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요약

이 프로토콜은 박테리아 종간 상호 작용의 영향을 탐구하는 데 사용할 수 있는 낭포성 섬유증(CF) 폐 관련 4종 다미생물 생물막 모델을 설명합니다.

초록

대부분의 in vitro 모델은 실제 환경에서 관찰되는 복잡한 상호 작용에서 발생하는 박테리아 표현형을 완전히 조사할 수 있는 능력이 부족합니다. 이는 다기관 유전 질환인 낭포성 섬유증(CF)을 앓고 있는 개인의 기도에서 발견되는 치료하기 어려운 만성 다미생물 생물막 기반 감염의 맥락에서 특히 그렇습니다. 여러 마이크로바이옴 연구에서 CF(pwCF) 환자의 기도에서 검출된 미생물 조성을 정의했지만, 현재까지 중요한 CF 관련 폐 기능을 완전히 통합한 시험관 모델은 없습니다. 그러므로, 혼합종 CF 폐 감염의 발병기전을 주도하는 기전을 조사할 수 있는 능력에는 상당한 지식 격차가 존재합니다. 여기에서는 CF와 유사한 조건에서 자란 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 황색포도상구균(Staphylococcus aureus), 연쇄상구균 상귀니스(Streptococcus sanguinis) 및 프레보텔라 멜라니노제니카(Prevotella melaninogenica )를 포함하여 최근에 개발된 4종 미생물 군집 모델에 대해 설명합니다. 이 시스템의 활용을 통해 여러 병원체의 항균 저항과 같은 임상적으로 관련된 표현형을 분자 수준에서 관찰하고 탐구했습니다. 이 in vitro 모델의 유용성은 만성 CF 폐 감염의 맥락에서 종간 상호 작용에 대한 연구를 촉진할 수 있는 표준화된 워크플로우에 있습니다.

서문

다기관 유전 질환인 낭포성 섬유증(CF) 기도에서 발견되는 것과 같은 질병을 유발하는 미생물을 근절하기 위한 전략은 종종 실패합니다1. 즉, 점액이 풍부한 CF 폐 환경에서 자라는 탄력적인 생물막과 같은 미생물 군집의 존재는 수십 년에 걸친 만성 감염을 유발할 수 있습니다2. 또한, 일선 항균제(Abx) 및 조절제의 활용으로 CF(pwCF) 환자의 결과가 개선되었지만, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa) 및 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)과 같은 표준 CF 병원체에 대해 일반적으로 사용되는 "하나의 벌레, 하나의 감염" 임상 접근법은 이러한 개인의 폐에서 발견되는 치료하기 어려운 감염을 해결하는 데 효과적이지 않았습니다 3,4, 5,6,7입니다.

지난 20년 동안 여러 연구가 만성 CF 폐 질환에 대한 우리의 이해를 바꾸어 놓았다8. 즉, 보고에 의하면 pwCF의 기도에서 검출된 감염은 단일 병원체에 의해서만 발생하는 것이 아니라 본질적으로 다미생물에 의한 것이다8. 또한, 혼합종 CF 폐 감염의 발병 기전은 아직 잘 알려져 있지 않지만, 임상적 증거에 따르면 기도에서 S. aureus 및 P. aeruginosa 와 동시 감염된 pwCF는 이 두 병원체 중 하나에 감염된 개체보다 폐 기능이 악화된 것으로 나타났습니다9.

CF 병원체 간의 종간 상호작용은 CF 치료제의 활용을 통해 다균생물 생물막 기반 감염이 쉽게 근절되지 않고 궁극적으로 환자 결과에 영향을 미치는 원인으로 가설화되어 있습니다3. 이를 뒷받침하는 시험관 내 연구는 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도상구균(S. aureus) 등과 같은 미생물 간의 상호 작용이 반코마이신 및 토브라마이신 6,10,11을 포함한 일선 CF 약물에 대한 Abx 반응성과 같은 임상적으로 관련된 표현형에 영향을 미칠 수 있음을 입증했습니다. 그러므로, 혼합종 감염의 맥락에서 CF 병원체를 근절하기 위한 현재의 치료 전략을 재검토하는 것은 달성되어야 할 과제로 남아 있다.

