Bio-Hybrid Mosquito Stinger-Based Atomic Force Microscopy Probe 개발

요약

곤충에 물리는 행동에 대한 정량적 및 통제된 조사는 매개체 매개 질병과 싸우기 위한 효과적인 전략을 고안하는 데 중요합니다. 이러한 맥락에서 바이오 하이브리드 원자력 현미경(AFM) 프로브를 제작하는 방법이 소개됩니다.

초록

질병을 전염시키는 능력으로 인해 인간에게 가장 치명적인 동물로 악명 높은 모기는 공중 보건에 지속적인 도전을 제기합니다. 현재 사용되고 있는 주요 예방 전략은 화학 퇴치제와 관련이 있는데, 이는 모기가 빠르게 내성을 갖게 됨에 따라 효과가 없는 것으로 판명되는 경우가 많습니다. 따라서 새로운 예방 방법의 발명이 중요합니다. 이러한 개발은 모기에 물리는 행동에 대한 철저한 이해에 달려 있으며, 제어 가능한 테스트 매개변수와 정량적 측정을 통해 실제 무는 시나리오를 정확하게 복제하는 실험 설정이 필요합니다. 이 간극을 메우기 위해 생체 하이브리드 원자력 현미경(AFM) 프로브가 설계되었으며, 이 프로브의 끝에는 생물학적 침, 특히 모기 소음순이 있습니다. 표준 AFM 시스템과 호환되는 이 바이오 하이브리드 프로브는 모기 침투 행동에 대한 거의 실제적인 시뮬레이션을 가능하게 합니다. 이 방법은 무는 메커니즘에 대한 정량적 연구에서 한 걸음 더 나아간 것으로, 잠재적으로 매개체 매개 질병(VBD)에 대한 효과적인 장벽을 만들고 모기 매개 질병과의 싸움에서 새로운 길을 열 수 있습니다.

서문

세계보건기구(WHO)는 매개체 매개 질병(VBD)이 모든 전염병의 17% 이상을 차지하며, 전 세계적으로 매년 7,00,000명 이상의 사망을 초래한다고 보고했습니다. 예를 들어, 세계에서 가장 치명적인 동물인 모기는 뎅기열, 말라리아, 지카 바이러스와 같은 수많은 병원체를 혈액을 먹는 절지동물을 통해 퍼뜨려 매년 7억 건의 감염을 일으킵니다¹. VBD를 예방하기 위한 효과적인 조치를 개발하기 위한 탐색은 매우 중요하며, 여기에는 모기의 침투 행동을 모방하여 무는 메커니즘을 조사하고 침투 방지 효과를 입증하기 위한 잠재적 장벽에 대한 연구를 포함합니다. 한 가지 주요 과제는 이러한 조사를 수행하기 위한 적절한 접근 방식을 개발하는 것입니다. 모기 침의 기하학을 닮은 마이크로 스케일 바늘의 개발을 포함하여 문헌에 대한 노력이 이루어졌습니다. 그러나 이러한 미세 바늘을 만드는 데 사용되는 많은 재료(즉, 점탄성 재료², 실리콘(Si), 유리, 세라믹³ 등)은 모기의 주둥이의 생물학적 재료와 다른 기계적 특성을 가지고 있습니다. 공학적 재료는 부서지기 쉽고 파괴 및 좌굴이 발생하기 쉬우며^3,4 모기의 주둥이는 파괴 또는 좌굴을 더 잘 견딜 수 있습니다⁴. 공학적 재료 대신 모기의 소음순을 사용하는 바이오 하이브리드 프로브의 이점은 모기의 관통 메커니즘을 보다 정확하게 표현할 수 있다는 것입니다. 또한 force⁵의 정확한 측정과 같은 정량적 연구를 수행하기 위해 특수 도구를 마이크로 니들과 통합해야 하며, 이는 엔지니어링된 마이크로니들을 사용하는 맞춤형 설정으로는 쉽게 달성할 수 없습니다.

