유세포분석을 통한 Hoechst side population cells의 효과적인 검출

요약

여기에서는 고출력 375nm 및 405nm 레이저가 Hoechst 33342를 효과적으로 여기시키고 측면 개체군(SP) 세포 검출을 위한 355nm 레이저의 실행 가능한 대안으로 작용하여 유세포 분석 응용 분야에서 사용 가능한 레이저의 범위를 확장할 수 있음을 보여줍니다.

초록

측면 집단(SP) 세포는 Hoechst 33342 염색을 통해 식별하고 유세포 분석(FCM)을 사용하여 분석합니다. Hoechst SP 방법은 ATP-결합 카세트(ABC) 수송체의 염료 유출 특성을 기반으로 줄기 세포의 분리에 사용됩니다. 이 방법은 처음에는 조혈모세포(HSC)의 식별 및 분리에 사용되었지만, 현재는 주로 암 줄기세포(CSC)의 식별 및 분리에 초점을 맞추도록 발전했습니다. FCM의 기존 검출 방법은 355nm 레이저를 사용하여 염료를 여기시켜 SP 세포를 검출합니다. 이 연구를 통해 355nm 레이저를 사용한 SP 세포 검출을 효과적으로 대체할 수 있는 염료 여기(dye excitation)에 대한 대체 접근법을 성공적으로 식별했습니다. 이는 고출력 375nm 또는 405nm 레이저의 활용을 통해 달성됩니다. 이를 통해 355nm 레이저 유세포 분석에만 국한되지 않고 SP 세포 검출에서 향상된 선택성을 발휘할 수 있습니다.

서문

측면 집단(SP) 세포는 Hoechst 33342 염색을 통해 식별하고 유세포 분석(FCM)을 사용하여 분석합니다. SP 세포는 ATP-결합 카세트(ABC) 수송체 ^1,2를 통해 세포 밖으로 형광 DNA 염료를 펌핑하는 것이 특징입니다. 이 방법은 원래 쥐 골수 조혈모세포(HSC^)를 분리하기 위해 확립되었습니다1. 골수 SP 세포는 CD117⁺Sca-1^{+Lin-Thy1 저}발현 ^3,4를 특징으로 하는 HSC 집단으로 농축되었습니다. 그 후, 이 방법은 심장 근육⁵, 간⁶, 폐⁷, 신장⁸ 및 전뇌⁹를 포함한 다른 조직으로부터 줄기 세포를 분리하고 농축하는 데 널리 사용되었습니다. 특히 이 방법은 지난 10년 동안 암 줄기세포(CSC)를 분리하는 데 적용되었습니다. CSC는 종양 시작, 자가 재생, 화학요법에 대한 내성 및 전이 가능성의 특성을 가진 소수의 세포 집단을 나타냅니다¹⁰. CSC는 초기에 조혈 악성 종양¹¹에서 확인되었으며 이후 전립선¹², 난소¹³, 위¹⁴, 유방¹⁵ 및 폐¹⁶ 암종과 같은 다양한 고형 종양에서 관찰되었습니다. CSC 식별을 위한 다양한 기법을 사용할 수 있음에도 불구하고 SP 기법은 다양한 조직 및 세포주에 걸친 광범위한 적용 가능성으로 인해 여전히 선호되는 선택입니다. 또한 FACS(Fluorescence-Activated Cell Sorting)16,17,18를 사용하여 CSC를 분리하는 귀중한 기술입니다. 실험 결과는 SP 세포가 뚜렷한 종양 원성을 나타내고 줄기 세포 관련 유전자^19,20의 발현 수준을 높인다는 것을 보여줍니다. 우리의 이전 연구²¹은 또한 다발성 골수종에서 분리된 SP 세포의 전사체 분석이 고슴도치 경로와 같은 줄기 세포와 관련된 신호 전달 경로의 농축을 보여준다는 것을 보여주었습니다. 한편, 급성 골수성 백혈병의 SP 세포에서 차별적으로 발현되는 유전자에 대한 경로 농축 분석을 수행했습니다²². 변형된 유전자는 줄기세포 관련 경로(Wnt/β-catenin, TGF-β, Hedgehog, Notch)에서 농축되었습니다. 우리는 1 x 10⁵ SP 세포가 BALB/c null 마우스²²에서 종양을 형성할 수 있는 반면, non-SP 세포는 형성할 수 없음을 발견했으며, 이는 SP 세포가 백혈병 줄기 세포의 특성을 가지고 있음을 나타냅니다. CSC 식별에서 Hoechst SP 방법의 효능은 분명합니다.

