시된 것처럼 실험에는 4개의 6웰 플레이트가 필요합니다. 필요한 모든 시약의 상업적 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 파종 후 24 시간, 세포가있는 우물에 해당 처리를 추가하십시오.
2. 인큐베이터에서 37 ° C와 5 % CO₂ 로 접시를 두십시오.

3. BODIPY 581/591 C11 프로브를 사용한 처리된 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 염색

참고: 지질 하이드로퍼옥사이드 특이적 프로브의 원액은 1mM 농도로 DMSO에서 제조됩니다. 원액의 부분 표본은 -20 °C에서 불투명 튜브에 보관됩니다. 염색을 위해 8% FBS가 보충된 DMEM 매체에 프로브의 2μM 작업 용액을 준비합니다.

1. 처리 6시간 후, 광학 현미경으로 세포를 관찰합니다(세포 반올림이 보여야 함).
2. 인큐베이터에서 접시를 제거하고 조직 배양 층류 후드에 넣습니다.
   흡입기를 사용하여 매체와 부동(죽은) 세포를 제거합니다.
3. 각 웰에 PBS 2mL를 부드럽게 추가하고 6웰 플레이트를 원을 그리며 바닥을 세척한 다음 흡입기를 사용하여 웰에서 PBS를 제거합니다.
4. 프로브의 작업 용액 2mL를 추가합니다(FBS가 보충된 DMEM의 최종 농도 2μM).
5. 접시를 37 ° C와 5 % CO₂ 의 인큐베이터에 어두운 곳에서 30 분 동안 그대로 두십시오 (접시는 알루미늄 호일로 싸서 사용할 수 있음).

4. 처리된 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 함량에 대한 유세포 분석

알림: 다음 단계는 모두 어두운 곳에서 수행됩니다(층류 후드에 조명 없음).

1. 인큐베이터에서 접시를 꺼내 조직 배양 층류 후드에 넣습니다.
   흡입기를 사용하여 염색 용액을 제거합니다.
2. 각 웰에 PBS 2mL를 부드럽게 추가하고 6웰 플레이트를 원을 그리며 바닥을 세척한 다음 흡입기를 사용하여 웰에서 PBS를 제거합니다.
3. 세척 단계를 한 번 더 반복하고 흡인기기를 사용하여 웰에 남아 있는 PBS를 흡인합니다.
4. 각 웰의 바닥에 시중에서 판매되는 세포 해리 시약 150μL( 재료 표 참조)를 추가하고 플레이트를 부드럽게 두드려 세포가 제거될 때까지 플레이트를 배양합니다. 250μL의 FACS 완충액(PBS, 2mM EDTA, 0.5% BSA)을 웰에서 기계적으로 수확합니다.
5. 필터 캡이 있는 해당(이전에 표시된) FACS 튜브로 세포를 옮깁니다. 분석이 수행될 때까지 세포가 있는 튜브를 어두운 곳에서 얼음 위에 놓습니다(분석은 염색 후 한 시간 이내에 수행해야 함).
   알림: FACS 기계 설정 및 보정은 사용하는 기계에 따라 다릅니다( 재료 표 참조).
6. 새 실험을 만들고 이름을 지정합니다(DAOY의 페롭토시스 - 지질 하이드로퍼옥사이드).
7. 실험 설계에서 레이저(488nm)와 필터(FITC)를 선택합니다.
8. 데이터 보기에서 적절한 셀 크기(>12μm)를 선택하고, PMT 전압을 설정하고(셀 모집단은 SSC-H/FSC-H 도트 플롯의 첫 번째 사분면에 나타나야 함) 도트 플롯을 게이트합니다.
9. y축과 로그 스케일에 FITC-A가 있는 새 플롯 히스토그램을 추가합니다.
10. FACS 튜브의 샘플을 소용돌이치게 하고 FACS 기계에 넣고 샘플을 로드합니다. 10,000개의 FSC singlet 이벤트를 기록하고 파일 이름을 지정합니다(예: DAOY WT CTL 6h). 파일을 .fcs로 내보냅니다.

5. 처리 시 죽은 세포의 프로피듐 요오드화물(PI) 염색

참고: 실험 설계는 지질 하이드로퍼옥사이드 측정과 정확히 동일합니다(1단계 및 2단계 참조).

1. 파종 후 24시간 후에 인큐베이터에서 접시를 꺼내 층류 후드에 넣습니다.
2. 15mL 튜브에 배지(죽은 세포 포함)를 수집합니다.
3. 각 웰에 1mL의 PBS를 추가하고 6웰 플레이트의 원형 움직임으로 바닥을 세척한 다음 PBS를 해당 매체와 함께 튜브에 수집합니다.
4. 각 웰의 바닥에 200μL의 트립신(10배 희석)을 추가하고 플레이트를 부드럽게 두드려 세포가 제거될 때까지 플레이트를 배양합니다. 해당 매체 + PBS를 사용하여 웰에서 세포를 수확합니다.
5. 셀 현탁액을 실온에서 10분 동안 180 x g 으로 원심분리합니다. 흡입기를 사용하여 상층액을 제거합니다.
6. 세포 펠릿을 300μL의 FACS 완충액에 재현탁시키고 분석할 때까지 얼음 위에 놓습니다.
7. 분석 직전에 PI 용액( 재료 표 참조)을 최종 농도 2μg/mL에 추가합니다.

