현장에서 꿀벌을 가두고 안전하게 다루는 신속한 방법

요약

우리는 현장에서 채취한 꿀벌을 안전하게 취급하기 위한 검증된 방법을 보여줍니다. 이 방법을 사용하면 샘플링 중에 수집된 꽃가루를 통해 식물-곤충 상호 작용의 신속한 조작, 식별, 유전자 샘플링 및 확인을 수행할 수 있습니다. 쉽게 적응할 수 있는 이 접근 방식은 희귀 곤충 그룹을 연구하는 데 비용 효율적이고 치명적이지 않은 수단을 제공합니다.

초록

많은 곤충 수분 매개자, 특히 전문가 또는 희귀 분류군의 기본 생물학 및 생태에 대한 이해를 향상시키는 것이 많은 연구자의 우선 순위입니다. 따라서 정보를 얻거나 추가 연구를 지원하기 위해 현장에서 수집된 유기체를 해롭지 않은 방식으로 일시적으로 가두어야 하는 경우가 많습니다. 이 프로토콜은 유기체 식별, 꽃가루 제거, 마킹 및/또는 유전자 분석을 위한 치명적이지 않은 조직 샘플 수집을 포함하여 특정 프로젝트 요구 사항에 맞게 쉽게 조정할 수 있는 보존 우려 꿀벌을 안전하게 처리하기 위한 철저한 테스트를 거친 빠르고 저렴한 현장 방법을 나타냅니다. 이 방법론은 특정 시나리오가 발생할 때 사용할 수 있는 연구자의 도구 상자에서 추가 옵션으로 사용할 수 있습니다. 이 방법론은 다양한 경험과 기술 수준을 가진 개인이 사용할 뿐만 아니라 다른 곤충 종과 함께 사용하도록 조정할 수 있을 것으로 예상됩니다. 전문 꿀벌을 연구하거나 숙주 특이적 연구를 수행하는 연구자에게 큰 가치가 있을 수 있습니다. 이 프로토콜로 가능해진 데이터 수집은 연구자들이 많은 꽃가루 매개체 종, 식물-수분 매개체 네트워크 구조, 꽃가루 매개체 보존 및 관리 이니셔티브에 대한 중요한 데이터 격차를 해결하는 데 매우 유용할 것입니다.

서문

야생 꿀벌 및 기타 꽃가루 매개자 개체수 감소와 그에 따른 꽃가루 매개자 군집 변화를 뒷받침하는 증거가 점점 더 많아지고 있습니다 1,2,3,4. 계속되는 손실은 생물다양성 유지, 생태계 기능, 농업 생산에 필수적인 곤충 수분의 서비스 자체를 위협한다⁵. 더욱이 많은 야생벌, 특히 희귀종의 경우 적절한 관리 및 보존 조치를 방해할 수 있는 상당한 지식 격차가 존재합니다 ^6,7.

이러한 데이터 부족 문제를 해결하기 위해 연구자들은 곤충 수분 매개자, 관련 서식지 사용 및 꽃 선호도를 연구하는 다양한 방법을 개발했습니다. 팬 트랩, 블루 베인 트랩, 불쾌감 트랩, 출현 트랩 및 손 그물에 의한 직접 수집이 일반적으로 사용되지만 이러한 방법 중 다수는 ^8,9,10,11이라는 중요한 단점을 가지고 있습니다. 꽃가루 매개자를 식별하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 실험실 환경(예: 현미경 사용)에서 표본을 식별해야 하는지 여부에 관계없이 유기체의 폐사를 초래할 수 있습니다. 사망률은 많은 곤충 연구에서 정당화될 수 있고 필요할 수 있습니다. 그러나 개체군 상태가 제한되거나 불확실한 멸종 위기에 처하거나 희귀하거나 연구가 부족한 곤충을 연구할 때 연구자는 이러한 곤충 개체군에 부정적인 영향을 미칠 가능성을 줄이기 위해 유기체의 폐사율, 부상 또는 스트레스를 완화해야 합니다. 따라서 위험에 처한 종 또는 주요 구별 기능으로 쉽게 식별할 수 있는 종을 작업할 때는 가능한 한 덜 파괴적인 샘플링 접근 방식을 취해야 합니다.

