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요약

이 프로토콜은 난소 주기 단계를 결정하기 위해 프로게스테론/에스트라디올 및 융모성 성선 자극 호르몬 수치를 측정하기 위한 혈액 및 소변 샘플링에 대해 설명합니다. 호르몬 수치는 배란 시기를 예측하고 결정하는 데 사용되며 호르몬은 난소 주기와 난모세포 성장을 조절하기 위해 주입됩니다.

초록

일반적인 마모셋은 작은 신세계 원숭이입니다. 마모셋의 생물학적 메커니즘 중 많은 부분이 인간과 유사하기 때문에 마모셋은 신경 과학, 재생 의학 및 개발과 같은 다양한 분야의 의학 및 인간 생물학 연구에 잠재적으로 유용할 수 있습니다. 그러나 많은 기본 실험 및 절차에 대한 방법을 설명하는 문헌이 부족합니다. 여기에서는 마모셋의 성호르몬(프로게스테론, 에스트라디올, 융모성 성선 자극 호르몬)의 수치를 측정하는 자세한 방법을 설명합니다. 이러한 호르몬의 측정은 난소 주기의 단계를 예측할 수 있게 하며, 이는 일반적으로 마모셋에서 26-30일입니다. 정확한 측정은 정확한 시점에 난모세포/접합체를 수확하고 유전자 변형 마모셋 생성을 위한 숙주 암컷을 준비하는 데 필수적입니다.

또한 성물질 수치 측정은 내분비학, 행동학, 조기 발달 및 생식 생물학 연구에 유용합니다. 이 프로토콜은 대퇴 정맥에서 혈액 채취, 호르몬 측정을 위한 혈장 분리, 소변 및 혈장을 사용한 융모성 성선 자극 호르몬 수치 측정, 주기를 단축 및 동기화하기 위해 프로스타글란딘 F2α 유사체 주사를 사용하여 난소 주기를 재설정하고, 난포 자극 호르몬과 융모성 성선 자극 호르몬을 주입하여 난포 성장 및 배란을 촉진하는 방법에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 이러한 프로토콜을 사용하여 난모세포/접합체의 적시 수집을 위해 난소 주기의 단계를 결정할 수 있습니다.

서문

일반적인 마모셋(Callithrix jacchus)은 인간과 유사한 많은 특성을 가진 작은 신세계 원숭이이며 난소 주기의 기간은 26-30일 1,2입니다. 유전자 변형 마모셋의 조기 발달 및 생성에 대한 연구는 난소 주기의 특정 단계에서 난모세포와 접합체를 채취해야 합니다. 따라서 병기의 정확한 측정이 중요하며 프로게스테론(P4) 및 에스트라디올(E2)2,3 호르몬의 혈중 농도를 측정하여 추정할 수 있습니다. 이 호르몬은 착상에 필요한 자궁내막 성장을 촉진합니다. P4는 배란 직후 난소에서 형성되는 황체(corpus luteum)에서 생성됩니다. E2는 뇌의 시상하부-뇌하수체 복합체에서 나오는 난포 자극 호르몬(FSH)에 반응하여 난포에서 분비됩니다. E2 수치는 난포가 성숙함에 따라 증가하여 배란 전에 최고조에 달한다3. 높은 E2 수치는 인간의 시상하부-뇌하수체 복합체를 통해 황체 형성 호르몬(LH)의 펄스 방출을 유발합니다. 이 LH 급증은 배란을 유도합니다. 그러나 마모셋에서 LH 유전자는 진화 과정에서 퇴화를 겪었고, 대신 뇌하수체 4,5에서 LH와 유사한 구조를 가진 융모성 성선 자극 호르몬(CG)의 방출에 의해 배란이 유도됩니다.

난소 주기는 호르몬 주사로 조절할 수 있습니다. 난소 난포자극호르몬(FSH) 주사는 난소 난소 난포자극호르몬(FSH) 수용체에 작용하여 에스트로겐 합성과 난포 성장을 촉진하는 데 사용된다6. 난포 단계가 끝날 때 LH의 대체물로 인간 CG(hCG)를 주입하는 것은 인간의 배란을 자극하는 데 사용된다7. CG 주사는 임신 초기에 황체를 자극하여 P4 생산을 증가시키기 때문에 인간 불임 치료에도 사용됩니다. 프로스타글란딘 F2α(PGF2α) 주사는 난소 주기를 재설정한다8. 가축의 경우 PGF2α 주사를 사용하여 황체기를 단축하고 생식 관리를 위해 발정 주기를 동기화합니다.