미생물 기반 CF 폐 감염 관리의 황금 표준은 임상적 중재를 안내하기 위해 항생제 감수성 검사(AST)의 활용에 크게 의존한다12. 그러나, AST는 전형적으로 풍부하고 잘 혼합된 배양에서 성장한 박테리아 단일배양을 사용하여 수행되며, 이는 CF 기도(3,13)에서 검출된 미생물 성장 조건을 반영하지 않는다. 환자 결과와 치료 성공 사이의 상당한 단절을 감안할 때, 임상 보고서는 이제 CF 폐의 중요한 기능을 통합하는 새로운 접근법의 개발을 지지합니다12,14.

두 개 이상의 병원체를 포함하는 CF 관련 세균 다종 in vitro 시스템을 개발한 연구는 거의 없다15,16. 그러나, 이러한 모델들은 (1) CF 폐의 다미생물 및 생물막과 같은 성질을 완전히 반영하지 못하고, (2) CF 기도에서 검출된 것과 유사한 영양 및 환경 조건을 사용하지 않는다(15,16). 대형 CF-폐 유래 16S rRNA 유전자 데이터 세트의 채굴 및 계산을 통해 Jean-Pierre와 동료들은 최근 위에서 언급한 기능10을 통합하는 시험관 내 공동 배양 모델을 개발했습니다. 이 시스템에는 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도상구균(S. aureus), 연쇄상구균(Streptococcus spp.) 및 프레보텔라(Prevotella spp.)가 포함되며 CF 기도와 유사한 조건에서 성장하며 최대 14일 동안 안정적입니다. 저자들은 또한 Prevotella spp.의 지역사회 특이적 성장과 이러한 CF 병원체의 Abx 반응성의 여러 변화를 보고했으며, 이는 아직 확인되지 않은 메커니즘을 통해 이루어졌다10. 이 다루기 쉬운 체외 시스템은 또한 pwCF10의 기도에서 자주 발견되는 녹농균의 일반적인 변이체에 대한 Abx 난치성과 관련된 기계론적으로 초점을 맞춘 질문을 탐구할 수 있는 가능성을 제공했습니다. 따라서 이 프로토콜의 목표는 CF 연구 커뮤니티에 여러 CF 관련 질문을 해결하기 위해 더욱 확장될 수 있는 잠재력을 가진 체외 생물막을 성장시킬 수 있는 표준화된 실험 워크플로우를 제공하는 것입니다.

프로토콜

모든 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 인공 객담 배지 준비

참고: 이 프로토콜 전반에 걸쳐, 인공 객담 배지(ASM)는 Turner와 동료들에 의해 이전에 발표된 SCFM2에서 변형된 CF 관련 배지로 정의된다17. 다음은 이 매체를 준비하는 단계에 대한 설명입니다. 재고 솔루션 및 보관 조건을 만들기 위해 재료 테이블을 참조하십시오. 이 버전의 ASM은 Turner et al.,17 과 다른데, 이는 원래 버전의 버퍼링 용량이 시간이 지남에 따라 안정적인 pH를 허용하지 않기 때문입니다. 즉, 연쇄상구균(Streptococcus spp.) 및 프레보텔라 종(Prevotella spp.)과 같은 혐기성 생물에 의해 수행되는 발효 활동은 성장 배지의 산성화를 초래합니다(미공개 관찰). 따라서 3-모르폴리노프로판-1-술폰산(MOPS) 농도를 10mM에서 100mM로 조정했습니다.

참고: 2x ASM 염기(ASMb) 원액을 준비하면 ASM10,18에 존재하는 분자의 최종 농도에 영향을 주지 않고 뮤신, 한천, 물 등과 같은 성분의 첨가를 용이하게 할 수 있습니다. 2x ASMb는 미리 준비하여 어두운 곳에서 최대 2주 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 매체가 노랗게 변하면 버리십시오.

