마우스의 머리 고정 가상 현실을 위한 행동 훈련 절차

요약

이 기사에서는 마우스에서 일반적으로 사용되는 선형 추적 가상 현실(VR) 패러다임에 대한 실험 절차를 설명하고 Y자형 신호 식별 작업을 테스트하여 복잡한 VR 작업을 실행할 수 있는 타당성을 결정합니다.

초록

머리 고정과 결합된 가상 현실(VR)은 머리 고정 마우스에서 복잡한 행동 분석을 수행할 수 있기 때문에 행동 신경 과학 연구에서 점점 더 많이 활용되고 있습니다. 이를 통해 정확한 행동 기록이 가능해지는 동시에 신경 기록 중 움직임 관련 신호 잡음을 최소화하기 위해 머리 고정이 필요한 다양한 신경 생리학적 기술을 통합할 수 있습니다. 그러나 VR의 사용이 증가하고 있음에도 불구하고 VR을 구현하는 방법에 대한 자세한 방법론에 대한 발표된 데이터는 거의 없습니다. 이 연구에서는 수컷 및 암컷 C57B16/J 마우스가 여러 훈련 세션에 걸쳐 길이가 1-3m에서 증가하는 가상 선형 복도를 달리도록 훈련하는 훈련 프로토콜을 개발했습니다. 이러한 토대를 바탕으로 본 연구는 Y-미로 패러다임을 사용하여 VR 내에서 복잡한 행동을 수행하는 생쥐의 타당성을 조사했습니다. 이 작업은 Y-미로의 선택 지점에서 검은 벽이 있는 팔로 이동하는 것이었습니다. 이틀 연속으로 70% 이상의 정답률 기준에 도달한 후, 생쥐는 점점 더 어려운 감각 구별로 진행되었습니다. 이 연구 결과는 VR에서 생쥐를 성공적으로 훈련시키는 데 유용한 방법론에 대한 중요한 세부 정보를 제공하고 생쥐가 Y-미로를 탐색하는 데 학습 능력을 보인다는 것을 보여줍니다. 제시된 방법론은 VR 기반 분석의 훈련 기간에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라 생쥐의 복잡한 행동을 조사할 수 있는 잠재력을 강조하여 보다 포괄적인 신경 과학 연구를 위한 길을 열어줍니다.

서문

가상 현실 작업은 머리 고정으로 인해 생쥐의 강력한 행동 평가 방법으로 부상했으며, 이는 자유롭게 행동하는 생쥐¹에서 손상될 수 있는 기계적 안정성을 허용합니다. 이 방법은 전기생리학적 기록^2,3 및^{광학 이미징4,5,6,7}에서 움직임 아티팩트를 줄일 수 있습니다. 또한 반복 가능한 행동⁸ 및 정확한 시선 추적⁹을 촉진합니다. 실험 설정에서 마우스는 제자리에 고정되고 공기가 지지되는 구형 트레드밀 위에 위치합니다. 이 장치를 사용하면 VR 환경 내에서 시각적으로 안내되는 동작을 복잡하게 탐색할 수 있습니다. 마우스가 트레드밀에서 움직이면 마우스의 움직임은 마우스를 둘러싼 화면에 시각적으로 표시되는 가상 풍경 내의 탐색과 원활하게 동기화됩니다.

이 연구의 목적은 실험적 행동 신경과학의 주요 과제를 해결하고 이 분야의 방법론 발전에 기여하는 두 가지입니다. 첫째, 학술 연구에서 VR의 사용이 증가하고 있음에도 불구하고 10,11,12 여전히 포괄적인 방법론과 교육 프로토콜이 현저히 부족하여 새로운 연구자가 이 기술을 채택하는 데 방해가 됩니다. 주요 목표는 선행 연구 ^13,14,15에서 설명한 바와 같이 선형 트랙 패러다임에 대한 상세한 교육 요법을 설명하여 이 격차를 메우는 것이었습니다. 이러한 운영 절차를 설명하기 위해 상업적으로 이용 가능한 시스템이 사용됩니다. 면책 조항으로, 이러한 절차 지침에는 이 시스템과 관련된 구성 요소가 있습니다. 그러나 이 프로토콜의 일반화 가능성에 대한 논의는 토론을 참조하십시오. 목표는 행동 절차, 이러한 절차를 수행하기 위한 일반적인 타임라인, 간단한 선형 트랙에서 실행되도록 마우스를 훈련시키는 성공률을 간략하게 설명하는 것이었습니다.

둘째, 마우스에서 이 패러다임 내에서 복잡한 미로 작업을 구현하는 방법에 대한 문서가 부족합니다. 쥐에서 복잡한 가상 분석법이 개발되었다¹¹. 그러나 생쥐는 이에 비해 시력이 저하되었으며¹⁶ 복잡한 작업에서는 시력이 더 떨어졌습니다¹⁷. 일부 연구는 증거 축적 또는 공간적 신규성¹⁸과 같은 특정 작업에 초점을 맞추었지만, 여기서는 쥐가 VR 환경 내에서 의사 결정 패러다임에 참여하는 데 필요한 훈련 방법론을 설명하는 데 중점을 두었습니다. 이 문제를 해결하기 위해 신호 구별 작업이 고안되었는데, 여기서 마우스는 보상된 팔의 색상/휘도(검은색 대 흰색)를 Y-미로의 선택 지점에서 검은색 팔을 선택하여 얻은 보상과 연관시키는 방법을 학습하는 작업만 수행했으며, 각 시도에서 올바른 팔을 무작위로 선택했습니다. 이 작업은 가상 신호와의 상호 작용을 필요로 하고 마우스의 지각 식별 능력에 대한 통찰력을 제공하도록 설계되었습니다.

