Murine Breast Cancer Metastases의 나노약물 축적 모니터링

요약

여기에서는 동물 모델에서 RNA 올리고머를 운반하는 자성 산화철 나노입자를 전이성 유방암으로 생체 내 전달하기 위한 프로토콜을 설명하여 발암성 핵산의 치료적 침묵을 위한 임상적으로 실행 가능한 접근 방식을 제공합니다.

초록

전이성 유방암은 치료 옵션이 매우 제한된 파괴적인 질병이므로 새로운 치료 전략이 필요합니다. 발암성 miRNA는 유방암의 전이 가능성과 관련이 있는 것으로 나타났으며 종양 세포 이동, 침입 및 생존력과 관련이 있습니다. 그러나 관심 조직에 억제성 RNA 분자를 전달하는 것은 어려울 수 있습니다. 이 문제를 극복하고 활성 안티센스 올리고뉴클레오티드를 종양에 전달하기 위해 자성 산화철 나노입자를 전달 플랫폼으로 활용했습니다. 이러한 나노 입자는 염증이나 암 부위와 같이 혈관 투과성이 증가된 조직을 표적으로 합니다. 이러한 나노 입자의 전달은 자기 특성으로 인해 자기 공명 영상(MRI)을 통해 생체 내에서 모니터링할 수 있습니다. 이 치료적 접근 방식을 임상으로 번역하는 것은 이 관련 이미징 방식과의 호환성으로 인해 더 쉽게 접근할 수 있습니다. 또한 상관 광학 이미징 및 형광 현미경 검사를 위한 Cy5.5 근적외선 광학 염료와 같은 다른 이미징 리포터로 라벨링할 수 있습니다. 여기에서는 Cy5.5로 표지되고 정맥 주사로 투여된 발암성 miRNA-10b(MN-anti-miR10b 또는 "나노약물"이라고 함)를 표적으로 하는 치료용 올리고머에 접합된 나노입자가 전이성 부위에 축적되어 전이성 유방암의 치료 개입 가능성을 열어줍니다.

서문

유방암 치료에 있어 많은 발전이 이루어졌음에도 불구하고 전이성 질환에 대한 임상 옵션은 여전히 제한적입니다. 환자들은 일반적으로 에스트로겐이나 HER2와 같은 원발성 종양에서 확인된 동인에 대한 치료를 받지만, 이러한 동인은 전이에서 항상 보존되는 것은 아니기 때문에 치료가 효과가 없다¹. 화학 요법과 같은 다른 전신 요법은 비특이적이며 부작용으로 알려져 있습니다. 전이성 유방암 치료를 위한 효과적인 옵션을 개발하려면 암세포가 멀리 떨어진 부위로 퍼져 군집화할 수 있도록 하는 생물학적 동인을 고려하는 것이 중요합니다. 이러한 동인 중 하나는 유방암 세포의 생존력, 침입 및 이동과 관련된 발암성 microRNA인 miR-10b로, 그렇지 않으면 비전이성 유방암 세포에 전이성 가능성을 부여하기에 충분한 것으로 나타났습니다 ^2,3. 중요한 것은 miR-10b가 일치하는 원발성 종양에 비해 전이에서 더 높은 수준으로 발현된다는 것입니다⁴ 기존 전이 치료에 유망한 표적이 됩니다.

miR-10b와 같은 miRNA는 전이성 질환의 치료 표적으로서 큰 잠재력을 가지고 있지만, miRNA 침묵을 위한 치료적으로 실행 가능한 방법의 설계는 고유한 과제를 제시합니다. 상보적 miRNA 염기서열과 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(Antisense oligonucleotide, ASO)는 일반적으로 리포펙션(lipofection)을 사용하여 in vitro 세포로 전달되지만, 내재적 불안정성, 뉴클레아제에 의한 파괴 위험, 짧은 혈액 반감기, 전하-전하 반발력으로 인한 세포 진입 불능으로 인해 생체 내 종양 세포에 쉽게 도달할 수 없음⁵. 이러한 문제를 해결하기 위해 당사는 덱스트란 코팅된 자성 산화철 나노입자(MNP)⁶를 사용하여 생체 분자에 임상적으로 적용 가능한 운반체를 개발했습니다. 나노 입자의 아민기는 올리고뉴클레오티드, 형광 염료(예: Cy5.5) 및 표적 부분의 접합을 허용합니다. 또한 산화철 코어는 자기 공명 영상(MRI)을 사용하여 차량 전달의 생체 내 모니터링을 가능하게 합니다. 그림 1⁷에 나타난 바와 같이 anti-miR-10b locked nucleic acid ASO와 Cy5.5를 MNP에 접합하여 MN-anti-miR10b라고 하는 "나노약물"을 생성했습니다.

