쥐에서 대퇴골두의 스테로이드 유발 골괴사증의 장력 없는 체중 지지 모델

요약

이 프로토콜은 탄성 치료 테이프를 사용하여 대퇴골두의 스테로이드 유발 골괴사증에 대한 간단하고 비용 효율적인 쥐 체중 부하 훈련 모델을 구축하는 것을 보여줍니다.

초록

쥐는 인간과 달리 네 발로 걷는 동물인 반면, 인간은 서 있는 이족 보행 동물로 걷거나 서 있을 때 엉덩이에 엄청난 압력이 가해집니다. 쥐 스테로이드 유발 대퇴골두 괴사 모델에서는 더 높은 압력에서 인간 고관절의 생체 역학적 특성을 시뮬레이션해야 하는 경우가 많습니다. 일부 학자들은 쥐가 일정한 무게를 지니게 하여 인간의 엉덩이 압력 상태를 모방하려고 하지만 체중을 지탱하는 물체를 쥐에게 고정하는 것은 어렵습니다. 쥐는 쉽게 움직일 수 없으며 접착 테이프로 쥐에 무게를 붙이면 쥐가 질식하거나 장 폐색으로 죽을 수 있습니다. 우리 연구팀은 탄성 치료 테이프를 사용하여 쥐의 체중을 지탱하는 물체를 장력 없이 고정함으로써 쥐가 자유롭게 숨을 쉴 수 있고 체중을 지탱하는 조건에서 고정에서 벗어나지 않도록 했습니다. 일반적인 스테로이드 유발 대퇴골 머리 괴사 쥐 모델과 비교하여, 우리는 이러한 체중 부하 중재가 쥐의 대퇴골 머리 괴사의 진행을 악화시킬 수 있음을 발견했습니다.

서문

글루코코르티코이드의 투여는 대퇴골두의 비외상성 골괴사증(ONFH^)의 가장 흔한 위험 인자입니다1. 수많은 증거에 따르면 글루코코르티코이드 외에도 환자의 고관절에 가해지는 압력 부하도 ONFH 발생과 관련이 있습니다. 체중 및 육체 노동 강도와 같은 요인은 ONFH²의 위험 요인으로 인식됩니다. 여러 임상 연구에서 고관절 부하 상태와 관절 치환술 시기 및 발생률 사이에 밀접한 관계가 있음을 입증했습니다 3,4,5,6. 따라서 하중 지지와 대퇴골두의 스테로이드 유발 골괴사증(SONFH) 사이의 관계를 반영하는 모델을 수립하는 것이 이 상태에 대한 포괄적인 조사에 중요합니다.

타조와 에뮤와 같은 큰 이족 보행 조류는 인간의 다리 하중 ^7,8을 닮은 고관절 스트레스를 시뮬레이션하는 좋은 모델 역할을 한다. 그러나 큰 조류 종을 유지하는 것은 어려운 일이며 관련 연구 비용이 높습니다. 자발적 고혈압 랫트 모델 ^9,10은 더 높은 비율의 ONFH를 나타낼 수 있지만, 자발적 고혈압에 의해 생성된 골수 내의 구획 압력 하중은 기계적 압력과 크게 다르며 기계적 압력이 SONFH에 미치는 영향을 연구하는 데 적합하지 않습니다.

소동물 모델은 SONFH 연구에 일반적으로 사용됩니다. 그러나 사족 보행 파충류는 고관절 스트레스가 낮고 고관절 모델은 이족 보행 중 인간 고관절의 생체 역학적 환경을 시뮬레이션할 수 없습니다. 단일 사지 고정 모델⁽¹¹ ) 및 부분 언로딩 모델⁽¹² )이 일반적이지만, 둘 다 사지 하중을 감소시킨다. 인간은 서 있거나 걸을 때 상당한 하지에 하중을 가하는 이족 보행 유기체이기 때문에 이러한 모델에서 하중을 줄이면 동물 모델과 인간 질병 간의 연결이 줄어듭니다.

