Electrospraying 기술을 사용한 Black Seed Oil-loaded-, Alginate-based, pH-sensitive beads의 합성

요약

높은 전압과 표적화된 활성 성분 부하 에멀젼을 사용하여 pH에 반응하는 균일한 마이크로비즈를 제조하는 기술이 제시됩니다.

초록

Nigella sativa 식물의 씨앗에서 추출한 블랙 씨드 오일(BSO)은 특히 대장암과 관련하여 잠재적인 항암 특성으로 주목을 받았습니다. 활성 화합물인 티모퀴논은 암세포 성장을 억제하고 대장암 세포의 세포사멸을 유도하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한 블랙씨드 오일의 항염증 및 항산화 효과는 더 건강한 장 환경에 기여하여 잠재적으로 암 위험을 줄일 수 있습니다. 따라서 본 연구에서는 pH 1.2(위)에서 약물을 방출하지 않고 통제된 방출 방식으로 BSO를 결장에 전달하기 위해 pH에 민감한 알긴산 비드를 합성하여 pH 6.8에서 잘 정의된 방출 패턴을 제공했습니다. 전기 분무 기술을 사용하면 위장 배지에서 더 높은 팽창 및 확산 속도를 가진 작고 균일한 비드를 더 쉽게 공식화할 수 있으므로 공정 성능이 향상됩니다.

제형화된 비드는 생체 외 점액접착 강도 테스트, 비드 크기, 구형도 계수(SF), 캡슐화 효율(EE), 주사 전자 현미경(SEM), 체외 팽창 거동(SB) 및 산성 및 완충 배지에서 체외 약물 방출을 특징으로 합니다. 이 모든 제조 된 비드는이 테스트에서 0.58 ± 0.01 mm의 적당한 크기와 0.03 ± 0.00 mm의 구형 모양을 보여주었습니다. 이 제형은 시험관 내에서 유망한 부유 및 방출 특성을 보여주었습니다. 비드의 누적 비율이 매우 낮아 오일 EE가 90.13%± 0.93%로 높았으며, 방출 연구에서는 pH 6.8에서 90% 이상이 이상이며 위장에 부유성이 양호함을 보였다. 또한, 구슬은 장 전체에 걸쳐 균일한 간격으로 분포되어 있었습니다. 이 프로토콜에 사용된 전기 분무 접근법은 재현 가능하여 일관된 결과를 얻을 수 있습니다. 따라서 이 프로토콜은 상용화 목적의 대규모 생산에 사용할 수 있습니다.

서문

블랙 씨드, 특히 BSO는 잘 확립된 약효로 인해 다양한 질병을 치료하는 데 오랫동안 사용되어 왔습니다. 티모퀴논은 아마도 BSO¹에서 발견되는 가장 중요한 식물 화학 물질 중 하나일 것입니다. 최근 몇 년 동안 연구자들은 티모퀴논의 생체 내 및 체외에서의 잠재적인 치료 효과를 연구하여 BSO의 사용을 뒷받침하는 경험적 증거를 제시했습니다. 항고혈압, 항균, 항히스타민제, 항진균제, 진통제, 항당뇨병제, 지질 저하 및 항염증 특성은 모두 습진, 고혈압, 천식, 기침, 두통, 인플루엔자, 발열, 항암, 현기증 및 활동과 같은 증상을 치료하는 데 사용될 수 있는 BSO에 대한 이러한 연구를 통해 입증되었습니다 ^2,3.

액체와 분산액의 작은 방울 또는 고체 물질 입자에 비교적 얇은 덮개를 적용하는 것을 마이크로 캡슐화라고 합니다. 오일의 경우 BSO와 같은 일부 형태의 오일은 영양가 있는 식품으로 간주되고 의약상의 이점을 제공하기 때문에 미세캡슐화 오일은 일반적으로 매우 가치가 있습니다⁴. 그러나 식품의 매트릭스에 오일을 직접 첨가하면 휘발이 발생할 수 있으며, 이는 산소와 자외선에 노출되어 활동을 빠르게 사라지게 할 수 있습니다⁵. 더욱이, 오일의 방출 속도에 대한 통제의 부족은 즉각적이고 일시적인 효과를 초래합니다. 마이크로 캡슐화 또는 마이크로 스페리케이션을 통해 에센셜 오일 주위에 고분자 코팅을 만드는 것은 이러한 단점을 극복하는 한 가지 방법입니다⁶.