요약하면, 본 연구는 생쥐에서 VR 패러다임을 사용하기 위한 포괄적인 훈련 프로토콜을 제공하고 이 프레임워크 내에서 복잡한 의사 결정 작업에 대한 방법론을 설명함으로써 실험 행동 신경과학 분야의 중요한 격차를 해결합니다. 이 연구는 이전 연구와 혁신적인 실험 설계에서 얻은 통찰력을 활용하여 연구 관행을 간소화하고 행동의 기저에 있는 신경 메커니즘에 대한 이해를 증진하는 것을 목표로 합니다. 다음 섹션에서는 실험 절차와 결과에 대해 자세히 살펴보고 결과에 대해 논의합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 NIEHS 동물 관리 및 사용 위원회에서 제정한 프로토콜을 엄격하게 준수하여 수행되어 윤리 기준 및 복지 지침을 준수하도록 했습니다. 약 8주 된 C57BL/6Tac 마우스가 연구에 활용되었습니다.

1. 헤드 바 이식 수술

1. 수술 준비
   1. 자신의 코호트에 대해 원하는 수의 마우스를 얻고, 이상적으로는 헤드-바 임플란트에 대한 간섭을 최소화하기 위해 개별적으로 수용하는 것이 이상적이지만, 이는 선택 사항이지만¹⁹. 이 연구는 3마리의 수컷 쥐와 3마리의 암컷 쥐의 표본 크기를 사용했습니다(처음에는 균형을 이루었지만 수컷 1마리는 공을 가지고 달리지 못해 훈련 초기에 제외되었습니다)
   2. Table of Materials(재료 표)에 지정된 재료를 획득하고 연구 설계의 세부 사항에 따라 조정합니다.
   3. 마우스를 획득할 때 개별 식별자를 지정하고 꼬리 문신 또는 귀 구멍 펀치를 적용하여 명확한 식별을 보장합니다. 물 제한 절차에 필요한 체중을 체계적으로 기록하기 위해 포괄적인 로그를 설정합니다.
2. 마취 투여
   1. 적절한 주사기, 발열 패드, 금속 제품(예: 핀셋, 마이크로 가위, 지혈기), 요오드 용액, 눈 윤활제, 식염수 및 과산화수소용 비커를 포함한 모든 수술 기구를 쉽게 사용할 수 있는지 확인합니다. 멸균 상태를 보장하려면 모든 수술 장비를 소독하고 오토클레이브를 사용하여 모든 수술 도구를 살균하십시오.
   2. 수술을 진행하기 전에 생쥐의 체중을 정밀하게 측정하고 가열 패드를 34°C로 작동시킵니다. 필요한 모든 정보를 해당 기관의 실험실/수술 노트에 기록하십시오. 산소 및 이소플루란 탱크 수준의 적절성을 확인하고 중단 없는 수술 절차를 촉진하기 위한 모든 필수 물질의 가용성을 확인합니다.
   3. 마우스를 긁어 마취를 유도하기 위해 4% 이소플루란과 3L/min의 산소 유속을 받는 작은 동물을 위해 설계된 기화기에 부착된 노즈콘에 넣습니다. 청소부를 사용하여 잠재적으로 유해한 폐가스를 포집합니다(권장).
   4. 안구 건조를 방지하기 위해 노즈콘 아래에 있는 마우스의 눈에 석유 안과 수의학 연고를 투여합니다. 처음에 각 눈에 한 방울씩 바르고 필요에 따라 다시 바릅니다. 주기적인 점검을 통해 항상 이 윤활제 층을 유지하여 눈을 지속적으로 보호하십시오.
   5. 두개골이 헤드 바에 부착될 부위를 면도하여 마우스의 머리에 수술 부위(그림 1A)를 준비합니다.
   6. 노즈콘 아래의 입체택시 장치 내에 마우스의 앞니를 배치하고 산소 유량을 1L/min으로 조정하고 기화기에서 1%-2% 이소플루란을 투여합니다. 밸브를 조정하고 그에 따라 유도 노즈콘과 정위 장치 사이를 전환하여 적절한 마취 흐름을 보장합니다. 마우스의 뒷다리를 뻗고 발가락에 강한 압력을 가합니다. 발이 반사적 금단 반응을 보이지 않으면 마취가 효과적임을 나타냅니다. 호흡 체크와 함께 15분마다 반복합니다.
   7. 외이도 내에 수술용 안정성 막대를 부착하여 쥐의 머리를 제자리에 고정하여 수술 중 잠재적인 머리 움직임을 최소화합니다.