  1. 400mL의 diH2O가 들어있는 깨끗한 비커에 2x ASM 기유를 준비하려면 저어주면서 다음을 추가합니다.
    1. 6.50 mL의 0.2 m NaH2PO4를 첨가하십시오. H2O 주식; 0.2 M Na2HPO4 주식의 6.25 mL; 348 μL의 1 M KNO3 스톡; 0.25MK2SO4 주식의 1.084 mL.
    2. 트립토판이 없는 효모 합성 드롭아웃 4.0g을 추가합니다. NaCl 3.032g; 걸레 20.92g; KCl 1.116g 및 NH4Cl 0.124g
    3. 9.30m L-젖산 스톡을 1mL를 추가합니다. 1.1M 포도당 스톡 2.70mL; 1.75 mL의 1 M CaCl 2.2H 2O 주식; 0.25M N-아세틸글루코사민 스톡 1.20mL 및 3.6mM FeSO 4.7H2O스톡 1.00mL.
    4. 0.1M 트립토판 스톡 660μL를 추가합니다. 606 μL의 1 M MgCl2.6H 2O 스톡; 청어 정자에서 추출한 디옥시리보핵산 0.60g; 250mg/mL 1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC) 재고 400μL.
    5. 모든 구성 요소가 추가되면 5M NaOH 스톡을 사용하여 pH를 6.80으로 조정합니다. diH2O로 500 mL까지 완성 0.22 μm 필터를 사용하여 멸균하고 4 °C에서 보관합니다.
  2. 10mg/mL(2x) 점액 스톡을 준비하려면 250mL의 diH2O가 들어 있는 깨끗한 유리병을 사용하고 저어줍니다.
    1. 돼지 위장에서 채취한 뮤신 5.0g을 추가합니다(II형). 현탁액을 10분 동안 섞습니다. diH2O로 500 mL까지 완성합니다.
    2. 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 멸균합니다. 사용할 때까지 4 °C에서 보관하십시오.
  3. ASM을 재구성합니다.
    참고: 이 단계는 실험 당일에 수행해야 합니다.
    1. 2x ASMb 스톡과 10mg/mL 뮤신 스톡을 1:1 부피 비율로 혼합합니다.
    2. 사용하기 전에 와류를 철저히 제거하십시오.

2. 다균 군집 선택적 배지 준비

참고: 다음은 1L의 매체를 준비하는 데 필요한 양입니다.

  1. MSA(Mannitol Salt Agar) 및 PIA(Pseudomonas Isolation Agar)를 준비하려면 제조업체의 지침을 따르십시오.
  2. 깨끗한 유리병에 Prevotella Selective Agar (PSA)를 준비하려면 다음을 추가하십시오.
    1. 트립틱 대두 육수(TSB) 30.0g. 한천 15.0g. 효모 추출물 5.00g. L-시스테인 염산염 0.50g.
    2. 0.5mg/mL 헤민 스톡 10.0mL. 10mg/mL 메나디온 스톡 100μL.
    3. 940mL의 diH2O를 넣고 저어줍니다. 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 멸균합니다.
    4. 식히면(즉, 병을 맨손으로 잡을 수 있음) 젓는 동안 50.0mL의 박리된 양의 피를 추가합니다. 50mg/mL 카나마이신 스톡 2.00mL. 50mg/mL 반코마이신 스톡 150μL. 500 μL의 10 mg/mL 폴리믹신 B 스톡.
  3. 깨끗한 유리병에 연쇄상구균 선택적 한천(SSA)을 준비하려면 다음을 추가합니다.
    1. TSB 30.0g. 한천 15.0g.
    2. 950mL의 diH2O를 넣고 저어줍니다. 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 멸균합니다.
    3. 식히면(즉, 병을 맨손으로 잡을 수 있음) 젓는 동안 50.0mL의 박리된 양의 피를 추가합니다. 10mg/mL 폴리믹신 B 스톡 1.00mL. 10mg/mL 옥솔린산 스톡 1.00mL.
      알림: 접시를 붓고 최대 4개월 동안 1°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 접종하기 전에 최대 24시간 전에 플레이트를 실온에서 건조시키십시오. PSA는 P. melaninogenica 및 Prevotella 중간체로 검증되었습니다. SSA는 S. sanguinis 및 연쇄상 구균 군(Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius 및 Streptococcus anginosus, SMG로 표시)으로 검증되었습니다. 새로운 균주를 테스트해야 하는 경우 이러한 선택적 매체를 de novo 검증하는 것이 강력히 권장됩니다.