마이크로스피어(microsphere)라고도 하는 마이크로캡슐은 유해한 환경 조건으로부터 오일을 보호합니다⁷. 이 공정은 약물 효능을 증가시키고, 약물 함량을 보존하고, 서방형 정제를 가능하게 하고, 미각 마스킹을 개선하고, 제품 유통 기간 동안 풍미 손실을 줄이고, 식감을 연장하고, 단일 용량으로 호환되지 않는 성분을 분리하는 데 널리 사용되었습니다⁸. 마이크로 캡슐화는 또한 대사 흡수를 유지하고, 오일 방출 속도를 제어하며, 특정 위치에서 의도한 결과를 얻을 수 있도록 적절한 농도를 유지하는 데 도움이 됩니다⁹.

전기 유체역학 캡슐화는 간단하고 적응 가능한 방법입니다. 활성 물질은 외부 껍질로 구성된 마이크로캡슐의 내부 코어에 들어 있습니다. 이와 관련하여, 이는 명확하게 정의된 핵보다는 활성 성분이 더 효과적으로 전파될 수 있음을 보장하기 위해 상당히 강력한 매트릭스를 특징으로 합니다. 스페리환화(sphericyclation) 전에, 활성 물질과 고분자 용액은 마이크로스피어(microspheres)를 생성하기 위해 결합되어야 한다⁹. 반면에 오일은 휘발성이기 때문에 오일을 마이크로 캡슐화하는 것은 매우 어려울 수 있으며 신중한 온도 제어가 필요합니다.

오일을 캡슐화하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 예를 들어, 특정 오일은 생체 활성 성분의 분해 또는 휘발을 방지하기 위해 저온에서 캡슐화해야 합니다. 마이크로 및 나노 크기의 구조를 만들기 위해 연구자들은 전기유체역학적 분무(EHDA)를 광범위하게 연구했습니다¹⁰. 이러한 의미에서, 고분자 용액의 수집 거리 특성뿐만 아니라 유량, 인가 전압 및 노즐 크기를 포함하는 가공 조건은 원하는 입자 크기 또는 형태를 생성하기 위해 고려해야 하는 두 가지 주요 요소입니다^11,12.

이 조사에서는 경구 섭취에 적합한 자연 발생 다당류의 일종인 알긴산염을 사용하여 BSO를 캡슐화했습니다. 갈색 해초에는 자연적으로 발생하는 음이온 성 중합체인 알긴산이 포함되어 있습니다. 그것은 두 개의 단량체 구조로 구성됩니다 : α-L-guluronic (G) 및 1-4βD-mannuronic (M) 산¹³. 그것의 중합체는 무독성¹⁴ , 높은 수준의 생체 적합성을 가지며 저렴하고 효과적으로 분해됩니다¹⁵ . 따라서 생명 공학 및 엔지니어링 분야에서 자주 사용됩니다.

알긴산염은 Sr²⁺, Ca²⁺ 또는 Zn²⁺ 이온과 같은 2가 양이온과 이온 연결을 형성하여 다양한 알긴산 사슬의 G 그룹 사이에 가교 구조를 생성할 수 있기 때문에 이온 겔화에 의한 캡슐화를 위해 선택되는 재료입니다. 겔화 과정은 달걀 상자 모델(egg-box model)에 의해 적절하게 특성화될 수 있으며, 이는 2가 양이온을 나란히 있는 알긴산 분자에서 두 개의 카르복실기로 제한합니다. 알긴산 나트륨 비드의 하이드로겔 특성이 거대분자 및 소분자의 방출을 조절할 수 있다고 제안되었습니다. 알긴산 나트륨 구슬은 점액 접착 특성으로 인해 장 점막에 장기간 달라붙을 수 있습니다. 더욱이, 알기네이트는 산성 매체(¹⁶)와 같은 외부 요소로부터 오일을 보호할 수 있는 보호막을 제공하고 오일을 위장관⁽¹⁷)의 전달 채널로 전달합니다. 이후 점막 조직에 대한 약물의 부위 특이적 투여를 돕기 위한 연구에 사용되어 왔습니다^18,19.