이 연구는 체중 부하 훈련이 쥐의 대퇴골두의 스테로이드 유발 골괴사증에 미치는 영향을 조사하기 위해 체중 부하 훈련을 위한 간단하고 비용 효율적인 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다. 현재 대퇴^골두의 스테로이드 유발 골괴사증을 연구하기 위해 랫트 모델이 사용^{되었지만, 움직임}에 대한 중단을 최소화하면서 장기적이고 안전한 고정을 제공할 수 있는 모델은 아직 없으며, 이는 상대적으로 간단하고 저렴합니다. 이 연구에서는 접착력이 높은 고정 재료를 적용하고 장력 없는 고정을 채택하여 쥐의 이동성을 유지하고 부적절한 고정으로 인한 고통과 심지어 사망을 줄입니다.

프로토콜

이 프로토콜은 베이징 중의과대학(Beijing University of Chinese Medicine)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 정한 윤리 지침(프로토콜 번호 BUCM-4-2022062001-2109)을 준수합니다. 이 프로토콜은 8-10주 된 200g-250g의 Sprague Dawley(Sxk(Jing)2019-0008) 쥐를 사용합니다.

1. 적응 훈련

1. 알비노 쥐는 일반적으로 시야 범위가 60cm 미만이다¹⁵. 모델링 과정에서 쥐를 불투명한 우리에 넣고 모델링되지 않은 쥐로부터 가능한 한 멀리 두어(적어도 다른 쥐는 모델링된 쥐의 최대 시야 범위 밖에 있어야 함) 외상성 스트레스를 경험하지 않도록 합니다.
2. 전원을 켜고 트레드밀을 10° 경사로 0m/min으로 설정합니다. 쥐를 트레드밀에 놓고 스트레스를 피하기 위해 움직임이 가능한 한 부드러운지 확인하십시오. 추가 자극을 사용하지 마십시오. 쥐는 환경에 익숙하지 않기 때문에 자연스럽게 앞으로 기어 나갑니다.
3. 훈련은 15분 동안 지속됩니다. 훈련 후에는 쥐가 남긴 배설물과 소변을 청소하고 알코올을 분사하여 동물의 냄새를 제거합니다. 그런 다음 훈련을 위해 다음 쥐를 준비합니다.
   알림: 쥐가 러닝머신에서 5분 동안 걷기를 거부하면 연구에서 제외하십시오.
4. 1^주 일이 끝날 때까지 적응형 훈련을 계속합니다.

2. 쥐의 최대 체중 지지력 측정

1. 시험관 2개, 훅, 약 80cm 길이의 패스너를 준비합니다. 강철 볼을 시험관에 넣고 시험관, 후크 및 고리 패스너의 초기 결합 무게가 150g이 되도록 합니다. 총 중량이 다른 시험관을 10g 단위로 준비하며 최대 중량은 350g입니다.
2. 한 연구자가 양손을 사용하여 장갑을 끼고 쥐를 고정합니다(그림 1). 또 다른 연구자는 시험관을 등의 정중선에서 약 1cm 떨어진 쥐의 등에 놓습니다. 이 단계는 쥐의 움직임이 필요하지 않으므로 튜브를 고정하기 위한 추가 조치를 사용하지 않고 후크 및 루프 패스너를 쥐 주위에 감기만 하면 고정을 수행합니다.
3. 쥐의 최대 체중에 도달할 때까지 튜브를 교체하십시오. 쥐가 최대 체중 부하에 도달하면 찌르거나 실험자가 떠날 때 서 있을 수 없습니다. 쥐가 서 있을 수 있도록 무게를 10g 줄입니다. 이 체중은 쥐의 최대 체중 지지 능력을 나타냅니다.