이전 연구에서 우리는 나노 약물이 miR-10b의 하향 조절을 효율적으로 유발하고 in vitro⁷에서 삼중 음성 유방암 세포의 이동 및 침입을 억제한다는 것을 보여주었습니다. 전이성 유방암의 쥐 모델에서, 나노약물의 정맥 투여는 림프절 전이의 발생을 예방하거나, 림프절 전이 형성 후 투여하면 림프절 전이의 성장을 멈췄다⁷. 특히, 나노 약물은 암 조직에 쉽게 축적되는 것이 관찰되었습니다. 나노약물이 단독으로 전이를 근절하지는 못했지만, 후속 연구에서 면역저하 및 면역 능력이 있는 마우스 모델 모두에서 보조제인 독소루비신과의 병용 치료가 치료효과가 있음을 보여주었습니다 ^3,8. 나노약물에 의한 miR-10b 억제의 효과는 고양이 유선암에서도 관찰되었다⁹.

유방암을 효과적으로 치료하기 위해서는 약물이 관심 조직에 축적된다는 것을 입증하는 것이 필수적입니다. 여기에서는 전이성 유방암의 쥐 모델에서 여러 양식을 사용하여 암 조직에 치료용 anti-miR-10b ASO를 전달하는 데 사용되는 자기 나노 입자 운반체의 축적을 입증하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

프로토콜

미시간 주립대학교 기관 동물 관리 및 사용 위원회(IACUC)는 동물 피험자와 관련된 모든 절차를 승인했습니다. 계산 값은 표 1에 요약되어 있습니다.

1. MN-anti-miR10b 합성의 주요 단계

참고: MN-anti-miR10b 합성에 대한 자세한 내용은 이전에^{설명되었습니다 9,10,11}.

1. 자성 나노입자(MN) 코어를 공동침전법(co-precipitation method)으로 준비한다.
2. 수산화나트륨(sodium hydroxide), 에피클로로히드린(epichlorohydrin) 및 수산화암모늄(ammonium hydroxide)을 사용하여 제조된 나노입자를 가교결합하고 아민화합니다.
3. 이종작용기 가교제 N-숙시니미딜 3-[2-피리딜디티오]-프로피오네이트(SPDP)를 통해 Cy5.5-NHS 에스테르를 MN에 접합하여 MN-Cy5.5를 얻어 형광 이미징 및 현미경 검사를 가능하게 합니다.
4. 3% 트리스(2-카르복시에틸)포스핀(TCEP)으로 anti-miR-10b 잠금 핵산을 활성화하고 MN-Cy5.5에 접합하여 MN-anti-miR10b를 생성합니다.
5. 접합체의 특성 분석을 수행하여 철 함량(철 분석), 나노 입자당 Cy5.5 분자 수(분광 광도법 기준) 및 접합 LNA의 양(아가로즈 겔 전기영동에 의해)을 측정합니다.

2. 연구 동물 확보

1. 실험 그룹과 그룹당 동물 수를 계획하기 위해 사전에 연구 개요를 설명합니다. 케이지당 최대 5마리의 마우스를 수용할 수 있습니다. 치료 중 5마리의 마우스로 구성된 여러 케이지를 사용하는 경우, 각 케이지 내에 대조군 및 실험용 마우스를 두어 케이지를 교란 변수로 제거해야 합니다.
2. 생후 6-7주령에 쥐를 구하십시오. 정형종양이 유발되기 전에 최소 1주일의 주거 환경에 적응할 수 있습니다.
   참고: 자연유방암 전이의 MDA-MB-231(인간 유래 세포주) 모델을 사용하는 절차는 다음과 같습니다. 이 모델의 경우 흉선 누드 마우스(Foxn1^nu/Foxn1^nu)가 일반적으로 사용됩니다. 다른 호환 가능한 면역 저하 마우스 균주를 사용할 수 있으며, 이 절차는 면역 능력이 있는 마우스의 동종이식 모델(예: BALB/c 마우스의 4T1 유방암 세포)에도 적용할 수 있습니다.