이 연구에서는 전기 유체역학적 접근법을 사용하여 상업용 오일을 유화하여 캡슐을 만드는 실행 가능성을 조사했습니다²⁰. 여기서, 전기 유체역학 접근법은 알긴산-BSO가 로드된 마이크로스피어(²⁰)를 생성하고 분석하는 데 사용되었습니다. 이 연구는 미세구의 SF, 생체 외, 점막 접착 특성, EE%, 물리적 외관, 크기 분포 및 제타 전위를 포함한 여러 다른 요인을 평가했습니다. 화학적 호환성을 테스트하기 위해 감쇠 전반사-푸리에 변환 적외선(ATR-FTIR) 분광법을 활용했습니다²⁰.

프로토콜

1. 알긴산-BSO 에멀젼의 제조

1. 50mL 비커에 1, 3 및 5% w/v 레시틴을 함유한 1% w/v 알긴산 나트륨 용액에 10% w/v BSO를 분산시킵니다.
2. 초음파 균질기를 사용하여 나노 에멀젼을 얻습니다. 전력 수준을 20%로 설정합니다. 시작 버튼을 클릭하여 55초 동안 균질기를 실행하여 프로세스를 완료합니다.

2. 알긴산-BSO 에멀젼의 특성화

1. 제타 전위 및 입자 크기 분포 분석
   1. 25mL 유리 비커에 갓 준비한 에멀젼 0.1mL를 넣고 증류수 9.9mL로 희석합니다.
   2. 이 희석된 용액 2.5mL를 3mL 석영 큐벳에 넣고 큐벳을 측정 챔버에 넣습니다.
   3. 덮개를 열고 큐벳을 장치 내부에 놓고 큐벳이 광선의 경로에 대해 올바른 방향인지 확인합니다. 측정 아이콘을 클릭합니다.
   4. 큐벳을 꺼냅니다. 샘플을 회수하거나 적절하게 폐기하십시오.
   5. 나중에 사용할 수 있도록 개인 폴더에 데이터를 pdf 파일로 저장합니다.
2. 에멀젼 안정성(ES) 측정
   1. 10mL 원심분리 튜브에 갓 준비한 에멀젼 5mL를 넣습니다. 에멀젼(n = 3)을 894 × g에서 5분 동안 원심분리합니다.
   2. 식 (1)을 사용하여 위상 분리 인터페이스 위치를 기반으로 ES를 결정합니다.
      (1)
      여기서 Vemul은 원심분리 후 남아 있는 에멀젼의 부피이고 Vinitial은 초기 에멀젼의 부피입니다.
3. 비드 준비
   1. BSO 알긴산 비드
      1. EHDA라는 전기 분무 기술을 사용하여 BSO 알긴산 비드를 준비합니다. 10% BSO, 1% 알긴산나트륨 및 3% 레시틴 용액으로 구성된 부피별 중량(w/v) BSO 에멀젼을 사용합니다.
      2. 주사기 펌프를 사용하여 유속을 조절하고 10mL 플라스틱 주사기에 에멀젼을 넣고 22G 바늘로 밀어 넣습니다. 바늘 끝을 높은 볼륨의 양극에 부착합니다.tag전자 전원 공급 장치.
      3. 수집기로 50% w/w 염화칼슘(겔화 수조) 50mL가 들어 있는 접지된 비커를 사용하십시오. 염화칼슘 용액 표면에서 10cm 이상의 거리를 유지하면서 3, 5 및 7kV의 전압에서 1mL/분과 3mL/분 사이에서 적하 유속을 번갈아 가며 사용합니다.
      4. 완전한 겔화를 확인하려면 구슬을 교반하는 동안 겔화 욕조에 30분 동안 그대로 두십시오. 스테인리스 스틸 필터를 사용하여 겔화 수조에서 비드를 제거하고 수집된 비드를 초순수 증류수로 세척합니다.
      5. 실험실 벤치에서 실온에서 16시간 동안 비드를 건조시킵니다. 방정식 (2)를 사용하여 비드의 수율 백분율을 계산합니다.
         (2)
   2. BSO가 없는 알긴산 비드
      1. 1% w/v 알긴산 나트륨 용액을 준비합니다. 용액에 1%, 3% 및 5% w/v 농도의 레시틴을 추가합니다. 레시틴이 완전히 용해될 때까지 용액을 철저히 혼합합니다.
      2. 2.3.1.2-2.3.1.5단계에 설명된 대로 2.3.2.1단계의 용액을 사용하여 BSO가 없는 알긴산 비드를 준비합니다. 방정식 (2)를 사용하여 수율을 계산합니다.