원자력 현미경(AFM) 기반 접근 방식은 초미세 팁이 있는 캔틸레버를 사용하여 샘플 표면 가까이에 조심스럽게 배치한다는 점에서 유망합니다. 팁은 표면을 가로질러 스캔하거나 표면 쪽으로/밀어낼 수 있으며^{, 샘플6}과의 상호 작용으로 인해 다양한 인력 또는 반발력을 경험할 수 있습니다. 이러한 상호 작용은 캔틸레버의 편향으로 이어지며, 이는 캔틸레버의 상단에서 광검출기⁽⁶)로 레이저 빔이 반사됨으로써 추적됩니다. 시스템의 움직임에 대한 탁월한 민감성을 통해 AFM은 피코미터 정확도를 사용한 형태학적 매핑, 피코네톤에서 마이크로뉴턴에 이르는 힘 측정, 포괄적인 다중물리학 조사를 포함하되 이에 국한되지 않는 다양한 측정을 수행할 수 있습니다⁷. 예를 들어, AFM 압흔을 수행하여 샘플에 가해진 힘에 대한 반응을 정확하게 평가하고 적절한 분석 모델⁸과 결합하여 샘플의 경도, 탄성 및 기타 기계적 특성을 측정할 수 있습니다. AFM의 프로브는 가장 일반적으로 실리콘 (Si) 또는 실리콘 질화물 (Si₃N₄) ⁸ 로 만들어지며, 길이는 20-300 μm⁹ 이고 팁 반경은 수 내지 수십 나노 미터⁽¹⁰) 정도입니다. 나노미터 스케일 팁 반경은 고해상도 이미징과 같은 응용 분야에 이상적일 수 있습니다. 그러나 강성, 반경, 모양 및 종횡비 측면에서 침투 행동을 모방하려는 연구를 위한 생물학적 침의 특성을 가지고 있지 않습니다. 예를 들어, 모기의 미세바늘 구조는 종횡비가 ~60¹¹ (길이 ~1.5mm에서 2mm, 지름 ~30μm)¹²인 근막입니다. 기존의 AFM 프로브는 소음순과 같은 생물학적 침과 유사하다고 가정할 수 있지만, 그 고유한 재료 특성과 치수는 교합 중 실제 상황을 반영하지 않습니다.

곤충이나 다른 동물이 침을 쏘는 생물학적 물림을 모방하는 침투 행동에 대한 정량적 연구를 가능하게 하기 위해 여기에서는 팁에 생물학적 침을 사용하여 바이오 하이브리드 AFM 캔틸레버를 제작하는 공정을 개발했습니다. 사례 연구로, 모기 관절와순의 끝이 부착된 AFM 캔틸레버가 성공적으로 시연되었습니다. 모기가 희생자^{의 피부를} 뚫기 위해 사용하는 전형적인 삽입력에 대한 문헌의 기존 정보를 활용하는 이 바이오 하이브리드 AFM 캔틸레버는 잠재적으로 일반 AFM에서 모기에 물린 상처를 거의 실제와 같은 모방을 가능하게 할 수 있습니다. 바이오 하이브리드 AFM 캔틸레버를 제작하기 위해 마이크로 생물학적 스팅어를 활용하는 프로토콜은 다양한 무는 메커니즘의 정량적 조사를 위한 다른 날카로운 스팅어 기반 바이오 하이브리드 AFM 캔틸레버의 개발에도 적용될 수 있습니다.