3. 중량 하중의 준비

1. 훈련 중에는 안전한 고정이 필요하기 때문에 접착력이 강한 쥐 크기에 따라 1-1.5m의 탄성 치료 테이프를 사용하여 물체를 고정합니다. 점토를 사용하여 시험관의 무게를 조정하여 하중의 흔들림을 줄입니다.
2. 시험관과 고정대상의 무게를 측정한 후 시험관에 적당량의 점토를 첨가하여 목표 중량에 맞게 조정합니다. 유리 교반 막대를 사용하여 점토를 시험관 내부에 고르게 펴 바릅니다. 시험관의 한쪽 끝에 점토가 집중되어 있으면 훈련 중에 쉽게 분리될 수 있습니다.
3. 조정된 시험관과 점토의 총 무게를 쥐의 최대 체중 지지 능력의 50%로 조정합니다(그림 1A). 이 무게를 초과하면 쥐가 훈련을 완료하기 어렵게 됩니다. 실험이 끝날 때까지 하중의 무게를 다시 조정하지 마십시오.

4. 대퇴골두 모델의 스테로이드 유발 골괴사증 확립

1. SONFH 모델 수립을 위해 지질다당류(LPS+MPS) 방법과 결합된 메틸프레드니솔론을 사용합니다^16,17. 쥐의 복부 정중앙선에서 표준 바늘을 사용하여 LPS(20μg/kg)의 복강 내 주사를 24시간마다 한 번씩 총 2회 주사합니다.
2. 마지막 LPS 주사 후 규칙적인 수유 후 24시간 후에 편측 둔근에 MPS(40mg/kg)를 주사하고 24시간마다 두 둔부 부위를 번갈아 가며 총 3회 주사합니다.

5. 탄성 치료 테이프와 트레드밀 훈련을 사용한 장력 없는 체중 부하 고정

1. 쥐의 등 정중선을 양쪽에서 1-2cm로 표시하십시오. 이것은 중량 하중에 대한 기준점입니다. 트레드밀 훈련 중에 쥐가 기울어지거나 움직임을 방해하지 않도록 표시가 적절하게 배치되었는지 확인하십시오.
2. 한 명의 조사관이 장갑을 끼고 쥐를 고정하는 동안 한 손을 쥐의 겨드랑이 아래에 넣어 앞다리와 턱을 고정하고 다른 손은 뒷다리와 꼬리를 고정합니다. 스트레스나 질식을 방지하기 위해 과도한 힘을 가하지 마십시오(그림 1B).
3. 쥐의 등에 하중을 가하기 위해 압력을 가하지 않고 탄성 치료 테이프를 시험관에 부착합니다. 감는 과정에서 장력 없는 고정을 위해 탄성 치료 테이프를 늘리지 마십시오.
   참고: 이 모델에 사용된 탄성 치료용 테이프는 격렬한 신체 활동 중에 테이핑할 수 있도록 설계되어 높은 접착력과 탄성을 제공합니다¹⁸. 높은 탄성으로 인해 기어 다니는 동안 쥐의 움직임에 미치는 영향을 크게 줄입니다.
4. 두 번째 조사관에게 시험관을 쥐의 척추와 평행한 쥐의 등에 고정하도록 요청하고, 만들어진 표시에 따라 고정 위치, 즉 쥐의 등 양쪽 정중선에서 1-2cm 떨어진 곳에 고정하도록 요청합니다.
5. 쥐의 고통을 최소화하고, 쥐의 움직임에 미치는 영향을 줄이고, 고정으로 인한 사망률을 줄이려면 긴장을 가하지 않고 고정을 수행하십시오. 무게를 조절한 시험관을 탄성 치료 테이프에 붙인 다음 장력이 없는 기술을 사용하여 시험관을 쥐의 몸에 감습니다.
6. 쥐의 호흡 및 움직임에 대한 부작용을 방지하기 위해 장력이 없는 고정을 보장하고 늘어나지 않게 탄성 치료 테이프의 원래 길이를 유지합니다(그림 1C).
7. 시험관을 쥐의 몸에 감은 후 쥐를 열린 공간이나 단일 케이지에 넣고 호흡과 방향을 모니터링합니다. 빠른 호흡이나 입을 벌리는 징후가 나타나면 질식을 방지하기 위해 즉시 쥐를 풀어줍니다.
   1. 이상적인 고정은 쥐가 자유롭게 움직이고 물을 마시고, 앞다리를 들어 올리고, 먹이를 주는 것과 같은 활동을 수행할 수 있도록 합니다(그림 1D). 고정이 만족스럽지 않으면 일시적으로 해제하고 20분 후에 다시 고정하여 반복적인 고정 자극으로 인한 쥐의 스트레스를 최소화합니다.
8. 전원을 켜고 트레드밀을 1° 경사로 0m/min으로 설정합니다. 트레드밀 훈련 시간은 30분입니다. 쥐를 러닝머신에 부드럽게 옮기고 타이머를 시작합니다.
9. 쥐에게 추가 자극을 제공하지 마십시오. 쥐가 30분 훈련을 완료할 수 없는 경우 고정 장치를 제거하지 않고 10분 동안 휴식을 취하기 위해 새장에 넣습니다.
   참고: 본 연구에 사용된 탄성 치료용 테이프는 신축성과 접착력이 우수합니다. 장력 없이 적절하게 고정되면 장기간 고정해도 시험관이 분리되거나 쥐가 질식하거나 사망하지 않습니다.
10. 훈련 후에는 쥐가 남긴 배설물과 소변을 청소하고 알코올을 분사하여 동물의 냄새를 제거합니다.
11. 위의 단계를 다른 쥐가 보는 것을 피하고 동물이 소리를 내어 다른 쥐에게 외상성 스트레스를 유발하는 것을 방지하기 위해 가능한 한 부드럽게 동물을 다루십시오.
12. 훈련을 마친 후 즉시 쥐를 고정에서 풀어줍니다(그림 1E). 풀어주는 동안 손가락을 사용하여 쥐의 털을 눌러 보호하여 방출 중 털 손실을 최소화합니다(그림 1F).