3. 비드 특성화

1. 크기와 모양의 결정
   1. 비드의 크기와 모양을 확인하려면 이미지 분석기를 사용하십시오. 디지털 카메라를 사용하여 젖은 구슬과 말린 구슬의 사진을 찍습니다.
   2. 그런 다음 기기에 사전 설치된 스케일 바를 사용하여 비드 직경을 측정합니다. 지름 값을 사용하여 방정식 (3)을 사용하여 얻은 지름 값에서 SF를 계산합니다.
      SF = (3)
      여기서 Dmax는 비드의 중심을 통과하는 가장 큰 직경(mm)을 나타내고, Dper는 Dmax에 수직이고 비드의 중심을 통과하는 직경(mm)을 나타냅니다.
      참고: SF가 0이면 이상적인 구형 비드를 나타내며, SF 값이 증가하면 구형 모양에서 편차가 크다는 것을 의미합니다. 또한 구슬은 SF가 0.05 이하인 경우 구형으로 간주됩니다.

4. EE%의 결정

1. 비드를 인산염 완충 식염수(PBS)에서 분해하여 에멀젼으로 되돌립니다. UV-vis 분광 광도계를 사용하여 600nm에서 생성된 에멀젼의 흡광도를 측정합니다.
2. 흡광도 값을 사용하여 에멀젼의 탁도를 나타냅니다. 에멀젼에서 알려진 양의 BSO를 사용하여 표준 곡선을 만듭니다.
3. 방정식 (4)를 사용하여 EE%를 계산합니다.
   (4)

5. 주사 전자 현미경 (SEM)

참고: SEM을 사용하여 BSO 알긴산 비드의 미세 구조 및 표면 형태를 관찰합니다.

1. 건조된 구슬의 내부를 검사하려면 그 중 몇 개를 자릅니다. 자른 구슬을 알루미늄 스텁에 찾아 탄소 접착 테이프를 사용하여 붙입니다.
2. 아르곤 대기의 진공 증발기에서 탄소 스퍼터 모듈로 비드를 스퍼터 코팅합니다. 탄소 코팅을 위해 100 Å 및 50 Å의 두께를 적용하십시오.
3. 10kV와 15kV 사이의 전압 가속기를 사용하여 고진공에서 코팅된 비드의 이미지를 획득합니다.

6. ATR-FTIR을 사용하여 약물-부형제 상호 작용 확인

1. 주변 공기를 배경으로 사용하여 4,000cm-1에서 400cm-1 사이로 계측기 파수를 설정하고 ^1cm-1의 해상도를 설정합니다. 보충 파일 1을 참조하십시오.
2. BSO, 알긴산 나트륨, 레시틴, 염화칼슘, BSO가 없는 비드, 알긴산-BSO 비드 및 활성 성분 및 부형제(알긴산 나트륨, 레시틴, 염화칼슘 및 BSO)의 물리적 혼합물의 스펙트럼을 별도로 기록합니다.
   1. s를 놓습니다.amp링 영역에 le(5-10mg). 20 스캔, 해상도 4, 게이지 힘 80, 평평한 팁이 있는 압력 암을 조정합니다. 스펙트럼이 원하는 폴더에 자동으로 저장되도록 Auto Increment(자동 증가 )가 Blank(공백 ) 옵션으로 설정되어 있는지 확인합니다.
   2. 샘플 측정을 시작하려면 [Sample] 버튼을 클릭합니다. [Sample]을 선택한 후에는 대기 시간이 없으므로 반드시 샘플을 준비하고 압력 클램프를 줄이십시오. 모든 샘플을 개별적으로 분석합니다. 분광학 소프트웨어를 사용하여 기록된 모든 스펙트럼을 개별적으로 분석합니다.

7. 시차 주사 열량계(DSC)

참고: BSO-로딩 비드의 열적 특성 및 호환성은 DSC(Supplemental File 1)를 사용하여 조사되었습니다.

1. 일반 알루미늄 팬에 ~3.20mg 무게의 구슬을 밀봉합니다. 20 L/min의 속도로 흐르는 질소 흐름에서 50-350 °C의 온도 범위에서 분석하면서 샘플을 10 °C/min의 속도로 가열합니다.