3. 배양 세포

1. Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)에 10% 소 태아 혈청(FBS) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(완전 성장 배지)을 첨가하여 루시페라아제(예: MDA-MB-231-luc-D3H2LN)를 발현하는 MDA-MB-231 세포를 성장시킵니다. 일반적으로 T75 플라스크에서 37°C, 5% CO₂ 및 95% 습도의 무균 조건에서 세포를 성장시킵니다. 동결된 경우 종양 이식 전에 적어도 한 번 세포와 통로를 해동하십시오. 플라스크에 통로 번호를 기록하십시오.
   참고: 이 연구에서는 1 × 10⁶ 세포로 구성된 이전에 냉동된 바이알을 사용하기 전에 두 번 해동하고 계대배양했습니다.
   1. 계대에 37°C에서 3분 동안 0.25% 트립신을 적용하여 <80%의 포화도에서 세포를 트립신화합니다. 트립신을 중화하기 위해 4배의 완전 성장 배지를 추가합니다.
   2. 원뿔형 튜브에서 200 × g 에서 5분 동안 서스펜션을 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅한 후 5mL의 완전한 성장 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 세포의 일부를 새 플라스크에 분취하고 새 플라스크 부피에 따라 완전한 성장 배지를 추가합니다. 새 플라스크의 통로 번호를 업데이트합니다.
2. 연구 전반에 걸쳐 유전적 부동을 최소화하기 위해 10번의 계대 후에 새로운 세포를 해동합니다.

4. orthotopic tumors의 유도를 위한 세포의 준비

1. 준비하기 전에 냉동 Matrigel(기저막 매트릭스 추출물)을 4°C에서 24시간 동안 두어 매트릭스 추출물이 액화되도록 합니다.
2. 연구에 필요한 세포의 농도와 부피를 결정합니다. 마우스당 1 × 10⁶ 세포를 50 μL 부피에 주입하며, 이는 1 파트의 chilled PBS와 1 파트의 매트릭스 추출물로 구성됩니다.
3. 3.1.2단계에서 설명한 대로 트립신화된 세포를 펠렛화합니다. 세포 펠릿을 최소 10mL의 PBS에 재현탁시켜 세포를 세척한 다음 200×g에서 5 분 동안 다시 한 번 원심분리합니다. 펠릿을 500μL의 냉각된 PBS(세포 스톡)에 재현탁합니다.
4. 혈구계를 사용하여 세포를 세십시오. 세포의 농도가 높으므로 필요에 따라 작은 부분 표본(예: 10μL)을 희석하고 정확한 측정을 수행할 수 있을 때까지 희석 계수를 추적합니다.
5. 필요한 총 세포 수를 40 × 10⁶ cells/mL로 희석한 다음 동일한 부피의 냉각 매트릭스 추출물을 추가하여 50 μL당 1 × 10⁶ cells의 최종 농도를 달성합니다. 이식 전에 추출물이 응고되는 것을 방지하기 위해 얼음 위에 보관하십시오.
   참고: 세포 농도는 표 1에 요약되어 있습니다.