   8. 절개나 주사를 하기 전에 면도한 정수리 수술 부위를 요오드 소독제에 적신 면봉으로 문질러 소독합니다. 이 단계부터는 멸균 장갑을 착용하여 무균 상태를 유지하십시오.
3. 주입 투여
   1. 두피의 절개 부위에 0.05G의 바늘로 부피바카인(국소 진통제) 25mL를 피하주사합니다.
   2. 1mL의 식염수(수화)를 25G 바늘로 견갑간 부위의 한쪽에 피하 주사합니다.
   3. 0.05mL의 부프레노르핀(전신 진통제)을 25G 바늘로 견갑간 부위의 반대쪽에 피하주사합니다.
4. 두개골 노출
   1. 마이크로 가위를 사용하여 두개골의 전두간 및 비강 봉합사 위의 피부를 눈썹 융기 바로 위에서 시작하여 후두 노치 뒤까지 절개합니다(그림 1A).
   2. 지혈기를 사용하여 피부의 왼쪽과 오른쪽 덮개를 눌러 두개골을 노출시킵니다.
   3. 마른 면봉을 사용하여 핀으로 고정된 피부 주름 사이의 두피에서 결합 조직을 제거합니다.
   4. 과산화수소를 적신 면봉(포화되지 않음)을 사용하여 두피를 문질러 봉합사가 잘 보이도록 하고 주변 조직에 과산화수소가 묻지 않도록 주의하십시오.
   5. 브레그마와 람다가 모두 뚜렷하게 보이고 두피가 완전히 청소될 때까지 1.4.3 및 1.4.4, 2x-3x 단계를 반복합니다.
5. 외과용 나사 이식
   1. 두개골에 두 개의 나사를 부착하고 한 나사는 브레그마 뒤쪽에, 다른 나사는 람다 앞쪽에 위치시켜 치과용 접착제의 표면적을 최대화하고 헤드 바의 안정성을 높입니다(그림 1B). 브레그마에서 지정된 거리의 대상에 나사의 위치를 배치합니다. 하나의 나사가 왼쪽에, 다른 나사가 오른쪽에 있는지 확인하고(즉, 전방-후방(AP) +1.00, 내측(ML) -1.00 및 AP -3.00, ML +3.00, 나사 사이에 헤드 바의 배치를 수용하고 좌표와 필요한 조정을 조정할 수 있는 충분한 공간이 있는지 확인합니다.
   2. 드릴링이 두개골 뼈로 제한되고 뇌 조직을 관통하지 않도록 목표 위치를 드릴링합니다.
   3. 드라이버를 사용하여 나사의 약 절반을 제자리에 조입니다. 두 번째 나사에 대해 반복합니다.
6. 헤드바 임플란트 부착
   1. 치과 용 시멘트를 혼합하여 오목한 표면에 초점을 맞춰 헤드 바 아래쪽에 투여하고 두개골의 전두엽 봉합사를 따라 바릅니다.
   2. 헤드 바를 전두간 봉합사 위에 배치하여 헤드 바의 치과 시멘트와 봉합사의 시멘트 사이의 결합을 용이하게 합니다. 굳을 때까지 약 5분 동안 원하는 각도로 손으로 제자리에 단단히 잡습니다. 필요에 따라 치과용 시멘트를 추가로 바르십시오. (그림 1C-E)
7. 헤드 바 위에 스킨을 다시 부착하는 경우
   1. 지혈기를 풀고 핀셋을 사용하여 건조된 치과용 시멘트로 고정된 헤드 바 위에 두 개의 피부 플랩을 다시 결합합니다. 국소 조직 접착제를 사용하여 전방 절개 부위에서 시작하여 후방 절개 부위까지 두피의 왼쪽과 오른쪽 부분을 헤드 바 위에 천천히 부착하여 피부를 섬세하게 고정합니다.
   2. 국소 조직 접착제가 굳어지도록 하여 수술 부위가 다시 밀봉되었는지 확인한 후 수술 안정성 바와 노즈콘에서 마우스를 분리합니다.
   3. 마우스를 단독으로 보관된 케이지로 옮기고 37.5°C의 가열 패드에 놓습니다.
   4. 마우스가 의식을 되찾을 때까지 마우스에 불편함이나 불규칙한 호흡 징후가 있는지 주의 깊게 모니터링하십시오. 마우스가 흉골 누운 자세를 회복하고 각성을 보이며 보행할 수 있을 때까지 마우스를 방치하지 마십시오.
   5. 수술 후 생쥐가 1주일 동안 휴식을 취하도록 합니다. 매일 생쥐를 모니터링하여 눈에 띄는 체중 변동을 감지하고 해결합니다. 회복을 돕기 위해 수술 3일 후 생쥐에게 매시를 제공합니다. 헤드 바에 대한 간섭을 방지하려면 이 마우스를 개별적으로 수용하십시오.