3. 박테리아 액체 배지 준비 및 성장 조건

  1. 녹농균(P. aeruginosa)과 황색포도상구균(S. aureus)을 일상적으로 배양하려면 멸균이 풍부한 배지(예: 용원성 육수(LB) 또는 TSB))를 사용하십시오.
    1. 37 ° C에서 20-24 시간 동안 LB / TSB 한천 플레이트에서 이전에 자란 단일 콜로니를 선택하여 밤새 액체를 시작하십시오.
    2. 육수 배양액을 37°C에서 밤새 키우고 250rpm에서 16-18시간 동안 흔듭니다.
  2. 연쇄상구균을 키우려면 0.5% 효모 추출물(THB-YE)이 첨가된 멸균 Todd Hewitt 육수를 사용하십시오.
    1. 37 ° C + 5 % CO 2 에서 24 시간 동안 5 % defibrinated 양의 혈액 (혈액 한천 플레이트)이 보충 된 TSB 한천플레이트에서 이전에 성장 한 단일 식민지에서 밤새 액체 배양을 시작하십시오.
    2. THB-YE 배양액을 혐기성 또는 37 ° C + 5 % CO2 에서 18-22 시간 동안 흔들지 않고 밤새 성장시킵니다.
  3. Prevotella spp.를 성장시키려면 깨끗한 병에 다음을 추가하여 Prevotella 성장 배지(PGM) 1L를 준비하십시오.
    1. TSB 30.0g. 효모 추출물 5.00g. L-시스테인 염산염 0.50g. 0.5mg/mL 헤민 스톡 10.0mL 및 10mg/mL 메나디온 스톡 100μL.
    2. 990mL의 diH2O를 추가합니다. 121°C에서 15분 동안 고압멸균하여 멸균합니다. 병을 알루미늄 호일로 싸서 빛으로부터 보호하십시오.
    3. Prevotella spp. 콜로니는 37 ° C에서 48 시간 동안 혐기성으로 배양 된 혈액 한천 플레이트에서 발생합니다.
    4. PGM에서 단일 콜로니를 접종하고 37 °C에서 24 시간 동안 혐기성으로 흔들지 않고 밤새 성장합니다.
      참고: PGM은 실온에서 최대 2주 동안 보관할 수 있습니다. 사용하기 전에 각 성장 배지에 대해 멸균 테스트를 수행하는 것이 좋습니다. 혐기성 챔버를 사용하지 않는 경우, 콜로니 패치에서 Prevotella spp.의 액체를 밤새 시작해야 할 수도 있습니다.

4. 공동 배양 실험 준비

참고: 그림 1 은 요약된 실험 워크플로우를 보여줍니다. 준비 시간이 1시간 미만인 경우 산소 조건에서 실험 설정을 수행할 수 있습니다. 그보다 더 오래 걸릴 것으로 예상되는 경우 혐기성 챔버 (10 % CO2, 10 % H2 및 80 % N2 혼합 가스 포함)를 사용하여 실험을 수행하는 것이 좋습니다. 혐기성 항아리는 실험 샘플을 배양하는 데에도 사용할 수 있습니다.