5. 정소성 종양의 유도

1. 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취한 다음 노즈콘으로 옮기고 발열 패드에 0-3% 이소플루란을 사용하여 수술 마취면을 유지합니다. 각막 반사 및/또는 발가락 꼬집 반응의 부족으로 마취의 수술 평면을 확인합니다. 안과 연고를 눈에 발라 각막이 건조해지는 것을 방지하십시오.
2. 70% 알코올 물티슈로 주사 부위 근처의 피부를 닦고 알코올이 마를 때까지 몇 초 동안 기다립니다. 원발성 종양과 가장 흔한 전이 부위(폐 및 겨드랑이 림프절) 사이의 생물 발광 영상 신호의 중복 위험을 줄이기 위해 유선에서 유도 #4.
   참고: 유선(Mammary gland) 번호 매기기는 앞서¹²번 설명되었다. 간단히 말해서, 머리가 위쪽을 향하고 누운 자세의 마우스는 머리에 가장 가까운 곳(경추 - 분비선 1)에서 시작하여 가장 꼬리(서혜부 - 분비선 5)까지 내려가는 인젝터의 오른쪽(마우스의 왼쪽)에 1에서 5의 땀샘을 갖습니다. 6-10의 땀샘은 동물의 반대쪽에 비슷하게 배향되어 있습니다.
3. 세포를 위아래로 피펫으로 피펫하여 세포를 다시 현탁시킵니다. 29G 바늘로 인슐린 주사기에 얼음처럼 차가운 세포 현탁액 50μL를 뽑고 즉시 세포를 주입합니다. 즉시 주입할 수 없는 경우 주사기를 얼음 위에 보관하십시오.
   알림: 세포가 침전되는 것을 방지하기 위해 각 세포 추첨 사이를 위아래로 피펫합니다.
4. 원하는 유선의 젖꼭지 바로 아래에 있는 베벨을 해당 위치에서 마우스의 몸체와 평행하게 삽입하고 꾸준하고 느린 속도로 세포를 주입합니다. 주사 완료 후 최소 5초 동안 바늘을 피부 안에 두어 Matrigel이 응고되고 누출을 방지할 수 있도록 합니다.
5. 회복을 위해 마우스를 보온 패드의 깨끗한 케이지로 옮기고 완전히 보행할 수 있고 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 때까지 감독합니다. 마우스를 방치하지 마십시오. 마우스가 회복된 후에만 다른 마우스와 함께 케이지로 되돌려 놓습니다.

6. 생물발광 영상(BLI)을 통한 종양 성장 및 전이 발달 모니터링

참고: 여기에 사용된 MDA-MB-231 세포는 루시페라아제를 발현하기 때문에 루시페린 기질을 마우스에 주입하면 이미징 시스템 스캐너에서 감지된 광학 신호가 생성됩니다. 이 모델에서는 종양 유도 후 5-7주에 전이를 예상할 수 있습니다. 전이가 시각화되는 정확한 순간을 식별하는 것의 중요성에 따라 일주일에 1-3회 마우스를 이미지화하는 것이 좋습니다.

1. 루시페린을 투여할 때 마우스의 부상 위험을 최소화하기 위해 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취합니다. 안과 연고를 눈에 발라 각막이 건조해지는 것을 방지하십시오.
2. 체중 150mg/kg의 루시페린을 각 마우스에 복강내 주사하고 마우스가 깨어나 루시페린을 대사할 수 있도록 보온 패드에 넣어 케이지로 되돌려 놓습니다. 완전히 보행할 수 있고 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 때까지 마우스를 감독하고 방치하지 마십시오.
   참고: 투여 계산에 사용되는 값은 표 1에 요약되어 있습니다.
3. 루시페린 주입 후 약 10분 후부터 이미징 시스템 스캐너를 사용하여 마우스를 이미지화하고, IVIS로 이송할 시간을 허용하기 위해 필요할 때 마우스를 재마취합니다.
   1. 최대 5마리의 마우스를 누운 자세로 함께 이미지화하고, 몸 전체가 시야각 가이드 표시에 포함되고 가능한 한 직선 방향이 되도록 주의합니다. 겨드랑이 림프절을 더 잘 볼 수 있도록 투명 테이프를 사용하여 팔을 고정합니다. 한 번에 여러 마우스를 이미징하는 경우 매니폴드 디바이더를 사용하여 마우스를 분리하여 신호가 다른 마우스로 방출되는 것을 방지합니다. 칸막이를 사용할 수 없는 경우 그 자리에 빛을 흡수하는 종이 조각(예: 두꺼운 검은색 카드지)을 사용하십시오.
      참고: 루시페린 대사 속도는 마우스 및 세포주 모델에 따라 다르며, 주입 후 10분부터 시작하는 이미지 획득은 가장 강력한 신호를 생성하지 못할 수 있습니다. 새로운 연구를 시작할 때 피크 신호 강도의 타이밍을 결정하기 위해 다른 시점에서 수집을 수행하는 것이 좋습니다.
   2. BLI에 대한 다음 설정을 사용하여 이미지 획득을 위한 이미징 시스템 소프트웨어를 준비합니다: 노출 = 자동, 비닝 = 중간, FStop = 1, 여기 = 블록, 방출 = 개방, FOV = D, 높이 = 1.50.
   3. 일반적으로 원발성 종양 신호는 노출 = 자동 설정을 사용하여 표면적인 위치로 인해 상대적으로 강한 신호를 생성합니다. 전이를 모니터링하는 경우 검은색 전기 테이프를 사용하여 원발성 종양을 조심스럽게 덮고 노출 = 300초 (또는 그 이상)를 수동으로 설정하여 희미한 신호가 있는 경우 이를 획득합니다.
      참고: 이 모델에서는 하한값이 5 × 10³ 광도로 설정될 때 여러 이미징 세션에서 볼 수 있는 원발성 종양과 분리된 신호는 전이를 나타내는 것으로 간주됩니다.