8. 구슬의 팽윤 특성

1. 건조 알긴산-BSO 비드 100mg을 준비합니다.
2. 적절한 크기-6 L, 10 L 또는 25 L의 깨끗하고 건조한 혼합 용기에 모의 장액(SIF) 및 모의 위액(SGF)을 준비합니다. 필요한 부피-2L, 3L 또는 8L의 약 33%에 정제수를 추가하고 농축액 병의 내용물을 용기로 옮깁니다. 정제수로 병을 헹구고 헹굼과 정제수를 혼합 용기에 추가하여 필요한 부피를 얻습니다. 철저히 섞는다. pH를 측정하고 사양 내에 있는 경우 계속 진행합니다. 필요한 경우 pH를 조정하십시오.
3. SIF(simulated intestinal fluid) 및 SGF(simulated gastric fluid)가 포함된 50mL의 배지에 비드를 담그십시오. 37 ± 0.5 °C에서 2 시간 동안 조건을 유지하십시오.
   1. 팽창된 비드를 제거하고 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120분 이상의 미리 정의된 간격으로 금속 메쉬를 통해 필터링합니다. 종이 타월을 사용하여 부풀어 오른 구슬에서 여분의 액체를 제거하십시오.
   2. 전자 분석 저울을 사용하여 닦은 비드의 무게를 측정합니다. 방정식 (5)를 사용하여 팽창 지수의 백분율(%SI)을 계산합니다.
      (5)

결과

BSO가 로드된 알기네이트 마이크로비드의 제조
그림 1은 BSO가 로드된 알기네이트 마이크로비드를 제조하기 위한 실험 설정을 나타냅니다. 사용된 레시틴의 양은 BSO 에멀젼의 안정성에 상당한 영향을 미쳤습니다. 세 가지 레시틴 농도 모두로 만든 에멀젼은 비교적 안정적이었습니다. 이 실험에서는 원심분리 방법(894 × g, 5분)을...

토론

EHDA 공정을 사용하여 BSO 로딩 알기네이트 마이크로비드를 pH 민감성 담체로 만들었습니다. 비드의 네트워크는 카르복실산기의 풍부한 존재로 인해 pH 의존성 팽창 및 약물 방출 거동을 보였습니다. 폴리머 사슬 사이의 강력한 분자간 수소 결합은 pH 1.2에서 BSO 로딩 비드의 팽창 특성이 감소한 원인으로 밝혀졌습니다. BSO가 로드된 비드는 pH에 민감한 약물 투여를 위해 이러?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL Centrifuge Tubes	Globe Scientific	22-171-624
22 G needle	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	CAD4172
3 mL quartz-cuvette	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	Z276669
50 mL beaker
Aluminum stubs
An electronic analytical balance
ATR-FTIR	Bruker Malaysia Sdn Bhd, Kawasan Perindustrian Temasya, 40150 Shah Alam, Selangor, Malaysia.
Black seed oil	IKOP Pharmaceutical Ltd. (IKOP, Faculty of Pharmacy, IIUM, 25200 Kuantan, Pahang, Malaysia	B182111	Active ingredient
Calcium chloride dehydrate, CaCl2 · 2H2O	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	21074	Gelling agent
Carbon adhesive tapes
Centrifuge
Differential scanning calorimetry
Digital   camera
Grounded beaker
High guluronic acid content Sodium alginate (mw. 97,000) with medium viscosity (40 – 100 mPa s)	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W201502	Polymer
High voltage power supply
Isopropyl alcohol	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	W292912	ATR-FTIR cleaning purpose
Lecithin	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	P7568	Surfactant
Microscope
Paper towel
Scanning electron microscopy
Simulated gastric fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	1651	Release media and swelling media
Simulated intestinal fluid	Sigma-Aldrich (St.Louis, Missouri, USA).	84082-64-4	Release media and swelling media
Spectroscopy software
Stainless-steel filter
Syringe pump	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Ultrapure distilled water	Supplied by institutional lab
Ultrasonic homogenizer	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
UV-vis spectrophotometer.
Vacuum evaporator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Voltage accelerator	SEN JIN SDN BHD Malaysia, Taman Desaria, 46150 Petaling Jaya, Selangor Darul Ehsan Malaysia
Zetasizer Nano-ZS	(Malvern Zetasizer Nano series Nano-S and Nano-Z, Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)