꿀벌의 유전 물질을 수집하기 위해 제안된 비살상 방법에는 대변 수집, 삼출액¹² 및 날개 끝¹³이 포함됩니다. 그러나 들판에서 수집된 꿀벌에 이러한 방법을 사용하는 것은 필요한 시간 및/또는 날개에 대한 잠재적인 영향으로 인해 비행 및 기타 행동에 부정적인 영향을 미치기 때문에 유지되지 않을 수 있습니다. 부분적인 더듬이 제거는 샘플링된 유글로신 꿀벌의 생존을 손상시키지 않는 것으로 나타났습니다¹⁴. 마찬가지로, 다리 중간의 부절의 말단 부분에 대한 샘플링은 Bombus terrestris 일벌 생존율을 유의하게 감소시키지 않았다¹⁵. 추가적인 치명적이지 않은 샘플링 방법은 꿀벌을 완충 용액에 임시로 담근 다음 방출하여 단백질 잔류물을 수집하는 것입니다¹⁶. 생존 분석은 완충 헹굼된 꿀벌과 헹구지 않은 꿀벌 사이에 큰 차이가 없다는 것을 보여주었습니다. 각 기술에는 한계가 있으며, 특정 연구 질문 및 전체 프로젝트 목표를 다룰 때 고려해야 합니다.

유기체의 정확한 분류학적 식별은 효과적인 연구를 위해 매우 중요합니다. 그러나 많은 곤충 수분 매개체 분류군의 경우 관심 종과 연구자 또는 관찰자의 지식 및 경험 수준에 따라 크게 달라집니다. 현장에서 많은 꿀벌 종을 확인할 수 있지만 관찰을 뒷받침하는 증거를 확보하는 것이 중요할 수 있습니다. 대부분의 꽃가루 매개자 연구는 일반적으로 개인을 증거로 수집하고 유지하지만, 가상 현실을 사용한 3차원 비디오 촬영뿐만 아니라 사진 및 비디오의 사용은 관찰 대상의 희생 없이 특정 종을 구별하기 위한 대용물로 활용될 수 있습니다¹⁷. 일부 종 간의 구별은 특별한 주의와 특정 형태학적 특징에 대한 사진이 필요할 수 있습니다. 이러한 상황에서는 유기체를 조작할 수 있어야 하며 고유한 위치에 국한시켜 복잡하게 구별되는 특성을 안정적으로 촬영할 수 있어야 합니다.

식별을 위해 일시적으로 꿀벌을 가두는 것은 표본을 냉각시키거나 이산화탄소를 사용하여 꿀벌의 속도를 늦추는 것을 포함하여 여러 가지 방법으로 수행 할 수 있습니다^{18 , 19} . 그러나 이러한 방법은 행동을 변화시켜 치료받은 꿀벌이 활동을 회복하는 속도가 느려져 먹이 찾기, 유기체 적합성에 영향을 미치거나 포식 위험을 증가시킬 수 있습니다 20,21,22. 또한 이러한 기술은 궁극적으로 유기체가 가두어지고 처리되는 시간을 증가시킵니다. 이는 차례로 유기체 스트레스와 현장 처리 시간을 증가시킵니다. 따라서 더 안전하고 효율적인 방법론이 매우 바람직할 것입니다.

많은 연구에서 꿀벌이나 다른 출처에서 수집한 꽃가루를 사용하여 수렵 선호도를 더 잘 이해하고, 식물과 수분 매개자 간의 상호 작용 네트워크를 구축하고, 환경 오염(예: 잔류 농약)을 식별하고, 영양 생태를 평가했습니다 23,24,25,26,27,28,29 . 많은 꿀벌은 컨테이너에 갇혀 있을 때 스스로 그루밍을 합니다. 그러므로, 꽃가루를 채취하는 비살상 방법(non-lethal sampling³⁰)이 사용되었다(예: 마이크로 원심분리기 튜브). 그러나 자가 그루밍이 이루어지지 않는 경우 이 프로토콜에 사용된 재밀봉 가능한 비닐 봉지와 같은 더 촉감이 좋은 용기를 사용하면 꽃가루가 비닐 봉지와 접촉하도록 특정 신체 부위에 부드러운 압력을 가할 수 있으므로 기존의 단단한 용기를 사용하는 것보다 꽃가루 샘플을 얻을 가능성이 더 높습니다.