7. 원발성 종양의 절제

참고: 원발성 종양의 절제는 전이에 대한 종단적(예: 치료적) 연구에서 중요합니다. 그렇지 않으면, 마우스는 무제한적인 원발성 종양 성장과 관련된 이환율에 굴복할 수 있습니다. 절제 시기를 결정할 때 원발성 종양 크기(절제 시 출혈 위험)와 궤양(감염 위험)을 고려하십시오.

1. 성공적인 원발성 종양 절제술을 검사하기 위해 BLI 신호가 없는 것을 고려하는 경우, 섹션 6에 설명된 대로 수술 전 영상을 수행하고 수술 후 신호가 없는지 확인합니다. 새로 투여된 루시페린을 사용하여 향후 1-2일 이내에 성공적인 절제를 확인합니다.
   참고: 동물에게 불필요한 스트레스를 주지 않기 위해 루시페린을 즉시 재투여하는 것은 권장되지 않습니다. 원발성 종양 절제 전에 루시페린을 주입하면 절제가 완료되지 않은 경우 신호를 감지하기에 충분해야 합니다.
2. 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취한 다음 노즈콘으로 옮기고 가열 패드에서 0-3% 이소플루란을 사용하여 수술 마취면을 유지합니다. 각막 반사 및/또는 발가락 꼬집음 반응의 부족으로 마취 수술 평면을 확인합니다.
3. 안과 연고를 눈에 도포하여 각막 건조를 방지합니다.
4. 시술을 위한 진통제로 5mg/kg 케토프로펜을 피하주사합니다.
   참고: 투여 계산에 사용되는 값은 표 1에 요약되어 있습니다.
5. 70% 알코올과 베타딘 3x를 번갈아 가며 스크럽하여 수술 부위를 준비합니다. 진행하기 전에 최종 베타딘 스크럽을 건조시킵니다.
6. 멸균 수술용 가위를 사용하여 원발성 종양 위의 피부를 수직으로(주부-꼬리쪽) 엽니다. 궤양이 생긴 피부의 경우, 원발성 종양이 남지 않도록 하고 궤양이 생긴 피부를 완전히 제거하기 위해 궤양 쪽을 벌리기 시작한다.
7. 계속해서 가위와 집게를 사용하여 캡슐화된 종양 주위의 결합 조직을 조심스럽게 절개하여 피부에서 종괴를 완전히 제거하고 남아 있는 종양이 다시 자랄 수 있으므로 기저 신체 조직을 완전히 제거합니다.
8. 출혈이 있는 경우 솜 끝이 있는 어플리케이터로 압력을 가하여 출혈을 조절합니다.
9. 5-0 Vicryl 봉합사로 수술 개구부를 닫습니다.
   참고: 봉합이 중단되면 생쥐가 수술 부위를 괴롭히기 쉽기 때문에 상처 개통성이 더 좋아질 수 있습니다.
10. 동물이 완전히 걸을 수 있을 때까지 보온 패드의 깨끗한 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다. 동물을 우리로 되돌릴 때 축축한 음식을 집 케이지 바닥에 놓으십시오.
11. 수술 후 최소 2일 동안 하루에 한 번 5mg/kg 케토프로펜을 피하 주사합니다. 이때 상처 건강 상태를 확인하십시오.