  1. 단일문화와 공동문화의 준비
    알림: 실온에서 10,000분 동안 2 x g 에서 모든 원심분리 단계를 수행합니다. 공동 배양의 경우 96웰 플레이트를 접종하기 직전에 박테리아 샘플을 혼합합니다. 일반적으로 녹농균 및 황색포도상구균( P. aeruginosa ) 및 황색포도상구균(S . aureus strain)에 대한 1mL의 부피는 야간 배양에서 수집됩니다. 연쇄상구균(Streptococcus spp.) 및 프레보텔라 종(Prevotella spp.)의 경우, 하룻밤의 부피는 2-4mL 사이일 수 있습니다. 이러한 볼륨은 테스트할 조건의 수에 따라 조정할 수 있습니다.
    1. 하룻밤 배양액의 박테리아 액체를 사용하여 다음 단계를 수행합니다.
      1. 녹농균 및 황색포도상구균( P. aeruginosa) 및 황색포도상구균(S . aureus strain)의 경우 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)를 사용하여 두 번 세척합니다.
      2. 연쇄상구균 종(Streptococcus spp.) 및 프레보텔라 종(Prevotella spp.)의 경우 멸균 PBS로 한 번 세척하십시오.
        알림: 펠릿이 쉽게 손실될 수 있으므로 피펫을 사용하여 상층액을 조심스럽게 버리십시오.
      3. 세척 후 각 펠릿을 1x 물로 희석된 ASMb 1mL에 재현탁시킵니다.
      4. 멸균 PBS에서 각 샘플을 1:10으로 희석하고 OD600을 측정합니다.
      5. ASM에서 모든 culture를 0.2의 OD600 으로 조정합니다.
      6. OD600 = 0.2 현탁액을 사용하여 ASM에서 박테리아 샘플을 단일 배양 및 공동 배양을 위해 최종 OD600 0.01(각 미생물당)로 희석합니다.
      7. 5초 동안 완전히 소용돌이칩니다.
        참고: 예를 들어, OD600 = 0.01에서 총 1mL의 녹농균 단일배양 ASM 현탁액을 준비하려면 OD600 = 0.2에서 50μL의 P. aeruginosa를 950μL의 ASM 부피에 추가합니다. 공동 배양의 경우 OD600 = 0.2에서 각 P. aeruginosa, S. aureus, Streptococcus spp. 및 Prevotella spp. 현탁액 50μL를 800μL ASM에 첨가합니다.
      8. 피펫을 사용하여 100 μl의 단일 배양 및 공동 배양 현탁액을 멸균 플라스틱 평평한 바닥 96웰 플레이트의 3개의 개별 웰에 추가합니다.
      9. 무산소 상태에서 37°C에서 24시간 동안 플레이트를 (흔들지 않고) 배양합니다.
        알림: 다른 산소 장력(예: microxia, normoxia)도 여기에 사용할 수 있습니다. 그러나 이 모델은 무산소 조건에서 개발 및 검증되었습니다. mono 및 co-culture 세균 현탁액을 연속적으로 희석하여 접종 시작을 확인하고, PIA, MSA, SSA, PSA 등에 도금하는 것이 좋습니다. 각 박테리아 종에 대한 표적 시작 농도는 1 × 107 CFU/mL(녹농균), 3.5 × 106 CFU/mL(S. aureus), 1.2 × 106 CFU/mL(연쇄상구균 종) 및 4.6 × 106 CFU/mL(Prevotella spp.)입니다. 세균성 접종은 또한 Jean-Pierre와 동료들에 의해 기술된 바와 같이 변형될 수 있다10.
  2. 생물막 형성 후 매체를 교체하십시오.
    1. 24시간 배양 후 다채널 피펫을 사용하여 흡인하여 부착되지 않은(플랑크톤) 세포를 제거합니다.
    2. 사전 형성된 생물막에 100μL의 새로운 ASM 또는 원하는 처리(예: 항생제, 대사 산물 등)를 보충합니다.
    3. 무산소 조건에서 37 ° C에서 24 시간 동안 추가로 플레이트를 배양합니다.
      알림: 이 단계는 빠르게(즉, 1분 미만) 수행하면 유산소 방식으로 수행할 수 있습니다. 그렇지 않으면 혐기성 챔버를 사용하십시오.