6. 처리 후 24시간 동안 죽은 세포의 유세포 분석

알림: FACS 기계 설정 및 보정은 이전에 표시된 대로 수행됩니다(4단계 참조).

1. 새 실험을 만들고 이름을 지정합니다(DAOY의 Ferroptosis - 세포 사멸).
2. 실험 설계에서 레이저(488nm)와 필터(PE)를 선택합니다.
3. 데이터 보기에서 적절한 셀 크기(>12μm)를 선택하고, PMT 전압을 설정하고(셀 모집단은 SSC-H/FSC-H 도트 플롯의 첫 번째 사분면에 나타나야 함) 도트 플롯을 게이트합니다.
4. y축과 로그 스케일에 PE-A가 있는 새 플롯 히스토그램을 추가합니다.
5. FACS 튜브의 샘플을 소용돌이치게 하고 FACS 기계에 넣고 샘플을 로드합니다.
6. 10,000개의 FSC singlet 이벤트를 기록하고 파일 이름을 지정합니다(예: DAOY WT CTL 6h). 파일을 .fcs로 내보냅니다.

7. DAOY xCT-/- 세포의 지질 하이드로퍼옥사이드 함량에 대한 유세포 분석

참고: xCT-^/- 셀은 앞서 설명한 대로 생성되었습니다²⁴.

1. 이 실험을 위해 2단계에서 지시한 대로 세포를 파종하되 처리 대신 하룻밤 동안 1mM NAC를 배지에 보충합니다.
2. 다음 날, 한 그룹에서는 NAC를 유지하고 다른 그룹에서는 NAC를 제거합니다.
3. 6단계에서 설명한 것과 정확히 동일한 방식으로 지질 하이드로퍼옥사이드 함량의 유세포 분석을 수행합니다.

8. 유세포 분석기 결과 분석

1. FlowJo 소프트웨어에서 .fcs 문서를 엽니다( 자료 표 참조).
2. 개별 파일을 두 번 클릭하여 개별 샘플(SSC-A/FSC-A 도트 플롯)에 기록된 모든 이벤트(FCS 싱글렛뿐만 아니라)를 엽니다. 기계에서 수행된 게이팅이 유지되지 않도록 설정되어 있으므로 게이트를 다시 한 번 만들고 모집단의 이름을 지정해야 합니다(예: DAOY WT).
3. 제어된 모집단을 두 번 클릭하여 히스토그램이 있는 다른 창을 엽니다.
4. Y축을 사용하는 형광 필터(Comp-FITC/PE-A)로 변경합니다.
5. X축을 모달 로 변경합니다(각 피크를 해당 모드로 정규화, 즉 특정 bin에 있는 최대 셀 수의 %로 정규화).
6. 히스토그램을 레이아웃 편집기에 복사합니다. 모든 샘플에 대해 이 작업을 반복하고 레이아웃 편집기에 새 히스토그램을 붙여넣을 때마다 이전 히스토그램 위로 드래그하여 히스토그램이 오버레이(절반 오프셋)되도록 합니다.

결과

수모세포종 세포주 DAOY는 약 60%의 밀도에 도달할 때까지 8% FBS가 보충된 표준 DMEM 배지에서 배양되었습니다. 실험 당일, 세포를 수확하고, 웰 당 1,00,000 개의 세포를 표 1에 따라 6-웰 플레이트에 도말하였다. 다음 날, 세포(삼중)를 1μM의 에라스틴, 0.3μM의 RSL3 또는 250μM의 FAC로 처리했습니다. 그런 다음 플레이트를 37°C 및 5%_CO2의 인큐베이터에 넣었습니다. 6시간 후,

토론

ferroptotic cell death의 주요 특징은 원형질막에 지질 하이드로퍼옥사이드가 통제되지 않고 축적된다는 것입니다. 이러한 산화적 손상은 효소 또는 비효소 방식으로 발생할 수 있지만, 두 경우 모두 반응은 철 의존적/촉매 작용을 통해 발생하며, 이는 이러한 유형의 세포 사멸의 이름을 설명합니다. 지질 하이드로퍼옥데이션은 종종 4-하이드록시-2,3-트랜스-노네날(4-HNE) 또는 말론알데히드(MDA)와 같은 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
BODIPY 581/591 C11	Thermo Fisher	D3861
Cell counter	Beckman	Coulter Z1
DMEM medium	Gibco	10569010
Erastin	Sigma-Aldrich	E7781-5MG
Ferroamminium citrate	Acros Organics	211842500
Ferrostatin-1	Sigma-Aldrich	SML0583-25MG
Fetal bovin serum (FBS)	Dominique Dutcher	500105N1N
Flow Cytometer	BD Biosciences	FACS Melody
Gibco StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Thermo Fisher	11599686
N-acetylcysteine	Sigma-Aldrich	A7250
PlasmoTest Mycoplasma Detection Kit	InvivoGen	rep-pt1
propidium iodide	Invitrogen	P3566
RSL3	Sigma-Aldrich	SML2234-25MG
Trypsin - EDTA 10X - 100 mL	Dominique Dutcher	X0930-100