용어
주둥이와 그 관심 구성 요소의 개략도는 그림 1에 나와 있으며, 그 정의는 (1) 주둥이: 모기의 입에서 모기가 스스로 먹이를 먹을 수 있도록 하는 신체 부위로, 근막(핵심)과 소음순(껍질)으로 구성된 코어 껍질 구조를 가지고 있으며, (2) 소음순: 주둥이의 어둡고 뭉툭한 외부 덮개², (3) 근막: 소음순 내부에 들어있는 가느다란 바늘 그룹으로, 2개의 상악골, 2개의 하악골, 1개의 하인두, 1개의 관절와순², (4) 하인두: 숙주의^혈류로 타액을 분비하는 역할을 하는 2, (5) 상악골: 섭식 메커니즘을 돕는 톱니 모양의 부재², (5) 하악골: 상악골과 유사하며, 모기의 섭식 메커니즘을 돕고 끝이 뾰족합니다², (6) 관절와순 : 상악골, 하악골 및 하인두보다 훨씬 큰 희생자의 피부를 관통하는 주요 부재. 또한 피부 아래의 혈관과 내부 채널을 찾을 수 있는 감각 구조를 가지고 있습니다², (7) 매니퓰레이터: 위치 지정을 위한 3자유도 및 미크론 단위의 정확도를 가진 어셈블리로 XYZ 방향으로 이동할 수 있습니다. (8) 클램프 어셈블리: 실험 중 팁이 없는 AFM 캔틸레버를 클램핑하는 데 사용되는 매니퓰레이터에 장착된 맞춤형 2파트 클램프입니다.

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프로토콜

이 프로토콜에 사용된 모기 종은 감염되지 않은 성인 암컷 Aedes aegypti (A. aegypti)로, 냉동 보관되어 -20°C 온도의 냉동고에 보관되었습니다. 이 종은 BEI Resources, NIAID, NIH: UNINFECTED AEDES AEGYPTI, Strain Black Eye Liverpool (Frozen), NR-48920을 통해 배포하기 위해 NIH/NIAID Filariasis Research Reagent Resource Center에서 제공했습니다. 연구에 사용된 시약 및 장비는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 주둥이에서 소음순을 절개하기

1. 핀셋을 사용하여 현미경 아래의 유리 슬라이드에 죽은 모기를 놓고 코끝 부분에 끝이 가늘어지는지 확인합니다(그림 2A).
2. 모기를 유리 슬라이드에 유지하면서 메스 날을 모기의 머리 근처 소음순 위에 부드럽게 놓습니다(그림 2B).
3. 소음순의 두께를 통한 얕은 침투 깊이로 소음순의 상반부 전체를 절개(약 80μm 절단)합니다. 칼날에 가벼운 압력을 가하여 소음순만 절단하고 그 아래에 있는 근막은 절단하지 않도록 하십시오.
4. 한 쌍의 핀셋으로 모기의 머리를 단단히 잡고 다른 정밀 핀셋으로 가늘어진 끝과 절개 위치 사이의 어느 위치에서나 소음순을 가볍게 꼬집습니다(그림 2B).
   1. 소음순을 잡고 있는 핀셋을 테이퍼 팁 방향으로 당깁니다(그림 2C). 소음순이 찢어지고 근막에서 완전히 제거될 때까지 핀셋을 계속 당깁니다.
5. 모기를 현미경 아래에 놓고 소음순의 끝이 있는지 확인합니다. 이는 근막에 테이퍼형 팁이 있는 것으로 식별할 수 있습니다(그림 2D).

2. 소음순의 끝부분을 다른 근막 부재와 분리

1. Clamp 정밀 핀셋 세트의 끝을 닫고 핀셋 끝을 끝 근처의 소음순 바로 옆에 놓습니다.
2. 핀셋 팁을 사용하여 근막의 길이에 수직인 방향으로 관절와순에 부드러운 힘을 가합니다(그림 3A).
3. 다른 근막 부재로부터 관절와순이 분리될 때까지 유리 슬라이드를 가로질러 관절와순을 계속 밀어 넣습니다.
4. 현미경으로 샘플을 검사하여 소음순과 다른 근막 부재 사이의 적절한 분리가 이루어졌는지 확인합니다(그림 3, 왼쪽). 분리에 실패하면 2.1단계를 다시 참조하십시오.