마모셋과 인간은 유사한 생물학적 메커니즘을 가지고 있어 이상적인 모델 동물이 되지만, 자주 사용되는 많은 기술에 대한 기본 방법을 설명하는 문헌이 부족합니다. 혈액 채취는 가장 자주 사용되는 기술중 하나입니다 9,10,11,12. 그러나 초보자는 때때로 정맥을 찾는 데 어려움을 겪습니다. 따라서 본 연구는 대퇴 정맥 부위의 해부학적 분석을 수행하였다. 해부학적 관찰을 바탕으로 이 프로토콜은 대퇴골 삼각형의 근위 영역을 정맥 천자를 위한 쉬운 부위로 소개합니다.

프로토콜

마모셋과 관련된 모든 방법은 높은 윤리 및 복지 기준을 활용했으며 국립 아동 건강 발달 센터(National Center for Child Health and Development)의 기관 동물 보호 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 여기에 사용 된 동물은 하루에 12 시간의 빛이있는 단일 주택 또는 쌍 주택 (암컷 1 마리와 남성 1 마리)이었습니다.

1. 대퇴 정맥의 혈액 채취

  1. 1m L의 주사기(짧은 타입은 사용하기 쉽다)를 25G 바늘이 칼날이 위로 향하게 부착하여 준비합니다. 혈액이 막히는 것을 방지하려면 희석되지 않은 헤파린 나트륨 용액 200μL를 주사기에 끌어들여 주사기를 헤파린화합니다. 주사기 내부를 여러 번 위아래로 당겨 고르게 코팅합니다. 그런 다음 주사기에서 헤파린 용액을 배출합니다.
    알림: 새 주사기로 교체해야 하는 경우가 많으므로 몇 가지 추가 헤파린 주사기를 준비하십시오.
  2. 흡수성 면봉과 알코올 면봉을 준비합니다. 조정 가능한 램프를 켜서 혈액 샘플링을 위해 마모셋을 놓을 영역을 비춥니다.
  3. 시중에서 판매되는 구속 장치(420 x 85 x 85mm, 그림 1A)를 준비합니다(자세한 내용은 재료 표 참조). 마모셋을 장치에 넣으려면 마모셋을 고정하는 스폰지 벨트로 고정 부분을 엽니다. 마모셋을 위로 향하게 하여 구속 장치에 삽입합니다.
    알림: 마모셋은 일반적으로 구속 장치에서 침착하며, 이는 구속 적응 또는 훈련의 필요성을 무효화할 수 있습니다.
  4. 마모셋을 포획하십시오. 마모셋을 원통형 부분에 삽입하십시오. 스펀지 벨트를 눌러 고정합니다. 혈액을 채취할 다리를 다른 다리 위에 놓습니다(그림 1A). 자주 사용하지 않는 손을 사용하여 다리를 잡습니다. 가운데 손가락과 약지를 양쪽 다리 안쪽에 넣어 고정하고 다른 손가락을 양쪽 다리 바깥쪽에 넣어 고정합니다.
    알림: 마모셋을 포획할 때는 바이트 장갑을 착용하는 것이 좋습니다. 구속 장치가 없는 경우 마취 하에 또는 마모셋을 제지하는 다른 사람과 함께 혈액 채취를 수행하십시오.
  5. 허벅지 기저부 근처에 대퇴 정맥이 보이는지 확인하십시오. 그렇지 않은 경우 촉진하여 맥동하는 동맥을 찾고 이를 이정표로 사용하여 정맥이 동맥 내부로 흐르는지 확인합니다(그림 1B-D).
    알림: 책상 조명과 머리 면도는 가시성을 높이기 위해 권장됩니다. 알코올 면봉으로 문질러 가시성을 향상시킬 수도 있습니다. 삼각형의 림프절은 종종 정맥에 가깝게 위치하며 정맥으로 짙은 파란색을 나타냅니다. 이를 구별하는 방법은 대표 결과 섹션에 설명되어 있습니다.
  6. 알코올 면봉을 사용하여 천자 부위를 소독합니다. 바늘 날이 위로 향하게 15°-20° 각도로 삽입합니다. 채취 중에 바늘이 혈관 밖으로 미끄러지는 것을 방지하기 위해ample, 주사기를 잡은 손을 다른 손에 올려 놓음으로써 안정시킵니다.