2. 유체 제한

참고: 물 제한은 생쥐에게 갈증 상태를 유발하여 액체 보상에 대한 동기를 높입니다. 그러나 생쥐의 웰빙을 보존하기 위해서는 세심한 실행이 필요하다²⁰.

1. 수술일로부터 1주일이 지나면 마우스의 기준 체중을 설정합니다.
2. 작은 페트리 접시(60mm x 15mm)의 한 부분을 오목한 면으로 케이지 바닥에 테이프로 붙이고, 더 작은 페트리 접시(35mm x 10mm)를 바닥에 테이프로 붙인 페트리 접시의 평평한 표면 중앙까지 오목하게 테이프로 붙이고, 또 다른 작은 페트리 접시(60mm x 15mm)를 중간 접시의 평평한 표면 위에 테이프로 붙여서 물통 역할을 합니다(그림 2).
3. 위쪽 접시의 높이가 침구 재료로 인한 오염을 방지하고 쥐가 물에 쉽게 접근할 수 있도록 합니다. 피펫을 사용하여 저장통에 일일 물 허용량을 추가합니다.
4. 1일차에는 생쥐에게 체질량 100g당 물 15ml를 제공합니다.
5. 2일차에는 생쥐에게 체질량 100g당 10mL의 물을 제공합니다.
6. 3일차에는 생쥐에게 체질량 100g당 5mL의 물을 제공합니다. 생쥐는 체중에 관계없이 연구 기간 동안 하루에 최소 1mL의 물을 섭취해야 합니다.
   참고: 연구자는 모든 피험자에 걸쳐 최소 부피를 균일하게 투여하도록 선택할 수 있지만, 이러한 조정은 신중하게 고려해야 합니다.
7. 연구 기간 동안 체중 100g당 5mL(또는 원하는 경우 균일한 1mL 물 할당)로 물 할당 기간 동안 일관된 복용량을 유지하십시오.
   참고: 생쥐가 VR 실험을 수행하지 않을 때(즉, 주말에) 일주일에 1-2일 동안 생쥐에게 물을 자유롭게 이용할 수 있는 기회를 제공해야 합니다. 이렇게 하면 자연적인 수분 수준을 회복할 수 있습니다. 마우스가 기록된 기준선 체중의 90% 미만으로 떨어지는 경우, 기준선 체중의 90%에 도달할 때까지 임시 방편수로 전환해야 합니다. 기록된 기준 체중의 80% 미만으로 떨어지는 마우스는 윤리적으로 안락사되어야 합니다.
8. 실험을 정확하게 수행하는 데 필수적인 자연스러운 갈증 행동에 대한 잠재적인 간섭을 완화하기 위해 행동 평가 후 일일 수분 투여량을 최소 30분 연기합니다.
   참고: 임상시험 직후 유동 보상을 제공하면 즉각적인 보상을 받을 것으로 예상할 수 있으므로 의도치 않게 마우스의 성과에 영향을 미칠 수 있으며, 이로 인해 작업 참여도가 손상될 수 있습니다. 따라서 임상시험 후 물에 대한 접근을 지연하면 즉각적인 보상 제공에 대한 습관화를 방지하고 실험 설정의 무결성을 보존할 수 있습니다.