8. 나노약물 전달

1. 나노 약물 투여량은 체중을 기준으로 하므로 마우스의 무게를 측정합니다.
2. 2% 이소플루란을 사용하여 마우스를 마취한 다음 노즈콘으로 옮기고 가열 패드에서 0-3% 이소플루란을 사용하여 수술 마취면을 유지합니다. 각막 반사 및/또는 발가락 꼬집음 반응의 부족으로 마취 수술 평면을 확인합니다.
   참고: 대안적으로, 나노 약물은 구속된 깨어 있는 마우스에 투여될 수 있습니다. 이후의 모든 단계는 동일합니다.
3. Fe 나노약물 10mg/마우스 체중 kg 29g의 바늘로 인슐린 주사기를 준비합니다.
4. 꼬리 정맥을 확장하기 위해 동물의 꼬리를 따뜻한 물(30-35°C)에 30초 동안 담그십시오.
5. 꼬리에서 여분의 물을 닦아내고 70% 알코올 물티슈로 주입 부위를 청소합니다.
6. 꼬리 옆 꼬리 정맥의 약 절반 지점에 바늘 베벨을 삽입하고 플런저를 약간 뒤로 당겨 바늘에 혈액이 역화되어 배치를 확인합니다. 필요한 경우 바늘을 약간 앞으로 움직이거나 더 얕은 깊이로 움직여 성공적으로 배치하십시오.
7. 성공적으로 삽입하면 40μL 주입을 위해 약 5-10초의 느린 속도로 나노 약물을 꾸준히 주입합니다. 주사 부위 근처의 꼬리 피부 아래에 용액이 고이지 않고 정맥이 어두워짐(어두운 나노 입자 용액으로부터)하여 성공적인 주입을 확인합니다.
   참고: 투여 계산에 사용되는 값은 표 1에 요약되어 있습니다. 응집된 나노입자 제형은 폐에 색전술을 일으킬 수 있습니다. 주사 직후 호흡 곤란이 관찰되면 마우스에 부드럽게 흉부 압박을 수행합니다. 즉각적인 조치는 항상 이 가능한 문제로부터 동물을 성공적으로 회복시키는 결과를 낳습니다.
8. 거즈로 주입 부위를 압박하고 바늘을 제거하고 출혈이 멈출 때까지 약 30초 동안 압력을 유지합니다.
9. 동물이 완전히 걸을 수 있을 때까지 보온 패드의 깨끗한 케이지에서 회복할 수 있도록 합니다.

9. 분석을 위한 전이 수집

1. 섹션 6에 설명된 대로 BLI로 마우스를 이미지화합니다.
   참고: 이 연구에서 5 × 10³ 광채는 전이의 징후로 간주되며 일반적으로 5-7주에 관찰됩니다. 전이까지의 시간에는 마우스에 걸쳐 약간의 차이가 예상됩니다.
2. 이미징 직후, 무거운(5%) 이소플루란(isoflurane) 아래에서 경추 탈구로 마우스를 희생합니다. 절개 전에 각막 반사 및/또는 발가락 꼬집음 반응의 부족으로 인한 사망을 확인하십시오.
3. 전이를 조심스럽게 수집합니다. 림프절 전이는 확대되고 캡슐화된 덩어리로 존재합니다. 폐 전이는 일반적으로 폐 실질(lung parenchyma) 전체에 분포합니다. 따라서 폐 전체를 수집하십시오.
4. 수집된 조직을 페트리 접시에 넣고 이미징 시스템을 사용하여 생물 발광(루시페라아제 발현 암세포의 존재를 나타냄)과 형광(나노 약물 축적을 나타냄)을 확인하는 이미지를 만듭니다. 6.3.2단계에서 설명한 것과 동일한 BLI 획득 설정을 사용합니다. FLI 획득 설정은 노출 = 자동, 비닝 = 중간, FStop = 1, 여기 = 675 및 방출 = 720(Cy5.5 염료의 기본 프로그램), 램프 레벨 = 높음, FOV = D, 높이 1.50입니다. 쥐 사체를 이미지화하여 수집할 가치가 있는 암 조직이 남아 있는지 확인합니다.
5. PBS에서 암 조직을 헹굽니다.
6. 현미경 검사 또는 qRT-PCR을 위해 조직을 수집하려면 OCT에 삽입하고 처리 준비가 될 때까지 -80°C에서 보관하십시오.
7. 유도 결합 플라즈마 발광 분석법(ICP-OES)을 위한 조직을 수집하려면 빈 1.7mL 튜브를 사용하여 스케일의 무게를 측정하고 조직을 튜브에 넣은 다음 무게를 기록합니다. 조직을 얼리고 처리 준비가 될 때까지 -80 °C에서 보관하십시오.