  7. 플런저를 부드럽게 뒤로 당겨 음압을 가합니다(그림 1E). 바늘 끝을 앞으로 밉니다. 혈액이 주사기에 들어가면 필요한 부피(500-700μL)가 수집될 때까지 바늘 끝의 위치를 유지합니다.
    1. 혈액이 주사기에 들어가지 않으면 천자 부위를 변경하십시오. 바늘을 뽑았을 때 피가 나오면 천자 부위에 3분 동안 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 출혈을 멈춘 후 정맥 천자를 다시 시작하십시오.
    2. 채취 과정에서 주사기로 뽑히는 혈액이 흐르지 않으면 바늘 끝을 천천히 앞으로 밀었다가 뒤로 당겨 혈관을 찾습니다. 이렇게 하면 주사기로 들어가는 혈액의 흐름이 복원될 수 있습니다. 그렇지 않은 경우 바늘을 뽑고 새 주사기를 사용하여 정맥 천자를 수행합니다.
      알림: 같은 쪽에서 혈액을 채취하기 어려운 경우 다른 쪽 다리의 허벅지를 사용하십시오.
  8. 새끼 손가락으로 천자 부위를 가볍게 누르면서 바늘을 조심스럽게 빼냅니다. 그런 다음 흡수성 면봉을 사용하여 즉시 천자 부위에 3분 동안 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 혈액과 헤파린을 섞기 위해 주사기를 뒤집습니다.
    알림: 동맥혈을 뽑을 때 냉각하면서 더 오랜 시간(5분) 동안 압력을 가하고 때때로 치명적인 결과를 초래할 수 있는 혈종 형성을 방지하기 위해 출혈 소멸을 주의 깊게 확인하십시오.
  9. 출혈이 멈춘 것을 확인한 후 스펀지 벨트를 제거하고 한 손으로 동물의 허리를 잡고 다른 손으로 동물의 겨드랑이를 잡을 수 있도록 동물을 회전시킵니다.
  10. 마모셋을 우리로 되돌려 놓습니다. 스트레스를 줄이고 반복적인 혈액 채취를 용이하게 하려면 마모셋에게 좋아하는 음식(예: 비스킷, 마시멜로 또는 스폰지 케이크)을 제공하십시오. 혈종의 발생을 수시로 확인하십시오.
    알림: 초기에 혈종이 발견되면 혈종의 진행을 방지하기 위해 압박 붕대를 감습니다. 오랜 시간이 지난 후에 발견되면 대퇴 동맥 결찰술과 수혈을 통한 혈종의 외과적 제거가 필요할 수 있습니다 9,13.
  11. 용혈을 방지하기 위해 주사기에서 바늘을 분리합니다. 그런 다음 1.5mL 마이크로튜브의 내벽을 따라 수집된 혈액을 천천히 배출합니다.
    알림: 수집된 혈액은 P4/E24 수치를 측정하기 위해 혈장 분리 전에 최대 4시간 동안 2 °C에서 보관할 수 있습니다.

2. 혈장 분리 및 호르몬 수치 측정

  1. 1.5mL 튜브에 1,100× g 의 혈액을 넣고 4 °C에서 5분 동안 원심분리합니다.
  2. 1.5mL 튜브에서 분리된 혈장(상층액)을 새 튜브/컵으로 옮기고 혈액 세포(침전물)가 포함되지 않도록 주의합니다.
  3. ELISA 키트 또는 자동 분석기를 사용하여 P4 및 E2 수준을 측정합니다. 혈장의 양이 자동 분석기에 충분하지 않은 경우 시료 희석 용액을 사용하십시오.
    참고: 자동 분석기를 사용한 측정의 경우 P4 수준만 측정하려면 >175μL의 플라즈마가 필요하고 P4 및 E2를 모두 측정하려면 >250μL의 플라즈마가 필요합니다.

3. 배란과 임신을 감지하기 위한 소변 CG 측정

참고: 마모셋의 CG 수치는 배란과 임신 모두에 대해 면역크로마토그래피 키트 테스트를 사용하여 측정할 수 있습니다. 배란의 경우 배란 0-2일 전에 양성 결과를 얻을 수 있습니다. 임신의 경우 임신 15-20일에서 대략 100일째까지 양성 결과가 감지됩니다. 이 검사에는 소량(90μL)의 소변이 필요합니다(소변 한 방울은 ~30μL).