6. 동물 그룹화

1. 체중 부하 훈련이 SONFH에 미치는 영향을 연구하기 위해 60마리의 쥐를 무작위로 4개의 그룹으로 나눕니다.
2. 대조군에서는 일반적인 스테로이드 유발 대퇴골두부 골괴사(SONFH) 모델을 확립하거나 체중 부하 훈련을 수행하지 마십시오. Control+Load 그룹에서는 대퇴골두 모델의 스테로이드 유발 골괴사증을 확립하지 않고 체중 부하 훈련만 수행합니다. 모델 그룹에서는 대퇴골두 모델만 스테로이드 유발 골괴사증을 확인합니다. Model+Load 그룹에서는 대퇴골두 모델의 스테로이드 유발 골괴사증을 확인한 후 체중 부하 훈련을 수행합니다.

7. 안락사와 표본 채취

1. 쥐를 작은 동물 안락사 챔버에 넣고 5% 이상의 농도가 될 만큼 충분한 이산화탄소를 주입합니다. 쥐가 의식을 잃으면 심장 내 주사를 통해 20% 염화칼륨 용액의 체중 0.3mL/kg, 총 20mL를 투여합니다.
2. 쥐의 호흡과 심장 박동을 모니터링하여 안락사 중에 통증이나 불편함을 느끼지 않는지 확인합니다. 호흡과 심장 박동이 없는지 확인하여 사망을 확인합니다. 알코올을 뿌려 냄새를 제거하십시오.
3. 안락사 후 쥐의 엉덩이 부분을 절개하고 대퇴골을 손상되지 않은 상태로 유지하면서 대퇴골두를 추출합니다. 전처리 후 microCT 스캔을 수행한 후 Hematoxylin-Eosin(HE) 염색을 수행합니다.