10. 형광현미경에 의한 나노약물 전달의 검증

1. OCT에 포함된 신선 냉동 샘플을 10μm 두께의 현미경 슬라이드에 동결 절편합니다. 조직 유형에 따라 챔버와 표본 홀더 온도를 조정합니다. -20 °C에서 -15 °C 사이의 설정은 폐와 림프 조직 모두에 적합합니다.
2. 섹션 또는 전체 슬라이드를 4% 파라포름알데히드 용액에 15분 동안 담궈 조직 섹션을 슬라이드에 고정합니다. PBS로 조심스럽게 헹굽니다.
3. 슬라이드에 커버 슬립을 장착합니다. 조직 구조의 시각화를 위해 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)이 있는 배지를 사용합니다.
4. 형광 현미경을 사용하여 나노 약물 전달을 나타내는 Cy5.5(여기 683nm/방출 703nm) 섹션을 검사합니다. 음성 대조군 샘플(주입되지 않은 동물의 조직)을 사용하여 신호가 배경이 아닌지 확인합니다.

11. 유도 결합 플라즈마 발광 분광법(ICP-OES)을 통한 나노 약물 전달 검증

1. -80°C에서 보관된 샘플을 15mL 코니컬 튜브로 옮기고 37°C에서 캡을 제거한 상태로 오븐에서 배양하여 건조시킵니다.
   참고: 이 과정은 MDA-MB-231 전이 샘플의 경우 24시간이 걸렸지만 샘플의 크기와 수분 함량에 따라 며칠이 걸릴 수 있습니다.
2. 저울을 사용하여 건조 중량을 기록합니다.
3. 2mL의 70% trace HNO₃ 를 용기에 넣고 샘플을 전자레인지에서 분해합니다. 이 연구에 사용된 매개변수는 전력 = 1030 - 1800W, 램프 시간 = 20:00 - 25:00, 유지 시간 = 15:00, 온도 = 200°C, 냉각 = 30분입니다.
   주의 : 질산으로 작업할 때는 주의해야 하며 질산을 가열할 때 발생하는 연기는 부식성이 높으므로 주의하십시오. 작업은 환기가 잘 되는 공간에서 실험실 가운, 고글/안면 보호대, 산성 작업과 호환되는 장갑과 같은 완전한 개인 보호 장비를 갖춘 상태에서 완료해야 합니다. 여기에 사용된 소량의 부피와 긴 냉각은 위험을 다소 최소화하지만 항상 주의를 기울여야 합니다.
4. 분해된 샘플을 금속이 없는 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 300μL를 새 튜브로 옮깁니다. 9.7mL의 초순수를 사용하여 10mL로 희석하여 HNO₃ 농도가 3%(v/v)가 됩니다.
5. 3%_HNO3 (v/v) 및 초순수에 1000, 100, 10, 1, 0.1 및 0 μg Fe/mL의 농도로 개별 원소 Fe 표준물질을 준비합니다. 초순수에서 3% HNO₃ (v/v) 중 1 μg/mL 농도로 개별 원소 Y 내부 표준물질을 준비합니다.
6. ICP-OES를 사용하여 시료를 분석합니다. 축 모드와 방사형 모드 모두에 대해 철 함량 분석을 위해 다음 방출 선을 선택합니다. Fe(234.350nm), Fe(238.204nm), Fe(259.940nm) 및 Y(371.029nm)는 내부 표준화에 사용됩니다.
7. 조직의 Fe/g의 μg을 계산하기 위해 입력에 사용된 샘플의 양으로 결과를 정규화합니다.

결과

이전의 생체 내 치료 연구에서는 몇 주 동안 매주 나노 약물(10mg Fe 나노약물/체중 kg 쥐)을 1회 투여하여 쥐를 치료했습니다 ^3,7,8. 이 시연을 위해 우리는 1주일 후 1회 투여 후 폐 전이에서 나노 약물의 축적을 관찰할 수 있는지 여부를 확인하고자 했습니다. 이 연구의 결과는 향후 종단 연구에서 ?...