3. 관절와순의 끝 부분 절단

1. 소음순이 유리 슬라이드에 있는 동안 소음순 끝에서 약 ~200μm 떨어진 곳에서 소음순 위에 메스 날을 놓습니다(그림 4A). 부드럽게 충분한 압력을 가하고 관절와순의 끝을 완전히 자릅니다. labrum tip은 가능한 한 짧아야 하는 것이 이상적이지만 ~200μm가 현재 접근 방식이 처리할 수 있는 최상의 방법입니다.
2. 디지털 측정 소프트웨어를 사용하여 절단된 소음순의 길이를 측정하여 길이가 300μm를 넘지 않는지 확인합니다(그림 4B). 이 프로토콜에서 ImageJ는¹⁴로 사용되었습니다.

4. 관절와순의 끝을 잡습니다.

1. 한 쌍의 정밀 핀셋을 사용하여 유리 슬라이드에서 labrum의 팁을 찾아 격리합니다. 관절와순의 끝 부분을 제외한 유리 슬라이드에 남아 있는 모든 부품을 폐기합니다.
2. 동일한 정밀 핀셋을 사용하여 절단된 끝이 자유롭고 핀셋에 의해 방해받지 않도록 관절와순을 천천히 가볍게 꼬집습니다. 또한 소음순의 방향이 핀셋의 길이 방향과 평행하고 소음순의 절단된 끝이 핀셋 본체에서 멀어지도록 합니다.
3. 표본이 단단히 끼이면 핀셋의 팁을 함께 고정하고 있는 클램핑력을 제거합니다. 소음순의 끝은 핀셋의 팁 중 하나에 달라붙습니다.
4. 현미경으로 핀셋의 팁을 검사하고 소음순의 팁이 핀셋의 팁 중 하나에 있는지 확인합니다(그림 5). 소음순의 끝이 핀셋에 있지 않으면 4.2단계를 다시 참조하고, 소음순의 끝이 핀셋이나 유리 슬라이드에 있지 않으면 1단계를 다시 참조하십시오.

5. 팁리스 캔틸레버 빔에 에폭시 적용

1. 원래 병/용기에서 접착제를 직접 드롭 캐스팅하여 새 유리 슬라이드의 가장자리에 에폭시 한 방울(~0.05mL)을 놓습니다. 에폭시 함유 유리 슬라이드를 프로브 스테이션 아래에 놓고 초점을 맞춥니다.
2. 팁이 없는 AFM 캔틸레버를 cl에 장착amp베이스(즉, 더 큰 끝)를 고정하여 어셈블리를 조립하고 캔틸레버 끝을 자유롭게 하고 공간에 매달아 둡니다. AFM 캔틸레버의 바닥이 아래를 향하도록 합니다.
3. 매니퓰레이터를 프로브 스테이션에 장착합니다.
4. 매니퓰레이터의 Z축을 팁리스 캔틸레버가 에폭시 함유 유리 슬라이드보다 몇 밀리미터 위에 있는 위치로 올립니다.
5. 팁이 없는 캔틸레버가 프로브 스테이션에 있는 카메라의 필드 뷰에서 보이도록 매니퓰레이터를 수동으로 움직입니다.
6. 매니퓰레이터를 사용하여 캔틸레버 끝이 유리 슬라이드 가장자리의 에폭시 바로 위에 놓일 때까지 AFM 캔틸레버를 X 및 Y 방향으로 이동합니다.
7. 매니퓰레이터를 다시 사용하여 유리 슬라이드의 가장자리 위로 팁이 없는 캔틸레버를 Z 방향으로 천천히 내립니다.
8. 캔틸레버가 내려져 유리 슬라이드에 접근하면 캔틸레버가 처음 에폭시에 닿을 때까지 캔틸레버를 매우 천천히 계속 내립니다. 캔틸레버를 더 이상 내리지 마십시오.
9. 조심스럽게 매니퓰레이터를 사용하여 캔틸레버를 X 또는 Y 방향으로 천천히 움직이고 캔틸레버가 유리 슬라이드의 에폭시에서 완전히 분리될 때까지 선택한 방향으로 캔틸레버를 계속 움직여 에폭시 풀에서 캔틸레버를 제거합니다. 팁이 없는 캔틸레버는 팁에 프로브 스테이션 아래에서 볼 수 있는 소형 에폭시 기포가 있어야 합니다.
10. 매니퓰레이터를 사용하여 캔틸레버를 Z 방향으로 올립니다.