여기에서는 위험에 처한 3개의 꿀벌 분류군에 대해 잘 테스트된 프로토콜을 제시합니다. 노동 집약적이지만 곤충 수분 매개자로부터 포괄적인 데이터를 수집하는 동시에 개별 유기체에 대한 사망 위협을 최소화할 수 있습니다. 이 방법론을 사용하는 전반적인 목표는 곤충을 포획, 식별 및 안전하게 방출할 수 있는 안전하고 효과적인 수단을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜의 또 다른 장점은 전통적인 곤충 수집의 많은 한계를 극복한다는 것입니다. 개인을 표시하고, 치명적이지 않은 유전 물질을 수집하고, 꽃가루 샘플을 수집하는 동시에 취급 시간과 유기체에 대한 스트레스를 최소화하는 쉬운 방법을 제공합니다. 전통적인 곤충 채취 방법에는 많은 이점이 있지만³¹, 일부 한계를 극복하기 위해 곤충을 빠르고 안전하게 방출하기 전에 식별을 위해 격리할 수 있는 대안을 마련했습니다. 프로젝트 목표에 따라 꿀벌이 다른 중요한 데이터를 수집하기 위해 갇혀 있는 동안 추가 단계를 수행할 수도 있습니다.

프로토콜

1. 현장 수집 준비

1. 프로젝트 목표를 확인합니다(예: 유기체 식별, 유전자 조직 샘플링 등).
2. 재료 테이블을 검토하고 프로젝트 목표와 관련된 모든 관련 항목을 수집합니다.
3. 모든 디지털 장비(예: 스마트폰, 카메라, 휴대용 GPS(Global Positioning System))가 완전히 충전되어 있고 예비 배터리가 충전 및 포장되어 있는지 확인하십시오.

2. 유기체의 포획 및 확보

1. 날짜, 시작 시간, 현장 부지/위치 및 필요할 수 있는 기타 관련 정보(예: 기상 조건, 우세한 지피 식물, 꽃이 만발한 식물 등)를 포함하여 현장에 도착하면 관심 있는 현장 매개변수를 기록합니다(그림 1).
2. 적절한 그물 기술을 사용하여 관심 있는 개별 꿀벌을 포획합니다. 공중 곤충 그물을 통한 손 그물을 사용하거나 초점 종을 기반으로 한 스윕 그물을 사용하십시오.
   참고: 바이알/원심분리기 튜브를 통한 수집과 같은 다른 포획 기술도 곤충 포획에 사용할 수 있습니다.
3. 그물 가방을 통해 표본을 육안으로 관찰하여 관심 분류군과 유사한지 확인합니다. 그렇지 않은 경우 시편을 안전하게 해제하고 측량을 계속하십시오.
4. 표본이 초점 종으로 보이는 경우, 표본이 탈출할 수 없도록 그물 가방 안에 표본을 고정합니다(예: 그물 주머니 상단을 프레임 위로 겹치거나, 그물 주머니의 목을 비틀거나 가두거나, 기타 잠재적인 출구를 차단).
5. 재밀봉 가능한 샘플 백을 모으고 샘플 백을 엽니다.
6. 관심 있는 꿀벌이 그물 가방의 끝 근처에 있는지 확인하십시오.
7. 한 손으로 표본 바로 아래에 있는 그물 주머니를 잡습니다. 끝(곤충이 갇혀 있는 곳)이 위쪽을 향하고 그물 구멍(즉, 고리)이 아래에 매달리도록 그물 가방을 잡습니다.
   참고: 대부분의 곤충은 영양성이며, 갇혀 있을 때 일반적으로 빛을 향해 날아가거나 기어갑니다.
8. 다른 손(즉, 그물 백을 잡지 않은 손)을 사용하여 표본 바로 아래에 있는 손에 도달할 때까지 재밀봉 가능한 샘플 백을 그물 구멍과 그물 가방을 통해 안내합니다.
9. 손의 그립을 조심스럽게 풀고 재밀봉 가능한 샘플 백을 들고 있는 손이 샘플과 함께 제한된 영역으로 이동할 수 있을 만큼만 샘플을 제한합니다. 밀폐된 구역 내에서 표본의 위치를 염두에 두어 쏘이거나 표본에 해를 입히거나 탈출할 가능성을 줄이십시오.
10. 재밀봉 가능한 샘플 백을 조작하여 곤충 표본이 들어갈 수 있을 만큼 충분히 넓게 엽니다. 씰의 양쪽에 압력을 가하거나 씰 아래의 엄지와 중지로 백을 비틀어 이 작업을 수행합니다.
11. 재밀봉 가능한 샘플 백 입구를 표본 위에 놓고 곤충을 백 안으로 부드럽게 움직입니다. 앞서 언급했듯이 대부분의 곤충은 광영양성이므로 재밀봉 가능한 샘플 백이 들어있는 손을 태양/하늘을 향하게 하여 표본이 백 안으로 쉽게 이동할 수 있도록 합니다.
12. 표본이 내부에 들어가면 다시 밀봉 가능한 샘플 백을 단단히 밀봉합니다.
13. 곤충 그물에서 표본이 들어 있는 재밀봉 가능한 샘플 백을 제거합니다.
    알림: 곤충은 밀봉된 백에서 빠르고 치명적으로 과열될 수 있으므로 처리할 때까지 표본을 직사광선에 노출되지 않도록 하고 이상적으로는 그늘진 장소나 단열 용기에 보관하고 처리 시간을 제한하십시오.