토론

나노 입자는 암 치료에 큰 잠재력을 가지고 있습니다. 여기서, 우리는 Cy5.5 접합 MNP 운반체가 암 조직에 도달하여 전이성 유방암의 쥐 모델에서 치료용 올리고뉴클레오티드를 전달할 수 있음을 보여주었습니다. 암 조직에서 상당한 축적을 달성하면서 나노 약물을 전신적으로 투여할 수 있는 능력은 일반적으로 국소 및 종종 침습적인 투여를 필요로 하는 기존의 많은 ASO ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 5800 ICP-OES	Agilent	5800 ICP-OES	For ICP-OES
Ammonium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	458680025	For nanodrug synthesis
Athymic nude "J:NU" mice	Jackson Laboratory	RRID:IMSR_JAX:007850	Immunocompromised mouse model
Betadine Surgical Scrub	Purdue	6761815101	For tumor resection
Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991	For tumor resection
Crile Hemostats - Straight	F.S.T.	13004-14	For tumor resection
Cy5.5-NHS ester	Abcam	ab146455	For nanodrug synthesis
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11995-065	For cell culture of MDA-MB-231
Eclipse 50i Clinical Microscope	Nikon	50i-B	For imaging of cryosections
Epichlorohydrin	Thermo Fisher Scientific Inc	117780250	For nanodrug synthesis
Extra Fine Graefe Forceps	F.S.T.	11150-10	For tumor resection and metastasis dissection
Fe standard	Inorganic Ventures	CGFE1-500ML	For ICP-OES
Fetal bovine serum	Corning	35-010-CV	For cell culture of MDA-MB-231
Fine Scissors - Sharp 10.5cm	F.S.T.	14060-10	For tumor resection and metastasis dissection
Flask (T-75)	Corning	430641U	For cell culture of MDA-MB-231
HNO3 nitric acid (70%, trace metal grade)	Fisher Chemical	A509P212	For ICP-OES
Insulin syringe 1 CC 29 G x 1/2"	Becton, Dickinson	324704	For tumor implant
Isoflurane	Covetrus	11695067772	For mouse anesthetization
Isoflurane vaporizer	SOMNI Scientific	VS6002	For mouse anesthetization
Isopropyl alcohol (70%) wipe	Cardinal	MW-APL	For tumor resection
IVIS SpectrumCT In Vivo Imaging System	PerkinElmer/Revvity	128201	For bioluminescence imaging
IVISbrite D-Luciferin Potassium Salt	PerkinElmer/Revvity	122799-100MG	For bioluminescence imaging
Ketofen (ketoprofen)	Zoetis	10004031	For tumor resection
Leica CM1950	Leica	CM1950	For cryosectioning of OCT-embedded samples
MARS 6 microwave digestion system	CEM	MARS 6	For ICP-OES
Matrigel, growth factor-reduced	Corning	354230	For tumor implant of MDA-MB-231
MDA-MB-231-luc-D3H2LN	PerkinElmer/Revvity	119369	For mouse model of spontaneous metastasis
Metal-free polypropylene 15 mL conical tubes	Labcon	31343450019	For ICP-OES
Microcentrifuge tube (1.7 mL)	DOT Scientific	RN1700-GMT	For metastasis sample collection
N-succinimidyl 3-[2-pyridyldithio]-propionate (SPDP)	Thermo Fisher Scientific Inc	21857	For nanodrug synthesis
PBS	Gibco	14190-144	For cell culture and tumor implant of MDA-MB-231
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122	For cell culture of MDA-MB-231
Puralube vet ointment	MWI Veterinary	27505	For tumor resection
Sodium hydroxide	Thermo Fisher Scientific Inc	3728-70	For nanodrug synthesis
Tissue-Tek Cryomold Intermediate 15 x 15 x 5 mm	Sakura	4566	For metastasis sample collection
Tissue-Tek O.C.T. Compound	Sakura	4583	For metastasis sample collection
Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP)	Thermo Fisher Scientific Inc	T2556	For nanodrug synthesis
Trypsin, 0.25%	Gibco	25200-056	For cell culture of MDA-MB-231
Vicryl PLUS (Antibacterial) violet 27" RB-1 taper	Ethicon	VCP303H	For tumor resection