6. labrum의 팁을 팁이 없는 캔틸레버 빔에 접착

1. 캔틸레버의 장축을 중심으로 매니퓰레이터를 90도 회전하고 매니퓰레이터를 프로브 스테이션의 측면에 놓습니다. 이 구성에서 AFM 캔틸레버의 길이를 따른 두께는 수직 방향입니다.
2. labrum의 팁이 포함된 정밀 핀셋을 프로브 스테이션 카메라 아래에 배치하여 labrum 팁의 전체 길이가 컴퓨터 모니터에서 보이도록 합니다.
3. 클램프와 팁리스 캔틸레버를 프로브 스테이션 카메라 아래에 고정하는 매니퓰레이터 어셈블리를 배치하여 팁리스 캔틸레버의 전체 길이가 컴퓨터 모니터에 보이도록 합니다.
4. 프로브 스테이션 현미경을 labrum의 팁과 팁이 없는 캔틸레버에 초점을 맞춥니다.
5. 매니퓰레이터를 조심스럽게 수동으로 회전시켜 캔틸레버를 관절와순의 팁에 수직으로 배치합니다(그림 6A).
6. 매니퓰레이터의 자유도를 사용하여 캔틸레버의 접착제가 labrum 팁의 절단된 끝과 접촉하도록 팁이 없는 캔틸레버를 XY 방향으로 천천히 움직입니다(그림 6B).
7. 에폭시를 경화시켜 캔틸레버와 모기 labrum 사이의 교차점을 응고시킵니다.
8. 에폭시가 경화되면 매니퓰레이터를 XY 방향으로 부드럽게 맞물리고 캔틸레버를 핀셋에서 멀리 이동하여 래브럼의 팁이 없는 캔틸레버 빔에 서 있는지 확인합니다(그림 6C).

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결과

제작된 바이오 하이브리드 AFM 프로브의 주사전자현미경(SEM) 이미지는 그림 7에서 확인할 수 있습니다. labrum의 끝은 팁이 없는 캔틸레버 빔에 성공적으로 접착되었습니다. 모기 침의 자연스러운 곡률과 제시된 프로토콜의 수동 작동으로 인해 캔틸레버에 완벽하게 수직인 침 끝이 있는 캔틸레버를 얻는 것은 매우 어렵습니다. 스팅어와 캔틸레버에 수직인 가상의 중심선 사이?...

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토론

프로토콜의 1단계는 원치 않는 소음순의 생물학적 샘플을 청소하기 위한 것입니다. 이를 위해 소음순을 절개하지만 소음순 바로 아래에 있는 근막은 절개하지 않습니다(그림 1). 근막과 소음순이 경계면에서 서로 결합되어 있지 않기 때문에(즉, 소음순은 근막을 따라 자유롭게 미끄러질 수 있고 모기 머리에 부착되어야만 제자리에 유지됨) 수행된 절개는 소음순의 일부를 모...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-SA-SE Straight Tapered Ultra Fine-Pointed Tweezers	Excelta	N/A	For manipulating/dissecting the proboscis.
C-4D Probe station	Everbeing Int’l Corp	N/A	Used for AFM assembly.
Tipless Tapping Mode Cantilever	NanoAndMore USA	TL-NCH	AFM cantilever used for mounting the labrum. Specs are shown here: Shape: Beam Force Constant: 42 N/m (10 - 130 N/m) Resonance Frequency: 330 kHz (204 - 497 kHz) Length: 125 µm (115 - 135 µm) Width: 30 µm (22.5 - 37.5 µm) Thickness: 4 µm ( 3 - 5 µm)
UV Expoxy	Let's resin	ALR00146	For stinger attachment.