3. 유기체 식별

1. 표본을 면밀히 검사하여 관심 분류군인지 확인합니다. 다른 종인 경우 안전하게 풀어주고 조사를 계속하십시오.
   알림: 표본에 해를 끼치지 않으려면 곤충이 가방 안에 있는 동안 곤충에 직접적인 압력을 가하지 마십시오. 플라스틱에 부드러운 압력을 가하거나 백 둘레를 늘려 백이 시편 주위를 팽팽하게 만들어 움직임을 제한함으로써 시편을 고정할 수 있습니다.
2. 종의 정체성을 시각적으로 쉽고 정확하게 확인할 수 있는 경우 사진 바우처를 받으십시오(그림 2). 표본에 대한 추가 필요 정보(예: 포획 시간, 특정 GPS 위치, 방문한 식물, 고유한 표시, 크기 또는 색상 관찰, 포획 전 행동 등)를 기록합니다.
3. 신원을 확인하기 위해 특정 물리적 특징을 검사해야 하는 경우, 재밀봉 가능한 샘플 백을 통해 이러한 주요 특징을 강조하는 자세한 매크로 사진을 촬영하십시오(그림 2).
4. 샘플 백을 통해 특징을 식별할 수 있는 충분한 품질의 사진을 얻을 수 없는 경우, 샘플 백의 밀봉되지 않은 두 모서리 끝 중 하나(즉, 서로 이음새가 있거나 다시 밀봉할 수 없는 모서리)를 절단하여 정밀 검사를 위해 표본의 관심 신체 부위를 노출시킵니다. 예를 들어, 머리, 복부 또는 다리만 노출되도록 작은 구멍을 자릅니다(그림 3A-C). 이를 위해 관심 있는 몸체 부분이 먼저 절단부/모서리 구멍 쪽으로 이동하도록 시편을 조작합니다.
   알림: 필요한 사진을 얻기 위해 가방에 자른 구멍의 크기와 위치, 곤충의 방향을 변경해야 할 수도 있습니다.
5. 식별이 수행된 후 후속 및 원하는 방법에 대한 관련 섹션으로 건너뜁니다. 더듬이 분절 제거 기술에 대해서는 섹션 4, 곤충 표시에 대해서는 섹션 5, 꽃가루 샘플 획득에 대해서는 섹션 6을 참조하십시오.

4. 더듬이에서 치명적이지 않은 유전자 샘플 얻기

1. 가위를 사용하여 재밀봉 가능한 샘플 백의 밀봉되지 않은 두 모서리 중 하나(즉, 서로 이음새가 있거나 다시 밀봉할 수 없는 모서리) 중 하나를 대각선으로 자릅니다. 절단한 부분이 꿀벌 머리의 너비보다 최소한으로 큰지 확인하십시오(그림 4).
2. 시편이 절단부/모서리 구멍을 향해 머리부터 이동하도록 시편을 조작합니다.
   참고: 이 단계는 유전자 분석을 위해 다른 조직 샘플(예: 다리 전체, 다리 부분)을 수집하는 데 적용할 수 있습니다. 따라서 필요한 샘플을 얻기 위해 가방에 절단된 구멍의 크기와 위치 및 곤충의 방향을 변경해야 할 수 있습니다.
3. 꿀벌의 머리가 가방에서 튀어나오면 주변 플라스틱에 부드럽게 압력을 가하여 곤충 주위를 팽팽하게 만들어 움직임을 제한합니다(그림 3A).
4. 구멍이 너무 크면 백을 굴려 구멍 구멍을 더 제한하고 시편을 고정합니다. 적절한 구멍 크기가 확실하지 않은 경우 방충망 또는 비행 케이지 내부에서 4.2 및 4.3 단계를 수행하여 표본이 완전히 탈출하지 않도록 합니다. 원래 모서리 컷이 너무 큰 경우 추가 가방을 사용하십시오.
5. 곤충 머리가 채취 용기(예: 완충 용액/에탄올이 들어 있는 미세 원심분리기 튜브/바이알) 바로 위에 있고 유전자 샘플이 담긴 용기에 다른 모든 검체 데이터에 해당하는 고유한 검체 ID가 적절하게 표시되도록 백을 배치합니다(그림 3D).
6. 깨끗하고 살균된 해부 가위를 사용하여 한쪽 더듬이 부분의 일부를 자릅니다. 용기를 육안으로 검사하여 샘플이 용기 내부에 있는지 확인합니다.
   알림: 절단할 때는 깨끗하고 멸균된 밝은 색의 기판(예: Kimwipe) 위에서 작업하는 것이 도움이 됩니다. 이를 통해 샘플이 샘플 수집 용기에 떨어지지 않는 경우 오염 위험을 최소화하면서 겸자로 쉽게 회수할 수 있습니다.
7. 조직 샘플 수집 용기 뚜껑을 고정하고 샘플을 회전시켜 샘플이 용액(예: 완충 용액/에탄올) 내에 부유하도록 합니다.
8. 조직 샘플 수집 용기(안테나 포함)를 놓습니다.ample)는 안전한 용기에 넣고, 이상적으로는 직사광선 및/또는 필드 쿨러와 같은 극한의 온도로부터 보호되는 서늘하고 그늘진 장소에 보관합니다.
9. 원래 포획 지점 근처에서 표본을 안전하게 방출합니다.
   참고: 표본은 또한 방출 전에 표시하여(섹션 5 참조) 표본이 다시 보이거나 회수된 경우 샘플링된 것으로 쉽게 식별할 수 있습니다.