8. Hematoxylin-Eosin 염색

1. 모델링이 완료되면 쥐를 안락사시킵니다. HE 염색을 위해 대퇴골을 제거합니다.
2. 쥐의 대퇴골을 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담그어 생물학적 조직을 표본으로 보존합니다. 석회질 제거를 위해 쥐의 대퇴골 표본을 5% 포름산에 5일 동안 담그십시오.
3. HE 염색을 위해 표본을 5μm 조각으로 나눕니다.
   참고: 빈 틈새(empty lacunae)는 일반적으로 골세포를 포함해야 하는 틈새(lacunae)에 이러한 세포가 없는 뼈 조직¹⁹의 상황을 나타냅니다. 뼈 조직의 건강을 평가하는 중요한 지표입니다. 뼈 괴사의 병리학적 과정에서, 불충분한 혈액 공급은 골세포를 사멸시켜 빈 틈새를 초래할 수 있습니다. 뼈 괴사의 진단 및 평가에서 빈 틈새의 수와 분포는 질병의 심각성을 측정하는 중요한 매개 변수입니다^20,21.
   1. 쥐의 대퇴골 표본을 용융된 파라핀(56-60°C)에 넣고 필요한 경우 먼저 저융점 파라핀에 담근 다음 점차적으로 더 높은 융점 파라핀으로 매번 약 1시간 동안 옮겨 조직에 파라핀이 완전히 침투하도록 합니다.
   2. 임베딩 몰드를 준비하고 녹인 파라핀을 몰드에 적절한 깊이까지 붓습니다. 담근 후 겸자를 사용하여 파라핀에서 조직 샘플을 회수하고 과도한 파라핀을 제거하고 금형에 넣습니다. 파라핀을 응고시키기 위해 실온으로 냉각하여 파라핀 블록을 형성합니다.
   3. 파라핀 마이크로톰을 사용하여 내장된 파라핀 블록을 5μm 두께의 섹션으로 자릅니다.
4. 슬라이스가 부착된 쥐 대퇴골 표본을 슬라이드 워머에서 1시간 동안 굽습니다. 이는 슬라이스와 커버슬립 사이의 접착력을 향상시키고 후속 염색 과정에서 부유를 줄이기 위함입니다.
5. 구운 조각을 순수한 자일렌에 순차적으로 담가 파라핀을 제거한 다음 절대 에탄올, 그라디언트 에탄올(100%, 95%, 80%, 70%) 및 물을 통해 각각 2분 동안 일련의 탈수를 하여 탈파라핀화 및 재수화 과정을 완료합니다.
6. 탈파라핀화된 조각을 헤마톡실린 염색 용액에 담그고 10분 동안 염색합니다. 흐르는 물로 헹구어 결합되지 않은 헤마톡실린을 제거합니다.
7. 헤마톡실린 염색 절편을 에오신 염색 용액에 담그고 2분 동안 염색하여 세포질과 결합 조직을 착색합니다. 염색 효과를 고정하기 위해 1% 아세트산 용액으로 헹굽니다.
8. 쥐의 대퇴골 표본 조각을 70%, 80%, 90%, 95% 및 100% 에탄올에 순차적으로 담그고 각 그라디언트를 사용하여 2분 동안 점차적으로 수분을 제거합니다.
9. 쥐의 대퇴골 표본 조각을 투명도를 위해 순수한 자일렌에 담근 다음 흐르는 물로 헹구어 자일렌을 제거합니다. 중성 장착 수지를 적용하고 슬라이드를 덮고 부드럽게 두드려 기포를 제거한 다음 장착 매체가 응고되도록 하여 장착 프로세스를 완료합니다.
10. R의 randomizr 패키지를 사용하여 각 그룹에 대해 30개의 HE-stainedslide를 선택하고 각각 15개의 슬라이드를 두 명의 연구자에게 할당합니다. 그룹화에 대해 알리지 않고 연구원에게 슬라이드의 빈 틈새율을 계산하고 통계 분석을 위해 결과를 수집하도록 요청합니다.