  1. 트레이 방법: 두 마리 이상의 동물이 동일한 케이지에 있는 경우 대상 마모셋(또는 다른 동물)을 전날 다른 케이지로 옮깁니다. 불을 켜기 전이나 전날 밤에 케이지 바닥에 깨끗한 트레이를 놓습니다. 밤에는 방광에서 소변이 배출되지 않습니다. 따라서 소변은 일반적으로 조명 직후에 방광에서 배출됩니다.
    알림: 아침에 조명이 켜지기 전에 방에 들어가면 코호트의 수면 주기를 방해할 수 있습니다. 소변은 일반적으로 조명 후 약 30분 이내에 수집될 수 있습니다.
  2. 짜는 방법: 소변 채취를 위해 세척된 트레이를 준비합니다. 마모셋의 방광을 찾은 후 손가락 전체 길이를 사용하여 앞쪽과 양쪽에서 조심스럽게 짜냅니다(그림 1F). 아침에 방을 밝히기 직전에 소변을 채취하십시오.
    알림: 방광에 소변이 없어 소변 채취에 실패하면 잠시 기다렸다가 다시 시도하십시오. 동물이 다칠 수 있으므로 과도한 힘을 가하지 않도록 주의하십시오.
  3. 채취 직후 소변 샘플을 면역크로마토그래피 테스트 키트의 웰에 넣습니다. 제조업체의 지침에 따라 10분 후에 결과를 읽으십시오.

4. 난모세포, 접합체 및 배아 채취를 위한 난소 주기 단계의 제어 및 결정

  1. 생식 소포(GV): 난소에서 난모세포 수집
    1. 150μL의 식염수14 에 희석한 0.263mg/mL 클로프로스테놀(합성 PGF2α 유사체) 3μL의 근육 주사를 투여하여(그림 2) 황체기 말기(즉, 황체기 시작 후 ≥10일 후)에 난소 주기를 재설정합니다.
      참고: 희석된 클로프로스테놀은 +4°C에서 최소 몇 주 동안 안정적으로 유지되므로 희석된 용액을 더 큰 부피로 만드는 것이 편리할 수 있습니다.
    2. 다음날(1일차)에 P4 수치가 떨어졌는지 확인하여 난포기의 시작을 확인합니다.
      참고: 클로프로스테놀 주사는 24시간 이내에 P4 수치(보통 <10ng/mL)를 극적으로 감소시키는 것으로 보고되었습니다3.
    3. 1일차부터 FSH(25IU, 근육주사)를 2일에 한 번씩 총 5회(1일, 3일, 5일, 7일, 9일)에 주사합니다. 10일째 되는 날, 오후에 hCG(75 IU, 근육주사)를 주사합니다.
    4. 문헌11에 따라 마취하에 여포 흡인으로 난소에서 GV를 수집합니다 15,16.
      참고: 때때로 배란이 예상보다 일찍 발생합니다. 따라서 8일째부터 CG 레벨을 확인하는 것이 좋습니다. CG 검사에서 양성이 나오면 당일 GV 채취를 실시합니다.
  2. metaphase II (MII) 난모세포, 접합체 및 초기 배아 수집
    1. 4.1.1단계에서 설명한 대로 클로프로스테놀을 사용하여 난소 주기를 재설정합니다.
    2. 다음날(1일차)에 P4 수치가 떨어졌는지 확인하여 난포기의 시작을 확인합니다.
    3. 접합체와 배아를 수집하기 위해 암컷 마모셋을 수컷 마모셋과 함께 수용하여 6일째부터 짝짓기를 합니다.
    4. 7일째부터 암컷의 혈액 P4/E2 수치와 소변 CG 수치를 확인합니다. CG의 검출은 며칠 이내(보통 다음날) 배란의 징후입니다. 전날에 비해 P4 수치가 증가하고 E2 수치가 감소하는 날, 난관17,18에서 MII 난모세포 또는 배아 0일(E0) 접합체를 수집합니다.
    5. 배아 채취를 위해 문헌에 설명된 바와 같이 표적 단계에 따라 적절한 시점에 난관(E1-E3, 1-8 세포)17,18 또는 자궁(E5-E10, 8 세포-배반포)19,20,21,22에서 세척을 수행합니다.