3. 시스템 설정

1. 장비 숙지: 하드웨어 구성요소 및 VR 동작 시스템의 기타 고려 사항은 아래 단계를 참조하세요.
   비교 가능한 시스템 설정에 대한 프로토콜 일반화 가능성에 대한 검토는 토론 섹션을 참조하십시오.
   1. 완전히 몰입할 수 있는 가상 디스플레이 또는 돔: 이 가상 디스플레이는 사용자 정의 가능한 가상 환경 내에서 동물에게 완전한 몰입을 제공합니다. 가상 환경 내에서의 움직임은 구형 트레드밀에서의 움직임과 동기화됩니다.
   2. 액체 보상 시스템: 액체 보상 시스템은 연동 펌프를 사용하여 액체 보강재(물 또는 설탕물)를 전달하여 작동하며, 작업이 성공적으로 실행되면 마우스로 확장되는 플라스틱 코팅된 금속 튜브를 통해 보상 용액을 지시합니다. 여기에는 시험 중에 마우스가 얻은 보상의 양을 모니터링하는 센서가 포함되어 있습니다.
      1. 보상 튜브는 매주 에틸 알코올 또는 대체 세척제를 사용하여 청소하십시오. 이렇게하려면 액체 보상의 전달과 유사하게 튜브를 통해 2-5mL의 세척제를 세척 한 다음 동일한 부피의 물로 비슷한 세척을 수행합니다.
      2. 실험을 시작할 때 보상 튜브를 지정된 기간 동안 활성화하고 분배된 액체의 부피를 측정하여 보상 튜브에서 액체 보상의 분배 속도를 결정합니다. 이 절차를 통해 연동 펌프의 액체 전달 속도를 결정할 수 있습니다. 이 조사에서는 약 0.0083mL/s의 디스펜싱 속도가 사용되었습니다.
         참고: 대부분의 시스템은 행동 실행과 보상 방출 사이의 기간에 대한 프로그래밍 가능한 설정을 제공하여 시도당 의도된 보상량에 따라 연구 프로토콜을 정확하게 계획할 수 있습니다. 사용된 양은 쥐가 보상을 소비할 수 있는 충분한 시간을 허용했기 때문에 충분한 것으로 확인되었으며, 그 양은 동기 부여가 되는 것으로 보였습니다.
      3. 일부 프로토콜에서는 보상 전달을 시작하기 위해 마우스가 보상 주둥이를 핥아야 할 수 있습니다. 여기에 사용된 작업 유형의 경우 이 기능이 사용되지 않았으며 원하는 동작의 성공적인 실행(즉, y-미로에서 올바른 팔 선택)에만 보상을 제공합니다. 이것은 핥는 경향이 충분히 확립되지 않았고 초기 핥기가 발생할 가능성이 적은 훈련 초기에 실패를 방지하는 데 도움이 됩니다. 또한 보상 기대치를 측정할 수 있으며, 이는 일부 조건¹¹에서 항해 성능과 분리될 수 있습니다.
      4. 유체 제한을 사용하는 일부 실험은 보상 튜브를 통해 표준 물을 사용하는 것을 선택하지만, 여기서는 조작 패러다임 내에서 추가 동기 부여 자극으로 설탕물(10% 자당 v/v)을 사용합니다. 특히, 설탕물의 도입으로 여러 실험 코호트에서 향상된 성능이 관찰되었습니다.
   3. 스티로폼 공: 이 공은 구형 러닝머신 역할을 합니다. 아래에서 공기가 완충되면 쥐가 공 위에서 편안하게 달리거나 걸을 수 있도록 훈련시킵니다. 거리와 속도에 대한 데이터를 수집하는 모션 추적 센서가 장착된 볼 홀더 위에 놓습니다.
   4. 헤드 홀더: 헤드 바를 홀더에 부착할 때 VR 디스플레이와 시각적으로 정렬되도록 장치를 마우스 뒤쪽에 배치합니다. 이 장치는 마우스를 머리에 고정한 상태로 유지하는 데 매우 중요하며, 이를 통해 특히 시스템이 광학 이미징 또는 전기 생리학 기술과 함께 사용될 때 모션 아티팩트를 완화합니다.
   5. 공기 흐름 하드웨어: 공 위를 달리는 마우스에 도움이 되는 무중력 환경을 만들기 위해 압축 공기 소스에서 공까지의 공기 흐름을 구성합니다. 이 설정에는 볼에 가해지는 공기 압력을 정밀하게 제어하기 위해 유량 조절기가 필요합니다. 볼은 최소한의 공기 공급으로 무중력 환경 내에서 효율적으로 작동합니다. 따라서 시스템 설정 중에 홀더 내에서 볼이 부드럽고 방해받지 않고 움직일 수 있도록 하는 데 필요한 최소한의 공기량을 확인하십시오. 10-20L/min 사이의 유량을 권장합니다.
2. 소프트웨어 설정: 시스템 작동에 대한 자세한 내용은 아래를 참조하십시오.
   주: 비디오 게임⁽²¹)의 설계와 매우 흡사하게, 가상 세계의 아키텍처는 외부 컨트롤러, 프로그래밍 가능한 탐색 가능한 환경, 및 동적 기능을 설명하는 상태 다이어그램을 포함하는 스케줄 파일과 같은 핵심 요소를 통합한다. 이러한 구성 요소는 시너지 효과를 발휘하여 연구에 참여하는 피험자를 위한 응집력 있는 대화형 경험을 만듭니다. 소프트웨어의 작동 효율성은 지정된 폴더 내의 정확한 파일 구성에 따라 달라집니다. 이 설명은 미리 만들어진 템플릿을 채우는 데 필요한 주요 단계를 간략하게 설명하여 기존 파일을 쉽게 조정하고 새 버전으로 저장할 수 있도록 합니다. 이러한 새로운 버전은 연구의 기초를 형성할 것입니다.
   1. 다음 세 개의 파일을 함께 사용하여 운영 가상 랜드스케이프를 구성합니다.
      1. XML 파일: 이 파일 형식은 사용자에게 하늘, 바닥 및 벽과 같은 다양한 요소의 사진 질감을 조작할 수 있는 기능을 제공합니다. 이미지에 사용된 파일을 VR 폴더의 Data 하위 폴더에 배치합니다. 이를 사용하여 미로의 크기를 지정하고 미로 내에서 마우스의 초기 위치를 결정합니다. 이러한 파일을 사용하여 미로 내의 특정 노드에서 3D 개체(시각적 신호)를 정의합니다. 텍스트 편집기를 사용하여 이러한 파일을 수정합니다.