9. MicroCT 분석

1. 모델링이 완료되면 쥐를 안락사시킵니다. Hematoxylin-Eosin 염색을 위해 대퇴골을 제거합니다.
2. 쥐의 대퇴골을 4% 파라포름알데히드에 24시간 동안 담그어 생물학적 조직을 표본으로 보존합니다. 쥐의 대퇴골을 작은 동물 특이적 microCT 장치에 넣습니다.
3. microCT 스캔 조건을 다음과 같이 설정합니다: X선 전압: 80 kV, 전류: 100 μA, 단일 노출 시간: 50 ms, 스캐닝 해상도: 25 μm. 0.5° 간격으로 스캔을 수행하며, 연골 아래에서 골단골의 상부까지의 관심 부위에 초점을 맞춥니다.
4. 쥐의 대퇴골 목 위의 영역을 관심 영역으로 정의합니다.
5. microCT 장치를 사용하여 스캐닝 결과의 코로나 평면 재구성을 수행하고 microCT 장치의 내장 소프트웨어에서 생성된 뼈 형태 측정 측정값을 수집합니다. 다음과 같은 관찰 지수를 기록하십시오: 총 부피(TV), 골 부피 퍼센트(BV/TV), 뼈 표면/부피 비율(BS/BV), 구조 두께(Tb.Th), 구조 분리(Tb.Sp), 뼈 수(Tb.N), 뼈 밀도(BD).

10. 통계 분석

1. 데이터를 평균 ± 표준 편차(SD)로 표시합니다. 독립 표본 t-test를 사용하여 micro-CT 및 정량적 조직학적 평가를 위한 통계 분석을 수행합니다. p-값 < 0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주합니다.

결과

조직병리학 분석
헤마톡실린(Hematoxylin)과 에오신(eosin) 염색 결과, 대조군과 대조군+하중군에서 골섬유주가 온전하고 규칙적으로 배열되어 있는 것으로 나타났다. 혈관 내피 세포는 뼈 보조개에 존재했으며 세포 형태는 통통하게 보였습니다. 대조적으로, 모델 그룹과 모델+하중 그룹은 골절되고 무질서한 뼈 섬유주(bone trabeculae)를 보였으며 빈 틈새의 수가 ?...

토론

현재 토끼(²⁵), 쥐(²⁶), 생쥐(²⁷), 돼지(²⁸), 육계(²⁹), 타조(^{8), 에}뮤(³⁰ )와 같은 다양한 동물을 사용하여 대퇴골두 괴사의 모델을 확립할 수 있다. 그 중 쥐, 생쥐, 토끼가 가장 일반적으로 사용되는 종입니다. 쥐는 대퇴골두 괴사의 모델로서 많은 이점?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
15ml centrifuge tube	Corning,USA	430791
5mm stainless steel bead	Gelisen,China	5mm
Acetic acid	Merck KGaA, Germany	64-19-7
Anhydrous alcohol	Merck KGaA, Germany	64-17-5
clay	Mincai stationery,China	102
Coverslip	Servicebio,China	WMWD-1818
Flat pressure bottle 10ml	BEHNCKE,China	MD10ml
Formic acid	Macklin Biochemical ,China	64-18-6
HE staining kit	Solarbio,China	G1120
HistoCore AUTOCUT	Leica, Germany	149AUTO00C1
Kinesio tape (elastic therapeutic tape)	Fuluo medicine,China	CL1819
Lipopolysaccharide	Solarbio,China	L8880
Lipopolysaccharides (LPS)	Selleck,USA	S7850
Manual carbon dioxide euthanasia box	Yuyan,China	LC-500-S1
Methylprednisolone sodium succinate,MPS	AbMole,China	M25573
MicroCT	Hiscan,China	Hiscan VM Pro
Neutral resin	Beijing Zhongshan Golden Bridge Biotechnology l ,China	ZLI-9555
Paraffin	Servicebio,China	WGHB-319213129
Paraformaldehyde	Servicebio,China	G1101-500ML
Potassium chloride	Macklin Biochemical ,China	7447-40-7
Slide	Servicebio,China	WG6012
Treadmill for Rats and  mice	Litc Life Science,USA	801
Xylene	Macklin Biochemical ,China	1330-20-7