결과

본 연구에서 사용된 동물에 대한 자세한 내용은 표 1에 기재되어 있다.

대퇴 정맥의 해부학적 분석
대퇴 정맥의 해부학적 분석은 안락사를 받는 2세 수컷 커먼 마모셋(I 7713M)을 사용하여 수행되었습니다. 대퇴 정맥과 동맥은 대퇴 삼각형에 있습니다. 대퇴 삼각형은 복벽과 허벅지 근육 사이의 경계에 형성됩니다(

토론

정맥을 찾는 것은 혈액 채취에서 가장 중요한 단계입니다. 해부학적 관찰을 바탕으로 이 프로토콜은 마모셋의 혈액 채취를 위한 쉬운 장소로 대퇴골 삼각형의 근위 영역을 소개합니다. 이 영역을 사용하면 큰 정맥에서 혈액 샘플링을 쉽게 수행할 수 있습니다. 그러나 이 프로토콜을 사용하더라도 동맥 손상이 발생하는 경우가 있습니다. 동맥을 다쳤을 때는 혈종을 예방?...

공개

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 프로토콜을 수립하고 마모셋의 일상적인 관리를 지원해 주신 Chunshen Shen, Hiroko Akutsu, Fumiyo Sugiki, Yuuna Hashimoto, Hina Naritomi, Yuuki Sakamoto, Mikiko Horigome에게 감사드립니다. Takayuki Mineshige는 원고에 대한 의견을 제공합니다. Yukiko Abe와 Aiba lab의 구성원들은 접합체 수집 기술을 공유합니다. CIEA는 40년 동안 키워온 마모셋 주택과 실험에 대한 정보를 공유합니다. 이 연구는 보조금 번호 JP19gm6310010, JP20gm6310010, JP21gm6310010 및 JP22gm6310010(AMED), JPMJPR228B(JST), 20H05764, 20H03177 및 22K18356(KAKENHI)의 보조금 번호에 따라 AMED, JST 및 KAKENHI의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AIA-360Tosoh Corporation0019945Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK DILUENT CONCENTRATETosoh Corporation0020956Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK SUBSTRATE SET IITosoh Corporation0020968Hormone measurement (P4/E2)
AIA-PACK WASH CONCENTRATETosoh Corporation0020955Hormone measurement (P4/E2)
CMS-1CLEA JapanMarmoset food
EstrumateMSD Animal HealthPGF2alpha analog (cloprostenol)
Gonal-f Subcutaneous Injection 150Merck Biopharma Co., Ltd.FSH
Gonatropin for intramuscular injection 1000ASKA Pharmaceutical Co., Ltd.872413hCG
Heparin sodium injection solution 5,000 units/5 mLMochida Pharmaceutical Co., Ltd.224122458Blood collection
Immunochromatographic Test Kit for Detection of Common Marmoset Chorionic Gonadotropin (Dual Checker)CLEA Japan, Inc.Determining CG level
Low-profile double-arm microscope illumination LPF-SDSHIOKAZE GIKENDesk lamp for blood collection
Marmoset blood collection restraint deviceJIC JapanJM-1006Blood collection
http://www.jic-japan.jp/prd/marmoset/prd016.html
email: vi@jic-japan.jp
Metacam 0.05%Boehringer Ingelheim Animal Health Japan Co., Ltd.Hematoma treatment
Sample Cup, 3 mL, PS, for Tosoh 360 and AIA-600 II, 1000/BagGlobe Scientific110913Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2Tosoh Corporation0025224Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 CALIBRATOR SETTosoh Corporation0025324Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK iE2 SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation0025524Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIIITosoh Corporation0025240Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII CALIBRATOR SETTosoh Corporation0025340Hormone measurement (P4/E2)
ST AIA-PACK PROGIII SAMPLE DILUTING SOLUTIONTosoh Corporation 0025540Hormone measurement (P4/E2)
Syringe with 25 G (0.50 x 25 mm) needleTERUMOSS-01T2525Blood collection
Tensolvet 5.000 I.E. gel.Dechra Pharmaceuticals14033492Hematoma treatment
TOSOH MULTI-CONTROL SETTosoh Corporation0015965Hormone measurement (P4/E2)

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