      2. XLSX 파일: 이들은 세 가지 파일 형식(XML, XLSX 및 XAML)을 모두 구성하여 응집력 있고 상호 작용적인 가상 프레젠테이션을 형성하는 명령 파일로 작동합니다. 이러한 파일을 사용하여 VR 및 해당 액세서리를 실행하는 실험 루틴(예: 게인 감도, 추출되는 데이터, 실험을 위해 함께 그룹화되는 파일)을 정의할 수 있습니다.
      3. XAML 파일: 소프트웨어 응용 프로그램은 순서도를 활용하여 실험 일정을 생성하기 위한 그래픽 인터페이스를 제공합니다. 이를 통해 시험에 대한 시간적 매개변수의 정의, 시험이 완료된 후 순간 이동에 대한 제어, 시험 프레임워크 내에서 디지털 출력에 대한 활성화 타이밍을 용이하게 합니다.
   2. 다음 응용 프로그램을 사용하여 시스템이 작동하는 동안 데이터를 수집하고 사용자가 제어할 수 있습니다.
      1. [신청] VR: 대표적인 랜드스케이프를 보여주는 .XML 파일과 연결되어 파일을 열어 정적 모드의 모니터에서 가상 랜드스케이프를 미리 봅니다. 동적 상호 작용의 경우 페어링된 구성을 엽니다. XLSX 파일을 만듭니다.
      2. [application] control: .XSLX 파일과 연결된 경우 이 응용 프로그램을 열어 시스템과 연결된 액세서리 장치를 확인합니다. 보상 튜브를 수동으로 확장 및 축소하고, 액체 보상을 분배하고, 여기에서 실시간 데이터 수집을 볼 수 있습니다.
      3. [application] schedule designer: 이 애플리케이션은 XAML 파일을 조정하여 실험 내에서 이벤트 트리거에 대한 일정을 설정하는 기능을 제공합니다. 예를 들어, 사용자 정의 가능한 트리거를 설계하여 보상 분배 기간을 결정하고 마우스에 대한 시도 사이의 휴식 기간을 정의할 수 있습니다.
3. 시작 예: 3.2.1.1-3.2.1.3 단계의 조정 가능한 구성 요소를 기반으로 연구 프로토콜이 어떻게 생겼는지 결정하는 것으로 시작합니다. 조작 프로토콜이 명확하게 정의된 후 아래 단계에 따라 VR 시스템과 함께 사전 설정된 템플릿 실험 중 하나를 엽니다.
   1. Data 하위 폴더가 열리는 VR 애플리케이션을 엽니다. 생성된 가상 랜드스케이프를 XML 파일로 저장합니다. 이 파일을 열면 가상 랜드스케이프가 VR 모니터에 나타납니다.
   2. Control 애플리케이션을 열고 화면 오른쪽 상단에 있는 Open folder(폴더 열기) 아이콘으로 이동합니다. 아이콘을 클릭하면 Configs 폴더가 표시되며, 여기서 해당 . XLSX 실험 구성이 있습니다. 를 엽니다. VR 응용 프로그램에서 열린 .XML 파일과 동일한 이름의 XLSX 파일. 확장 가능한 보상 장치용 펌프 및 모터와 같은 정의된 시스템 액세서리는 이제 애플리케이션 내의 제어 탭에서 볼 수 있습니다.
   3. 이 두 응용 프로그램 간의 조정을 통해 대화형 가상 풍경을 만들 수 있으므로 실험적인 시도를 시작하십시오. 궁극적으로 이 통합은 XY 평면의 거리 및 타임스탬프를 통한 보상 수집을 포함한 필수 데이터의 모니터링을 용이하게 합니다.
4. 데이터 수집: 시스템에서 가장 가치 있는 행동 데이터(타임스탬프가 지정된 위치 데이터 및 보상)를 추출합니다. 이러한 데이터는 로그 파일로 별도로 저장됩니다.
   1. 위치 데이터: 이를 가져오려면 아래 설명된 단계를 따르십시오.
      1. 마우스의 타임스탬프가 지정된 XY 위치 데이터를 수집하려면 먼저 원하는 데이터 수집의 미로에 대한 스프레드시트 파일을 엽니다. 표 1에서 WriteVRAndCamInfoToFile 명령을 A열의 다른 셀 아래 셀 중 하나에 넣습니다. 이제 위치 데이터는 평가판 사용 후 날짜가 지정된 CSV 파일(Log files-MM.DD.YYYY_VRandPathPos.csv)로 configs 폴더에 자동으로 저장됩니다.
      2. 시험 사용 후 위치 데이터를 내보내려면 제어 응용 프로그램을 닫고 데이터가 날짜가 지정된 CSV 파일로 저장됩니다. 이 파일에는 특정 날짜에 대한 모든 특정 데이터가 포함되므로 각 피험자가 언제 공에 올려지고 벗겨졌는지 수동으로 기록하도록 주의하십시오. 파일을 열고 유니코드 UTF-8 문자 집합을 사용하여 가져옵니다. A 열에는 DateTime이라는 레이블이 지정되어 있으며 A 탭을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 셀 서식을 클릭합니다. 시간으로 이동하여 MM/DD/YYYY HH:MM: SS 옵션을 클릭합니다. 이제 각 시스템 이벤트는 추가 데이터 분석을 위해 시간순으로 카탈로그화됩니다.
   2. 보상 데이터: 이를 획득하려면 아래 설명된 단계를 따르십시오.
      1. 펌프 활성화(보상 분주)에 대한 데이터는 시스템에 날짜가 지정된 로그 파일로 자동 저장되므로 위치 데이터와 같은 명령을 입력할 필요가 없습니다. 여기에 액세스하려면 configs 폴더의 Log Files 하위 폴더로 이동합니다.
      2. 보상 데이터에 대한 위치 데이터에 대해 3.4.1단계를 반복하여 데이터를 스프레드시트 파일로 내보냅니다. configs 폴더를 열고 폴더에서 볼 때 날짜가 지정된 보상 파일(Corridor- MM.DD.YYYY 또는 Corridor_Linear_Run- MM.DD.YYYY)을 선택합니다. 이것은 생쥐가 보상을 획득한 날짜와 시간을 제공하며, 그들이 채택한 패러다임에 따라 추가 데이터 분석에 이를 사용할 수 있습니다.