5. 표본 수집 및 도금

  1. 추가 24시간 배양 후 다채널 피펫으로 부착되지 않은(플랑크토닉) 세포를 흡입합니다.
    참고: 플랑크톤 분획은 보관하고, 연속적으로 희석하고, 선택적 매체에 도금하거나 폐기할 수 있습니다.
  2. 125μL의 멸균 PBS를 사용하여 생물막을 두 번 부드럽게 세척하고 부피를 버립니다.
  3. 50μL의 멸균 PBS를 추가하고 96핀 리플리케이터를 사용하여 플레이트에서 세포를 부드럽게 긁어내어 생물막을 분리합니다.
  4. 재현탁된 생물막 세포를 새로운 멸균 96웰 플레이트의 A열로 옮깁니다.
    참고: 96웰 플레이트에는 B에서 H행에 멸균 PBS가 포함됩니다.
  5. 플랑크톤(필요한 경우) 및 생물막 분획을 10배 연속 희석합니다.
  6. 각 희석 시료 3-5 μL를 PIA, MSA, SSA 및 PSA에 플레이트합니다.
  7. 접종 부위를 건조시키십시오.

6. 선택적 플레이트 및 콜로니 형성 단위(CFU) 계수 배양

  1. 녹농균(P. aeruginosa)과 황색포도상구균(S. aureus)의 경우 37°C에서 18-20시간 동안 배양합니다.
  2. 연쇄상구균(Streptococcus spp)의 경우, 37°C에서 무산소 상태에서 24시간 동안 배양합니다.
  3. Prevotella spp의 경우 37 °C에서 무산소 상태에서 48 시간 동안 배양하십시오.
  4. 배양 후 콜로니를 세고(스폿당 ~10-35) mL당 CFU를 계산합니다.
  5. 시각화 도구를 사용하여 데이터를 플로팅합니다.

결과

그림 2에서 볼 수 있듯이, (1) 단일 배양에 비해 혼합 플랑크톤 군집을 성장시켰을 때 P. aeruginosa 및 S. aureus 생존 가능한 세포 수의 감소, (2) S. sanguinis 세포의 다미생물 성장 증가, (3) Jean-Pierre와 동료들이 이전에 보고한 P. melaninogenica의 혼합 군집 성장 등 여러 표현형이 보고되었습니다10.

토론

이 임상적 정보에 입각한 in vitro co-culture 시스템의 유용성은 다미생물 특이적 박테리아 기능을 검출할 수 있는 능력에 있습니다. 즉, 이 모델의 활용을 통해 Prevotella spp.의 군집 특이적 성장(그림 2)에서 녹농균(P. aeruginosa), 황색포도상구균(S. aureus 및 S. sanguinis)의 일선 CF Abx에 대한 감수성의 변화에 이르기까지 다양한...

공개

저자는 공개하지 않음을 선언합니다.