5. 유기체 표시

1. 재밀봉 가능한 샘플 백에 표본을 넣고 샘플 백 중간에 작은 구멍을 자릅니다.
   참고: 이 구멍은 섹션 4에서 만든 구멍에 추가됩니다. 구멍은 곤충의 흉부 면적보다 크지 않아야 합니다. 구멍을 잘라야 하는 위치의 위치는 곤충의 크기와 원하는 표시 영역에 따라 달라질 수 있습니다.
2. 표본의 양쪽에 있는 플라스틱에 부드러운 압력을 가하고 흉부가 구멍 바로 아래에 오도록 곤충을 움직입니다(즉, 흉부의 상단이 가방을 통해 노출되도록 합니다). 시편이 제자리에 유지되도록 부드러운 압력을 계속합니다(그림 5A).
   알림: 다른 표시 영역은 특정 곤충에 더 좋을 수 있습니다(그림 5B). 일부 사용자는 기존 구멍(섹션 4)을 더 크게 만들고 꿀벌이 나타날 때 흉부를 잡고 꿀벌을 잡는 것이 더 도움이 된다고 생각합니다(그림 5C). 이 접근 방식은 쏘일 가능성을 높일 수 있습니다. 또한 사용자가 더 쉽게 찾을 수 있는 경우 꿀벌 여왕 표시 장치를 수정하여 꿀벌을 제한하고 표시할 수 있습니다. 그러나 이 방법은 다른 장치로 옮겨야 하며 꽃가루 샘플을 오염시킬 수 있습니다.
3. 페인트 마킹 펜(또는 관심 분류군에 적합하다고 간주되는 기타 마킹 재료)을 사용하여 미리 결정된 프로젝트별 방법론에 따라 표본을 표시합니다.
   참고: 마킹 방법은 목표에 따라 다르며 개인이 포획되었음을 나타내는 단순할 수도 있고, 개인을 식별할 수 있는 복잡할 수도 있습니다(예: 고유한 색상 코딩 또는 패턴 사용)(그림 5C).
4. 적용된 표시가 적절하게 건조될 때까지 시편을 제자리에 고정합니다.
5. 고유한 색상과 색상 위치를 확인하기 위해 표시된 개체를 촬영합니다.
   참고: 재포획 개체는 재밀봉 가능한 샘플 백을 통해 쉽고 빠르게 직접 촬영할 수 있습니다(그림 5D).
6. 원래 포획 지점 근처에서 표본을 안전하게 방출합니다.

