설치류 심장 조직으로부터 강력한 미토콘드리아 분리

요약

미토콘드리아에 대한 생체 에너지 및 대사체 연구는 많은 질병에서 미토콘드리아의 다면적인 역할을 밝혀냈지만, 이러한 세포 소기관에 대한 분리 방법은 다양합니다. 여기에 자세히 설명된 방법은 여러 조직 소스에서 고품질 미토콘드리아를 정제할 수 있습니다. 품질은 호흡 조절 비율 및 고해상도 호흡 측정법으로 평가된 기타 지표에 의해 결정됩니다.

초록

미토콘드리아 분리는 대사 장애 및 질병을 연구하기 위해 분자 생물학 및 생화학 분야의 선구자들이 확립한 절차에 따라 수십 년 동안 실행되어 왔습니다. 미토콘드리아 생리학 및 생물 에너지학을 적절하게 조사하려면 일관된 미토콘드리아 품질이 필요합니다. 그러나 연구자는 다양한 공개 격리 방법을 사용할 수 있습니다. 다른 실험 전략에는 다른 격리 방법이 필요하지만 기본 원리와 절차는 유사합니다. 이 프로토콜은 작은 동물과 세포를 포함한 다양한 조직 소스에서 잘 결합된 미토콘드리아를 추출할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 설명된 단계에는 장기 절제, 미토콘드리아 정제, 단백질 정량 분석 및 다양한 품질 관리 검사가 포함됩니다. 고품질 미토콘드리아를 식별하는 데 사용되는 주요 품질 관리 지표는 호흡 제어 비율(RCR)입니다. RCR은 ADP가 없는 경우의 속도에 대한 산화적 인산화 중 호흡수의 비율입니다. 대체 메트릭에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여 조직 소스에 비해 높은 RCR 값을 얻을 수 있지만 연구자의 개별 요구에 맞게 여러 단계를 최적화할 수 있습니다. 이 절차는 강력하며 동물 모델 및 조직 공급원에서 평균 이상의 RCR 값을 가진 분리된 미토콘드리아를 일관되게 생성했습니다.

서문

미토콘드리아는 특정 세포 기능에 최적화된 세포질 에너지 조건을 설정하는 세포 내 세포 기관입니다. 세포, 조직 및 유기체 수준 연구는 미토콘드리아 기능에 대한 통찰력을 제공할 수 있지만, 세포 기관을 분리하는 것은 다른 방법으로는 불가능한 수준의 실험 제어를 제공합니다. 미토콘드리아 분리는 1940년대부터 수행되어 다양한 세포와 조직에 걸친 신진대사 및 호흡에 대한 기계론적 연구를 가능하게 했습니다 ^1,2. 미토콘드리아의 역사적 관련성도 잘 문서화되어 있습니다³. ATP의 주요 생산자인 미토콘드리아는 최적의 세포 및 장기 기능에 필수적인 많은 핵심 역할을 합니다⁴. 미토콘드리아 매트릭스 내에서 기질은 TCA 회로에 의해 산화되어 NADH 및 UQH₂ ^5,6과 같은 환원 등가물 및 이동 전자 운반체를 생성합니다. 사이토크롬 C는 미토콘드리아 생화학 반응 네트워크⁷에서 세 번째 주요....

프로토콜

모든 척추 동물의 사용 및 치료는 미시간 주립 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 검토하고 승인한 승인된 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 수컷과 암컷 Hartley 알비노 기니피그와 Sprague Dawley(SD) 쥐를 사용하여 설계되었습니다. 기니피그에서 심장 미토콘드리아를 분리하기 위해 동물은 4-6주(300-450g)의 나이에 희생되었습니다. 남녀 모두의 SD 쥐로부터 심장 미토콘드리아는 10-13주(250-400g) 사이에 얻어졌다. 버퍼에 대한 조리법은 표 1 에 설명되어 있으며 미리 준비해야 합니다. 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 실험 준비

1. 분리를 시작하기 전에 두 개의 50mL 원심분리 튜브에 "스핀 1 및 2" 및 "스핀 3"으로 레이블을 지정합니다.
2. 튜브, 갓 해동된 분리 완충액(IB), 날카로운 다진 가위, 조립된 균질화 프로브, 5mL 비커 또는 이에 상응하는 크기의 용기를 얼음 위에 놓습니다.

토론

이 프로토콜에 간결하게 설명된 방법을 준수하면 다른 조직 유형 및 소스 외에도 작은 설치류의 심장 조직에서 잘 결합된 미토콘드리아를 격리할 수 있습니다. 전반적으로 이 과정은 총 3-3.5시간이 소요되어야 하며, 이 기간 동안 모든 동물 조직, 샘플 및 분리물은 분해를 제한하기 위해 가능한 한 4°C의 얼음 위에 있어야 합니다. 이 절차는 강력하며 실험 목표와 사용된 ?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.7 mL microcentrifuge tubes
10 mL glass beaker			For organ disection and mincing
50 mL centrifuge tubes			Centrifugation
Adenosine 5'-diphosphate monopotassium salt dihydrate	Sigma	A5285	Respirometry assays
BSA Protein Assay Kit	Thermo Scentific	PI23225	Mitochondrial protein quantification
Dextrose	Sigma	DX0145	For buffer (CB)
Ethylene glycol-bis(2-amino-ethylether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid	Sigma	E4378	For buffers (CB and IB) and respirometry assays
Glass cannula	Radnoti		Guinea pig and rat heart perfusion
Heparin sodium porcine mucosa	Sigma	SRE0027-250KU	Animal IP injection
High-resolution respirometer			Clark-type electrode; oxygraph with 2 mL chambers
Induction chamber
Isoflurane	Sigma	792632	Anesthetic
L-malic acid	Sigma	02288-50G	Respirometry assays
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272	For buffer (RB)
Mannitol	Sigma	MX0214	For buffer (IB)
Microliter syringes			Sizes ranging from 5–50 µL
Microplate reader			Must be able to incubate at 37 °C
MOPS	Sigma	475898	For all buffers
O2 tank
OMNI THQ Homogenizer	OMNI International	12-500	Similar rotor stator homogenizers will work
pipettes			Volumes of  2–20 µL; 20–200 µL; 200–1000 µL
Potassium chloride	Sigma	P3911	For buffers (RB and CB)
Potassium phosphate dibasic	Sigma	795496	For buffers (IB and RB)
Protease from Bacillus licheniformis	Sigma	P5459
Sodium chloride	Sigma	S9888	For buffer (CB)
Sodium pyruvate	Fisher bioreagents	BP356-100	Respirometry assays
Sucrose	Sigma	8510-OP	For buffer (IB)
Surgical dissection kit			Depends on animal and tissue source
Tabletop centrifuge			Must cool to 4 °C