감사의 말

우리는 체외 다미생물 군집 모델의 설계 및 개발에 중요한 역할을 한 George A. O'Toole 박사와 Thomas H. Hampton 박사에게 감사를 표합니다. 원고에 대한 유용한 의견을 제시해 주신 Sophie Robitaille 박사님께 감사드립니다. 이 연구는 F.J-P에 JEAN21F0 낭포성 섬유증 재단(Cystic Fibrosis Foundation)의 보조금으로 지원되었습니다. 원고의 그림 1 은 BioRender를 사용하여 생성되었습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)Fisher ScientificNC0387928Prepare a 250 mg/mL stock in chloroform directly in the bottle. Keep at -20°C. Final concentration 200 μg/mL in 2x ASM base.
3-morpholinopropane-1-sulfonic acid (MOPS)SigmaM1254Final concentration 200 mM in 2X ASM base.
96-pin replicatorFisher Scientific05-450-9Disposable replicators can also be used. Cat #NC1567338.
96-well sterile standard plate with lidFisher Scientific62406-081
AgarFisher ScientificDF0145-17-0
AnaeroPack 2.5 L Rectangular JarFisher Scientific23-246-385
CaCl2*2H2O Fisher ScientificC79-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 3.5 mM in 2x ASM base.
Defribrinated sheep's bloodTo prepare growth plates for Streptococcus and Prevotella.
Deoxyribonucleic acid from herring spermSigmaD7290Final concentration 1.2 mg/mL in 2x ASM base.
FeSO4*7H2O Fisher ScientificAA1449830Prepare a 1 mg/mL stock (3.6 mM) in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.0072 mM in 2x ASM base.
GasPaksFisher ScientificB260678
GlucoseFisher ScientificD16-3Prepare as a 20% stock (1.1 M) in water and sterilize by autoclave. Final concentration 6 mM in 2x ASM base.
HeminSigma51280Dissolve 100 mg of hemin in 2 mL of 1 M NaOH and then bring up volume to 200 mL with water. Store in an amber bottle or a regular bottle wrapped with aluminum foil at 4 °C.
K2SO4Fisher ScientificP304-500Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.54 mM in 2x ASM base.
KanamycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
KClFisher ScientificP217-500Final concentration 30.0 mM in 2x ASM base.
KNO3Fisher ScientificP263-500Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 0.70 mM in 2x ASM base.
L-cysteine hydrochlorideFisher ScientificAAA1038922
L-Lactic acid SigmaL1750Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. pH adjust to 7.0. Final concentration 18.6 mM in 2x ASM base.
L-TryptophanSigmaT0254Prepare a 0.1 M stock in 0.2 M NaOH and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep refrigerated at 4 °C wrapped in aluminum foil. Final concentration 0.132 mM in 2x ASM base.
Mannitol Salt AgarFisher ScientificB11407Prepare using manufacturer's recommendations.
MenadioneSigmaM5625Prepare a 10 mg/mL stock solution dissolved in 96-100% ethanol. Conserve at 4 °C wrapped in aluminium foil. Vortex before use.
MgCl2*6H2O Fisher ScientificAA12288A9Prepare a 1 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 1.21 mM in 2x ASM base.
Mucin from porcine stomach - Type II SigmaM2378Prepare a 10 mg/mL (2x) stock in water; mix thoroughly before autoclaving. Keep at 4 °C.
Na2HPO4Fisher ScientificS375-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.5 mM in 2x ASM base.
N-acetylglucosamine SigmaA8625Prepare a 0.25 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Keep stock refrigerated at 4 °C. Final concentration 0.6 mM in 2x ASM base.
NaClFisher ScientificS271-500Final concentration 103.7 mM in 2x ASM base.
NaH2PO4*H2OFisher ScientificS369-500Prepare a 0.2 M stock in water and filter sterilize with a 0.22 μm filter. Final concentration 2.6 mM in 2x ASM base.
NaOHFisher ScientificS318-500Prepare a 5 M stock solution. Use to adjust pH of 2x ASM base stock.
NH4ClFisher ScientificA661-500Final concentration 4.6 mM in 2x ASM base.
Oxolinic acidPrepare a 10 mg/mL stock solution 0.5 M NaOH. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Polymixin BPrepare a 10 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Pseudomonas Isolation AgarFisher ScientificDF0927-17-1Prepare using manufacturer's recommendations.
Todd Hewitt BrothFisher ScientificDF0492-17-6Prepare using manufacturer's recommendations.
Tryptic Soy BrothFisher ScientificDF0370-17-3Prepare using manufacturer's recommendations.
VancomycinPrepare a 50 mg/mL stock solution in water. Filter sterilize with a 0.22 μm filter and store at 4 °C.
Yeast ExtractFisher ScientificB11929
Yeast Synthetic Dropout without Tryptophan SigmaY1876Final concentration 8.0 mg/mL in 2x ASM base.