6. 꽃가루 시료 채취

1. 재밀봉 가능한 샘플 백에 표본을 넣고 눈에 보이는 꽃가루가 있는지 주의 깊게 검사합니다.
   참고: 꽃가루의 종류와 양이 엄청나게 다양하기 때문에 때때로 꽃가루가 육안으로 표본에서 보이지 않는 경우가 있습니다. 이전 단계가 이미 완료된 경우 표본의 꽃가루 잔여물이 이미 백에 있을 수 있습니다.
2. 표본에서 꽃가루가 보이면 표본 양쪽에 있는 플라스틱에 부드러운 압력을 가하여 표본의 움직임을 제한합니다.
3. 손가락을 사용하여 플라스틱을 강모나 꽃가루가 함유된 신체 부위에 부드럽게 문지르거나 밀어 꽃가루를 쉽게 제거할 수 있습니다.
4. 표본에서 꽃가루가 보이지 않으면 표본과 플라스틱 사이의 접촉을 최대화하여 외피에서 작은 꽃가루 잔여물이 제거되었는지 확인합니다.
5. 가능한 경우 재밀봉 가능한 샘플 백에 꽃가루가 있는지 육안으로 확인합니다(그림 4).
6. 원래 포획 지점 근처에서 표본을 안전하게 방출합니다.
7. 꽃가루 샘플이 들어 있는 재밀봉 가능한 샘플 백을 단단히 밀봉합니다.
   알림: 재밀봉 가능한 샘플 백에 구멍이 뚫린 경우 오염이나 꽃가루 손실을 방지하기 위해 다른 재밀봉 가능한 샘플 백에 넣어야 합니다.
8. 재밀봉 가능한 샘플 백에 개별 곤충 및 기타 데이터(예: 곤충 종 ID, 날짜, 위치, 시간, 성별, 꽃 방문 기록 등)에 해당하는 고유한 표본 ID로 레이블을 지정합니다.
9. 꽃가루 샘플이 담긴 재밀봉 가능한 샘플 백을 안전한 용기에 넣고, 이상적으로는 더 시원한 장소에 두어 직사광선 및/또는 극한의 온도로부터 보호합니다.
   참고: 적절한 경우 현장 기반 꽃가루 보존을 위한 프로젝트별 프로토콜(예: 유전자 분석, 꽃가루 형태학)을 따릅니다.

결과

이 방법론은 미국 남동부에서 멸종 위기에 처한 3종의 꿀벌(Osmia calaminthae, Caupolicana floridana 및 C. electa)에 사용되었습니다. 현재까지 수백 마리의 꿀벌과 말벌이 안전하게 수집되어 방류되었습니다. 이 방법론을 사용하는 동안 꿀벌이 죽지 않았습니다. 바우처 표본으로 지정되어 해당 관리 기관에 새로운 위치 기록으로 보관된 것들은 데이터 수집 후 적절하게 희생되었습니다. 표 1은 평가된 다양한 형태학적 특징뿐만 아니라 이 프로토콜 14,32,33,34,35,36을 사용하여 수집할 수 있는 기타 정량화 가능한 데이터를 보여줍니다.