4. 행동 과제

참고: 행동 신경 과학에서 확립된 방법론에 따라 공식화된 과제는 보상 기반 연관 학습 기술을 사용합니다. 특정 행동을 강화하기 위해 즉각적인 보상을 사용함으로써 동물들은 VR의 순간 이동 기능을 통해 반복적인 작업을 수행할 수 있도록 효과적으로 훈련됩니다. 가상 행동 프레임워크 내에서 순간이동 기능을 통해 마우스는 물리적 조작과 관련된 스트레스 없이 작업에 참여할 수 있으며, 동시에 유사한 실제 작업에 필요한 설정 시간을 줄일 수 있습니다. 교육 세션 중에는 실험 환경 내에서 희미한 빨간색 오버헤드 조명을 사용합니다. 이 예방 조치는 적색광에 대한 마우스의 시각적 지각 민감도가 감소하여 백색광을 사용하는 것과는 대조적으로 가상 현실(VR) 화면에 대한 인식에 대한 잠재적인 간섭을 완화하기 때문에 권장됩니다²².

1. 습관화
   1. 정확한 타이밍의 생리적 동기를 사용하여 핥기 튜브를 보상과 연결하기 위해 유체 조절에 대한 습관화와 동시에 구형 트레드밀에 대한 습관화를 시작하십시오. 선형 트랙 훈련을 시작하기 전에 3일의 습관화 기간을 갖는 것이 좋습니다.
   2. 1^일째 에는 체중을 잰 후 5분 동안 쥐를 다루십시오. 이 상호 작용 중에는 마우스가 케이지에 있는 동안 헤드-바 임플란트를 부드럽게 잡고 이러한 조작에 익숙해지는 것이 좋습니다. 이 날에 VR이 보관되는 지역을 소개하여 실험이 진행될 공간 환경을 예상할 수 있도록 합니다. 이 습관화의 첫날은 신체 질량 100mg당 15mL의 체액 조절이 시작되는 시기와 일치합니다.
   3. 체질량 100mg당 10mL의 체액 조절 단계로의 전환과 일치하는 2^일 째에 다시 5분 동안 마우스를 처리합니다. 케이지 안에 있는 동안 헤드 바를 계속해서 부드럽게 잡습니다. 헤드 바를 홀더에 부착하면서 마우스가 무한 반복 트랙에서 또는 소프트웨어 프로그램을 활성화하지 않은 상태에서 5-20분 동안 구형 트레드밀에 익숙해질 수 있도록 합니다. 이것은 머리가 고정된 상태에 대한 적응을 용이하게 합니다. 생쥐는 이 기간 동안 배설물을 배설할 수 있으며, 이는 일반적으로 연속적인 세션에 걸쳐 감소합니다.
   4. 체액 조절 패러다임의 마지막 날(체질량 100mg당 5mL)에 해당하는^3일째 에 마우스를 5분 동안 처리합니다. 그런 다음 에어 쿠션이 있는 구형 트레드밀에 단단히 부착하고 보상 튜브를 통해 액체 보상을 소개합니다.
      1. 순진한 생쥐에게 핥는 주둥이를 소개하면 처음에는 혼란스러워할 것이므로 생쥐가 튜브에서 물을 마셔야 한다는 것을 알고 있는지 확인하십시오.
   5. 너무 강압적이지 않고 아래 마우스 지침의 위치를 적용하고 편안한 방식으로 보상을 전달할 수 있는 방식으로 튜브에 대해 볼에 대한 마우스의 위치를 개별화하십시오. 시작할 때 마우스가 튜브에서 물을 마시고 있는지 확인하십시오. 이것은 대부분의 생쥐에서 마실 액체와 함께 제공될 때 물이 제한된 조건에서 자연적으로 발생합니다.
2. 마우스 위치 지정
   1. 사전 위치 지정: 공에 마우스를 놓기 전에 끝에 작은 보상 방울로 중앙의 보상 튜브를 확장합니다. 마우스가 머리가 고정된 후 실수로 튜브를 너무 앞으로 확장하여 발생할 수 있는 부상을 방지하기 위해 마우스를 볼에 배치하기 전에 보상 튜브를 확장하십시오. 보상 튜브를 구형 트레드밀에서 5-15mm 위로 올려 주둥이를 핥을 때 머리가 자연스럽게 앞을 향하는 자세를 취하도록 합니다.
   2. 헤드 고정: 마우스를 헤드 고정하려면 구형 트레드밀의 핸들러의 우세한 쪽에 마우스를 놓습니다. 그런 다음 핸들러의 주로 사용하는 손을 사용하여 헤드 바를 잡고 마우스를 헤드 고정 플랫폼 쪽으로 당깁니다. 고정을 위한 슬롯에 헤드 바를 놓은 다음 핸들러의 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 헤드 바를 제자리에 클릭합니다.
   3. 공의 위치: 각 마우스에 대해 구형 트레드밀의 배치를 개별화하되 보상을 맛볼 동기를 보장하고 전반적인 스트레스 수준을 최소화하기 위해 다음 요구 사항을 충족하는지 확인합니다.
      1. 마우스의 midsagittal plane을 구형 트레드밀의 중심에 정렬합니다. 헤드 바가 직선이 아닌 경우 헤드 바가 아닌 마우스의 중간 시상면이 배치의 중심과 일치하는지 확인하십시오. 시각적 명확성을 위해 그림 3C를 참조하십시오.
      2. 마우스의 뒷발이 구형 트레드밀의 정점에서 11cm 이상 떨어져 있지 않고 머리가 정점 뒤에 있는지 확인하십시오. 네 개의 발이 모두 트레드밀에 닿고 마우스가 쉬고 있을 때 복부가 트레드밀에 닿을 수 있는지 확인하십시오. 이것은 달리기를 위한 공의 적절한 걸음걸이와 안정성을 지원합니다.
      3. 쥐가 뛰지 않을 때, 이것을 공 거부라고 합니다. 쥐가 계속 얼어붙고 뛰려고 하지 않으면 과도한 불안을 경험하고 있을 가능성이 높으며 조사자는 실험에서 쥐를 제외하기로 선택합니다. 이 연구에서는 데이터에서 제외를 결정하기 위해 5일의 볼 거부라는 정량적 임계값을 사용했습니다.