참고문헌

  1. Cogen, J. D., Nichols, D. P., Goss, C. H., Somayaji, R. Drugs, drugs, drugs: Current treatment paradigms in cystic fibrosis airway infections. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S32-S39 (2022).
  2. O'Sullivan, B. P., Freedman, S. D. Cystic fibrosis. Lancet. 373 (9678), 1891-1904 (2009).
  3. Jean-Pierre, F., Vyas, A., Hampton, T. H., Henson, M. A., O'Toole, G. A. One versus many: Polymicrobial communities and the cystic fibrosis airway. mBio. 12 (2), e00006-e00021 (2021).
  4. Martin, C., et al. Longitudinal microbial and molecular dynamics in the cystic fibrosis lung after elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy. Respir Res. 24 (1), 317 (2023).
  5. Sosinski, L. M., et al. A restructuring of microbiome niche space is associated with elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor therapy in the cystic fibrosis lung. J Cystic Fibros. 21 (6), 996 (2022).
  6. Orazi, G., O'Toole, G. A. 34;It takes a village": Mechanisms underlying antimicrobial recalcitrance of polymicrobial biofilms. J Bacteriol. 202 (1), e00530-e00619 (2019).
  7. Nichols, D. P., et al. Clinical effectiveness of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor in people with cystic fibrosis: A clinical trial. Am J Respir Crit Care Med. 205 (5), 529-539 (2022).
  8. Filkins, L. M., O'Toole, G. A. Cystic fibrosis lung infections: Polymicrobial, complex, and hard to treat. PLoS Pathog. 11 (12), e1005258 (2015).
  9. Limoli, D. H., et al. Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa co-infection is associated with cystic fibrosis-related diabetes and poor clinical outcomes. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 35 (6), 947-953 (2016).
  10. Jean-Pierre, F., et al. Community composition shapes microbial-specific phenotypes in a cystic fibrosis polymicrobial model system. Elife. 12 (12), e81604 (2023).
  11. Toole Orazi, G., O'Toole, G. A. Pseudomonas aeruginosa alters Staphylococcus aureus sensitivity to vancomycin in a biofilm model of cystic fibrosis infection. mBio. 8 (4), e00873-e00917 (2017).
  12. Lipuma, J. J. The sense and nonsense of antimicrobial susceptibility testing in cystic fibrosis. J Pediatric Infect Dis Soc. 11 (2), S46-S52 (2022).
  13. Coenye, T. Biofilm antimicrobial susceptibility testing: Where are we and where could we be going. Clin Microbiol Rev. 36 (4), e0002423 (2023).
  14. Waters, V. J., et al. Reconciling antimicrobial susceptibility testing and clinical response in antimicrobial treatment of chronic cystic fibrosis lung infections. Clin Infect Dis. 69 (10), 1812-1816 (2019).
  15. Vandeplassche, E., et al. Antibiotic susceptibility of cystic fibrosis lung microbiome members in a multispecies biofilm. Biofilm. 2, 100031 (2020).
  16. Varga, J. J., et al. Antibiotics drive expansion of rare pathogens in a chronic infection microbiome model. mSphere. 7 (5), e0031822 (2022).
  17. Turner, K. H., Wessel, A. K., Palmer, G. C., Murray, J. L., Whiteley, M. Essential genome of Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis sputum. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (13), 4110-4115 (2015).
  18. Clay, M. E., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutant fitness in microoxia is supported by an anr-regulated oxygen-binding hemerythrin. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3167-3173 (2020).
  19. Hoffman, L. R., et al. Pseudomonas aeruginosa lasR mutants are associated with cystic fibrosis lung disease progression. J Cyst Fibros. 8 (1), 66-70 (2009).
  20. Heirali, A., et al. Sputum microbiota in adults with CF associates with response to inhaled tobramycin. Thorax. 75 (12), 1058-1064 (2020).
  21. Nelson, M. T., et al. Maintenance tobramycin primarily affects untargeted bacteria in the cf sputum microbiome. Thorax. 75 (9), 780-790 (2020).
  22. Kesthely, C. A., Rogers, R. R., El Hafi, B., Jean-Pierre, F., O'Toole, G. A. Transcriptional profiling and genetic analysis of a cystic fibrosis airway-relevant model shows asymmetric responses to growth in a polymicrobial community. Microbiol Spectr. 11 (5), e0220123 (2023).
  23. Jean-Pierre, F., Henson, M. A., O'Toole, G. A. Metabolic modeling to interrogate microbial disease: A tale for experimentalists. Front Mol Biosci. 8, 634479 (2021).
  24. Hendricks, M. R., et al. Respiratory syncytial virus infection enhances Pseudomonas aeruginosa biofilm growth through dysregulation of nutritional immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (6), 1642-1647 (2016).
  25. Hogan, D. A., Vik, A., Kolter, R. A Pseudomonas aeruginosa quorum-sensing molecule influences Candida albicans morphology. Mol Microbiol. 54 (5), 1212-1223 (2004).
  26. Wu, Y., et al. Co-assembling living material as an in vitro lung epithelial infection model. Matter. 7 (1), 216-236 (2024).

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