그림 1: 필드에 있는 동안 수집할 수 있는 데이터를 보여주는 예제 데이터 시트. 수집되는 구체적인 데이터는 프로젝트 목표에 따라 달라집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 바우처 역할을 하는 사진. 사건에 대한 증명서로 사용하기 위해 사진을 찍는 것은 보고 목적으로 필수적입니다. 여러 종이 유사한 특성을 공유할 때 뚜렷한 식별 기능의 사진이 필요합니다. 플로리다에서 발견되는 이 Anthidium maculifrons 는 풍경과 머리의 노란색을 기반으로 속의 다른 사람들과 구별할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 재밀봉 가능한 샘플 백에 구멍 넣기. 재밀봉 가능한 샘플 백의 구멍 배치를 변경하여 사진 또는 유전자 샘플에 관심 있는 특정 신체 부위를 노출시킬 수 있습니다. 이 합성 사진에서는 (A) 꿀벌의 머리, (B) 복부, (C) 다리가 사진에 노출되어 있습니다. 꿀벌이 갇혀 움직일 수 없게 되면 종종 휴식을 취하고 매크로 사진을 찍을 수 있는 위치를 잡을 수 있습니다. (D) 꿀벌이 이러한 위치에 있을 때도 유전자 샘플을 채취할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 한쪽 모서리가 대각선으로 자른 꿀벌이 있는 수집 가방. 꿀벌의 머리를 자세히 관찰하고 싶다면 가방 모서리의 절단면은 꿀벌의 머리 크기에 따라 크기가 달라집니다. 꽃가루와 꿀 분비물도 향후 꽃가루 식별을 위해 가방에서 발견될 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: 꿀벌이 들어 있는 재밀봉 가능한 샘플 백의 이미지. 벌을 표시하는 동안 쏘이지 않도록 가방에 구멍을 뚫고 (A) 흉부를 구멍 아래에 배치할 수 있습니다. (B) 꿀벌의 크기에 따라 복부에도 표시할 수 있습니다. (C) 대안적으로, 꿀벌은 모서리 구멍에서 분리되고 표시를 위해 흉부에서 압축될 수도 있습니다. 이 기술은 쏘일 가능성을 높일 수 있지만 펜 번짐을 최소화하는 것 같습니다. 고유한 색상/번호 매기기를 사용하여 개인을 구별할 수 있습니다. (D) 향후 재포획된 검체는 재밀봉 가능한 검체 백을 통해 빠르고 쉽게 사진을 찍고 방출할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 1: 이 프로토콜을 사용하여 평가된 형태학적 특징. 또한 샘플을 조작하여 이 표에 표시되지 않은 수많은 특성(예: tergite/sternitite 모양, 전체 길이, 무게, 이빨 수, 날개 venation, intertegular distance 등)을 관찰하고 문서화할 수 있습니다. 이 표를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 프로토콜은 원하는 치명적이지 않은 샘플 또는 바우처 정보를 얻고 원래 포획 지점에서 초점 개체를 야생으로 안전하게 풀어주는 것을 최종 목표로 희귀 꿀벌을 안전하게 취급하고 검사하기 위한 현장 방법을 설명합니다. 바이알 사용과 같은 다른 채취 방법에 비해 이 프로토콜의 이점은 표본을 안전하게 가두어 주요 기능을 면밀히 검사하고 확신 있게 식별할 수 있어 곤충과 연구자 모두에 대한 피해를 제한할 수 있다는 것입니다. 반대로, 다른 방법론^18,19의 경우와 마찬가지로, 이 프로토콜은 검체를 마취시킬 것을 요구하지 않습니다. 최소한의 취급으로 빠르게 샘플링하고 릴리스할 수 있습니다. 재밀봉 가능한 샘플 백은 저렴하고, 구하기 쉬우며, 가볍고, 휴대가 매우 간편하고, 재활용이 가능하여 원심분리기 튜브의 훌륭한 대안이 됩니다. 일부 대안(예: 매 튜브 또는 기타 단단한 용기)의 강성이 부족하기 때문에 살아있는 곤충 표본을 다룰 때 각별한 주의를 기울이는 것이 중요합니다. 전체 표본을 바우처로 사용하는 경우 견고한 인클로저에 넣으면 표본의 잠재적인 손상을 줄일 수 있습니다.

이 방법을 사용하는 연구자는 꿀벌 및/또는 다른 곤충을 다룬 경험이 있는 것이 유익한데, 가방에 있는 표본에 너무 많은 압력을 가하면 부상이나 사망을 초래할 수 있기 때문입니다. 꿀벌을 다루는 데 더 많은 경험을 쌓기 위해 초보 연구자는 더 일반적인 종(예: 꿀벌)을 사용하여 이 프로토콜을 연습해야 합니다. 연습은 곤충의 부상이나 사망을 최소화하는 데 도움이 됩니다. 초점 분류군에 따라 이 방법론에 제한이 있을 수 있다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 특정 분류군의 크기가 줄어들면 더 비싸고 전문화된 매크로 사진 장비의 사용 및/또는 필드 현미경의 사용이 필요할 수 있는데, 그 이유는 이 절차에 나열된 물질로 특징을 분리하고 촬영할 수 없기 때문에 표적이 작을수록 적절한 이미지를 얻기가 더 어려울 수 있기 때문입니다³⁷. 또한, 접근할 수 없는 신체 부위(예: 혀, 생식기 등)가 필요한 경우, 다른 식별 방법이 보증될 수 있습니다. 생식기는 곤충에 대한 가장 유익한 진단 특성 중 하나이며, 곤충은 종마다 매우 다양할 수 있으며 곤충 내에서는 다소 안정적일 수 있습니다 ^38,39. 이 경우, 해부와 같은 치사적인 방법이 필요할 수 있다. 그러나, 식별하기 어려운 종의 경우, 현장 채취 후 식별을 위해 작고 치명적이지 않은 유전자 샘플의 사용을 사용할 수 있으며⁴⁰, 여기에 설명된 방법론을 사용하여 이러한 샘플을 수집할 수 있습니다. 곤충 식별을 위한 이미징 및 DNA 염기서열 분석을 연결하는 데 도움이 되는 통계 모델링도 개발되고 있습니다⁴¹.

여기에 제시된 방법론의 또 다른 제한 사항은 이 프로토콜을 수행할 때, 특히 가방에 구멍을 뚫었을 때 쏘일 확률과 관련이 있습니다. 그러나 이 프로토콜은 쏘일 가능성을 최소화합니다. 저자는 표본을 다루는 동안 표본 가방을 통해 쏘인 적이 거의 없습니다. 또한 일부 종의 꿀벌, 딱정벌레 및 말벌은 아래턱을 사용하여 가방을 자를 수 있었으므로 이 접근 방식이 관심 분류군에 효과가 있는지 결정할 때 주의를 기울여야 하며, 이러한 경우 더 두꺼운 비닐 봉지 또는 기타 방법론이 권장됩니다. 모든 경우에 사용자는 일회용 플라스틱 사용을 최소화하고 가능한 경우 재활용해야 합니다.