Hoechst SP 프로토콜은 연구 진행을 통해 개선되고 향상되었습니다. 이 프로토콜은 염료 농도, 세포 밀도, 배양 온도 및 기간, 완충액 조성 및 pH 값에 대한 엄격한 제어를 수반합니다. 이 프로토콜에 따라 제조된 세포 샘플은 유세포 분석을 실시하였다. 355nm에서 UV 레이저로 Hoechst 염료를 여기하고 690/50nm 필터(Hoechst Red) 및 450/50nm 필터(Hoechst Blue)를 모두 사용하여 형광 방출을 감지하기 때문에 FCM에는 350nm 레이저가 필요합니다. 그러나 350nm 레이저는 비용이 많이 들기 때문에 대부분의 FCM에 일반적으로 장착되지 않습니다. 따라서 우리는 유세포 분석을 통한 SP 세포의 효과적인 검출을 위해 염료 여기(dye excitation)에 대한 대체 접근법을 찾으려고 시도했습니다. 이 연구에서는 SP 세포를 검출하는 375nm 및 405nm 레이저의 능력을 평가하고 355nm 레이저의 능력과 비교했습니다. 우리의 발견은 355 nm, 375 nm 및 405 nm 레이저에 의해 검출 된 SP 세포 간의 놀라운 유사성을 보여줍니다. 이러한 결과는 고출력 375nm 및 405nm 레이저가 SP 세포 검출을 위해 355nm 레이저에 대한 실현 가능한 대안 역할을 할 수 있음을 시사합니다. Hoechst 33342에 대한 추가 excitation light source를 포함하면 더 많은 유세포 분석 모델을 쉽게 사용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구의 실험은 8주에서 12주 사이의 총 10마리의 C57BL/6 마우스를 활용했습니다. 실험 작업은 쓰촨 대학교의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(#201609309)에서 승인한 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 기사에 사용된 실험 재료와 유세포 분석의 파라미터는 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 마우스 골수 세포의 분리 및 수집

1. 기관 지침에 따라 엄격하게 쥐를 안락사시킵니다. 마우스의 무의식을 유도하려면 2% 이소플루란으로 시작하여 흡입 마취제를 투여한 다음 호흡이 멈출 때까지 5% 이소플루란으로 복용량을 점진적으로 늘립니다.
2. 수술실이나 흄 찬장에서 쥐를 해부하십시오. 70% 에탄올로 마우스를 세척하고 살균합니다.
3. 날카로운 가위로 다리의 피부와 근육을 완전히 자르고 대퇴골을 절개합니다.
4. 모르타르에 있는 그라인딩 로드로 대퇴골을 부드럽게 부수고 뼈가 하얗게 될 때까지 DMEM 배지로 골수 세포를 씻어냅니다.
5. 얻어진 골수 세포를 100μm 필터로 15mL 튜브에 여과합니다. 800 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리기.
6. 상층액을 버리고 1mL의 적혈구 용해 완충액으로 잔류 적혈구를 4°C에서 1분 동안 용해합니다. 800 x g 에서 4 °C에서 5분 동안 원심분리기. 원심분리 후 DMEM 매체로 다시 세척하십시오.
7. 배양 용액 2mL(DMEM 배지 + 5% FBS)에 세포를 재현탁시키고 자동 세포 계수기로 세포 수를 세고 배양 용액을 사용하여 세포 농도를 1.0 x 10⁶ cells/mL로 조정합니다.

2. 세포 염색

1. 각 마우스의 골수 세포 현탁액 2mL에 5μg/mL Hoechst 33342를 보충합니다. 다른 1mL 부분 표본에 100μM 베라파밀을 음성 대조군으로 추가합니다.
2. 37°C의 수조에서 90분 동안 30분마다 부드럽게 교반하여 배양합니다.
3. 배양 후 세포를 얼음으로 5분 동안 냉각한 다음 250 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다. 콜드 러닝 용액(HBSS + 2% FBS)에 세포를 재현탁시킵니다. 4°C에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
4. 생성된 세포 펠릿을 샘플당 500μL의 실행 용액에 재현탁시킵니다. FCM 분석 전에 세포에 2μg/mL의 요오드화 프로피듐(PI)을 보충하고 약 5분 동안 얼음 위에 놓습니다.

3. 유세포 분석

주: 사용된 다양한 시스템 및 구성에 대한 요약은 표 1을 참조하십시오.