이 프로토콜의 개발을 위한 핵심 분류군은 블루 칼라민타 꿀벌, Osmia calaminthae (Hymenoptera: Megachilidae)였으며, 크기는 약 10-11mm이며^{크기는 32}입니다. 이 방법을 개발한 이래로 저자는 더 큰 Bombus 종(Hymnenoptera: Apidae)과 Caupolicana 종, C. electa 및 C. floridana (Hymenoptera: Colletidae)를 포함하여 다양한 크기의 다양한 다른 hymenopterans에 이 방법을 사용했습니다. Caupolicana electa 는 18-23mm, C. floridana 는 16-18mm까지 다양할 수 있습니다³³. 위험에 처한 종, 멸종 위기에 처한 종 또는 목록에 등재된 종에 대한 부정적인 영향을 최소화하려면 먼저 밀접하게 관련된 종 및/또는 일반적인 대리모에게 시도하여 경험을 쌓고 숙련도를 구축하는 것이 좋습니다. 꿀벌 및 기타 곤충의 외골격은 다양할 수 있으며 덜 견고한 표본은 주의해서 다루어야 합니다. 더 작거나 더 부드러운 곤충 몸체를 연구하는 상황에서는 이 방법론이 충분하지 않을 수 있습니다. 사용자는 이 방법론의 어떤 부분이 자신의 국소 분류군에 적합한지 결정해야 합니다.

현장에서 수집된 유기체를 식별하기 위해 가두는 주요 목표를 넘어, 이 프로토콜은 꿀벌을 안전하게 가두어야 하는 다양한 연구 관련 작업을 수행하도록 수정될 수 있습니다. 예를 들어, 유기체는 재밀봉 가능한 샘플 백에 있는 동안 현장에서 칭량할 수 있습니다. 연구원들은 또한 곤충이 제한되어 있는 동안 캘리퍼스를 사용하여 표본을 다양하게 측정할 수 있습니다. 예를 들어, 꿀벌의 귀환 능력의 추정은 신체 크기⁴²를 사용하여 수행 할 수 있습니다. 우리의 방법론은 이러한 추정을 용이하게 하는 데이터를 획득하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마찬가지로, 캘리퍼를 사용하는 대신 연구원들은 표본 바로 뒤에 눈금자/눈금 막대 및/또는 컬러 카드를 배치하고 사진을 찍어 나중에 이미지를 처리할 때 주요 형태학적 특징을 측정할 수 있습니다. 이 방법의 향후 응용 프로그램은 인공 지능 및 기계 학습의 발전을 활용할 수 있습니다. 현장과 실험실 모두에서 스마트 장치를 사용하여 식별을 간소화할 수 있으므로 취급 시간과 표본에 대한 스트레스를 최소화할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
30x 60x illuminated jewelers eye loupe magnifier	JARLINK		Hand lens (if necessary) for observing diagnostic characteristics
Aerial hand net
Bleech in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
Blunt-tip kids scissors	Fiskar		Blunt-tip scissors are beneficial because they can safely be kept in pockets
Ethanol in wash bottle			Only needed for non-lethal genetic sampling
FD-1 flash diffuser	Olympus		Flash Diffuser to illuminate specimen while taking voucher photos
Field clipboard
Field cooler
Fine forceps
Fine point oil-based paint marker set	Sharpie		Pens to mark bees
Kimwipes	Kimtech
Microcentrifuge tubes			Only needed for non-lethal genetic sampling
Resealable sample bag	Amazon		Dependent on specimen of interest. We prefer 50.8 mm x 76.2 mm or 50.8 mm x 50.8 mm  - Edvision 2" x 3" Plastic Bags, 200 Count 2 Mil Transparent Resealable Zipper Poly Bags, Reclosable Storage Bags for Jewelry Supplies, Beads, Screws, Small Items  - Soft 'N Style 500 Count Resealable Zipper Poly Bags, 2 by 2-Inch, 50mm by 50mm, Clear
Stainless steel iris dissecting scissors			More precise than blunt-tipped scissors.  Should be kept in a secure location.
TG-7 or similar camera	Olympus		Camera with macro setting to take voucher photos