1. FCM에서 일일 품질 관리(QC) 형광구를 사용하여 필요한 채널의 변동 계수(CV) 값을 보정하고 품질 관리가 성공적으로 완료된 후 샘플 테스트를 수행합니다.
   1. 소프트웨어의 바탕 화면 바로 가기를 선택하고 소프트웨어를 실행합니다.
   2. QC/표준화 메뉴에서 QC/표준화 시작 을 선택하여 QC 실험에 액세스합니다.
   3. QC fluorospheres 샘플 튜브를 튜브 홀더에 삽입합니다.
   4. Start(시작)를 선택하여 샘플을 로드하고 QC 절차를 실행합니다. FCM은 QC를 통과한 후 사용할 수 있습니다.
2. 동일한 샘플의 Hoechst 33342 염료를 각각 355nm, 375nm 및 405nm 레이저로 여기시켜 690/50nm 채널에서 Hoechst 빨간색과 450/50nm 채널에서 Hoechst 파란색을 검출합니다.
   1. 파일 메뉴에서 새 실험 을 선택하여 새 실험을 만들고, 파일 경로를 지정하고, 실험을 저장합니다.
   2. 설정 메뉴에서 채널 설정을 선택합니다. 채널 신호 확인란(Y585, V450, V660, NUV450, NUV660, UV450, UV660)을 선택한 다음 레이블 열에 시약 이름(Y585: PI; V450: Hoechst Blue-405 nm; V660: Hoechst 적색-405 nm; NUV450: Hoechst Blue-375 nm; NUV660: Hoechst Blue-375 nm; UV450 : Hoechst Blue-355nm; UV660: Hoechst Blue-355 nm)입니다.
   3. 플롯 영역에서 Pseudo Color Plots 아이콘을 클릭하여 플롯을 만듭니다. 축 이름을 선택하여 표시되는 채널을 변경합니다.
   4. 시험관 화면에서 튜브 추가 를 클릭하여 새 샘플 튜브를 만들고 이름을 변경합니다.
   5. 실행을 선택하여 표본을 불러오고, 플롯을 보고, 게이트를 설정합니다. 게인 및 임계값 설정을 조정합니다. 기록을 선택하여 데이터를 저장합니다.
3. 게이트 설정 로직을 설계합니다.
   1. 첫 번째 플롯의 경우 X축 을 클릭하여 FSC-W를 선택하고 Y축 을 클릭하여 FSC-A를 선택합니다. Polygon Gate 를 선택하여 게이트 A를 그려 개별 셀에 원을 그리고 부착 셀을 제외합니다(그림 1A).
   2. 두 번째 플롯의 경우 X축 을 클릭하여 FSC-A를 선택하고 Y축 을 클릭하여 SSC-A를 선택합니다. Polygon Gate 를 선택하여 게이트 B를 그려 단편화되지 않은 세포를 분리하고 세포 파편을 제외합니다(그림 1B).
   3. 세 번째 플롯의 경우 X축 을 클릭하여 PI-A를 선택하고 Y축 을 클릭하여 SSC-A를 선택합니다. 폴리곤 게이트 를 선택하여 게이트 D를 그립니다. 음의 PI를 나타내는 라이브 셀 (그림 1C)을 선택하고 게이트 C를 그려 라이브 셀을 얻습니다.
   4. 네 번째 2차원 플롯의 경우 X축 을 클릭하여 Hoechst Red를 선택하고 Y축 을 클릭하여 Hoechst Blue를 선택합니다. 플롯 을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 속성을 선택합니다. 선형 형식 f또는 X축과 Y축을 모두 선택합니다. 다각형 게이트 를 선택하여 게이트 SP를 그려 SP 셀을 얻습니다(그림 1D).
4. 샘플 적격성을 평가하려면 SP 세포 검출을 위해 355nm의 특정 유세포 분석기²³ 을 사용하십시오.
5. 355nm(레이저 출력: 20mW) 및 405nm(레이저 출력: 80mW) 레이저를 동시에 사용하여 대조 세포(베라파밀 추가)와 실험 세포를 모두 검출합니다.
6. 두 레이저에 해당하는 690/50nm 및 450/50nm 채널에서 형광 신호를 획득합니다. 투명한 SP 세포를 사용하여 355nm 및 405nm 레이저에 의한 Hoechst 33342 염료의 효과적인 자극을 관찰합니다(그림 2B-C).
7. 동일한 샘플의 경우 세포 검출을 위해 375nm(레이저 출력: 60mW) 및 405nm(레이저 출력: 80mW) 레이저를 사용합니다.

결과

그림 2에서 대조군은 Hoechst 33342의 제거를 방지하기 위해 줄기 세포의 ABC 수송체를 차단하는 베라파밀로 처리되었습니다. 이에 의해, non-verapamil 그룹의 줄기 세포는 Hoechst 33342를 배출하고 SP 세포로 알려진 음성 세포 집단을 형성합니다. 355nm 레이저는 Hoechst 33342 염료를 효과적으로 자극하여 골수의 SP 세포를 명확하게 관찰할 수 있었습니다(그림 2A). 355nm...

토론

우리는 설명된 프로토콜을 사용하여 3-4마리의 마우스를 대상으로 각 실험을 수행하여 총 10개의 마우스를 생성했습니다. SP 세포의 비율은 0.05%에서 0.76% 사이였습니다. 마우스들 사이에서 개체별 변이가 관찰되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 우리는 Hoechst 샘플을 분석하기 위해 4개의 유세포 분석기를 사용했습니다. 새로운 버전의 유세포 분석에서 20mW 355nm 레이저에 의한 Hoechst 염료의 여?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic cell counter	Countstar	1M1200
Cell Filter(100 µm)	BIOFIL	CSS-013-100
Daily quality control fluorospheres	Beckman Coulter	B5230
Dulbecco's Modification of Eagle's Medium with 4.5g/L glucose (DMEM medium)	CORNING	10-013-CVRC
Fetal bovine serum	CORNING	35-081-CV
HBSS	Hyclone	SH30030.02
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	B2261
Propidium iodide (PI)	Sigma-Aldrich	P4170
Red blood cell lysis buffer	Beyotime	C3702
Verapamil	Sigma-Aldrich	V4629