   4. 사이드 바이어스(Side bias): 생쥐가 처음으로 훈련 루틴에 익숙해지기 시작할 때, 한쪽을 다른 쪽보다 선호합니다. 이것은 작업 수행을 방해할 수 있으므로 동물이 공에 장착되는 방식의 비대칭으로 인한 측면 선호가 없는지 확인하십시오. 여기에서 사용된 y-maze 작업은 특히 동물이 보상 전달을 최적화하기 위해 오른쪽과 왼쪽을 모두 선택하도록 요구하며, 이는 측면 선호를 극복하는 데 도움이 됩니다.
   5. 보상 주둥이: 이 접근 방식에는 키스 잇 방법이라고 하는 부드러운 기동이 포함되며, 마우스의 입이 끝에 거의 닿을 때까지 확장된 핥기 튜브로 안내하여 보상의 정확한 전달을 보장합니다. 마우스가 보상을 받을 때 확장된 보상 튜브의 지속 시간을 1초로 설정하여 마우스가 방울을 완전히 소비할 수 있는 충분한 시간을 허용합니다. 각 개별 마우스의 크기와 선호하는 위치가 다를 수 있으므로 각 마우스에 대한 핥기 스파우트 위치를 개별화합니다. 핥기 표준화를 위한 모든 시도에서 보상 튜브가 중앙에 유지되도록 합니다. 마우스는 가상 미로 설계에 관계없이 항상 동일한 물리적 위치에서 보상을 받을 것으로 예상해야 합니다.
      참고: 이 기간의 결정은 조사자의 재량에 달려 있지만, 이러한 결과는 이 기간이 튜브를 후퇴시키기 전에 마우스의 완전한 보상 섭취를 촉진하는 데 효과적임을 나타냅니다. 도 3B 는 배치를 위한 바람직한 포지셔닝의 예를 보여준다.
   6. 선형 추적: 유사한 방법론을 사용한 이전 연구와 일관되게 선형 추적 작업을 사용하여 두 가지 주요 질문, 즉 쥐가 직선 통로를 횡단하도록 훈련하는 데 필요한 시간과 쥐의 예상 보상 획득 성공률을 조사합니다.
      1. 마우스가 유체 제한 패러다임과 실험 하드웨어 모두에 적응했는지 확인합니다.
      2. 매일 30분 세션을 수행하여 1m 길이부터 시작하는 선형 가상 복도를 따라 이동합니다. 복도 끝에 도달하여 설탕 방울 보상을 받으면 생쥐를 시작 지점으로 다시 텔레포트합니다.
      3. 더 긴 미로(예: 1m, 2m, 3m)에 대한 기준 기반 발전을 결정합니다. 2일 연속으로 분당 평균 2개의 보상을 받은 후 마우스를 다음 미로 길이로 진행합니다(그림 4A).
      4. 보상 검색과 관련하여 타임스탬프가 찍힌 데이터의 일일 기록과 추가 분석을 위해 구형 트레드밀에서 마우스가 이동한 거리를 문서화합니다(그림 4B-D).
      5. 3m 선형 트랙에서 분당 평균 2개의 보상을 받은 마우스의 경우 선형 트랙 패러다임에 능숙한 것으로 표시합니다. 마우스는 의사 결정이 필요한 더 복잡한 행동 작업으로 진행하기 전에 이 단계에 도달하는 것이 좋습니다.
   7. 의사 결정이 필요한 복잡한 행동 작업(Y-Maze): 이 단계에서는 단순한 작업 대신 의사 결정이 필요한 복잡한 작업 작업으로 진행할 수 있는 가능성을 살펴봅니다. 이를 위해 고안된 신호 판별 Y-Maze 작업을 만듭니다.
      1. 이 Y-미로 패러다임 ^23,24에서, 마우스가 Y자 모양처럼 어느 방향으로든 45° 뻗어 있는 두 개의 팔이 있는 선택 지점을 향해 이동하도록 합니다. 미로의 시작점에서 다양한 색상의 두 팔인 선택 지점에 도달할 때까지 회전을 비활성화한 다음 결정 영역 내에서 활성화하여 마우스가 원하는 방향으로 선회할 수 있도록 합니다.
      2. 보상 구역으로 이어지는 팔에 진입하면 회전을 다시 한 번 비활성화합니다. 검은색 암은 올바른 경로를 나타내고 흰색 암은 잘못된 경로를 나타냅니다. 검은색 팔과 흰 팔을 단서로 사용하여 쉽게 구별할 수 있으므로 마우스의 시력에 대한 잠재적인 제한을 수용하여 가장 단순한 형태의 시각적 정보 사용을 쉽게 검사할 수 있습니다.
      3. 생쥐가 설탕 보상을 얻기 위해 블랙 암 쪽으로 이동하도록 훈련시키고, 각 시도는 생쥐가 시작 위치로 다시 순간이동하는 것으로 끝납니다. 실험 설계에 왼쪽과 오른쪽 사이의 보상 위치를 무작위로 섞어 마우스가 보상을 특정 측면이 아닌 시각적 신호와 연관시키도록 합니다.
      4. Y-미로를 선형 코리더와 동일한 단계로 설정합니다. Y-미로 패러다임의 진행 기준을 선형 회랑의 기준에 반영하면 각 시도는 30분 동안 지속되며 마우스는 연속 2일 동안 미리 결정된 보상 임계값에 도달해야 합니다. 올바르게 획득한 70% 보상의 임계값은 Y-미로에서 이전 파일럿 코호트의 평균 성과를 기반으로 권장됩니다. 이는 확률 임계값(50%)을 초과하며, 마우스가 작업을 이해하고 있음을 나타내는 합리적으로 달성 가능한 백분율을 나타냅니다(그림 5A).
      5. 선택 지점에 도달하면 마우스가 올바른 암 또는 잘못된 암 중 하나를 선택하는지 확인합니다. 팔의 끝에서 시작 지점으로 다시 텔레포트하여 30분 동안 미로를 반복합니다.
      6. 이 접근 방식은 시각적 정신 물리학에서 영감을 받은 접근 방식을 사용하여 미로를 구별하기가 점점 더 어려워졌습니다. Y-미로 패러다임의 진행 상황에 대해서는 아래 설명을 따르십시오.
         1. 초기 Y-미로에서 미로의 선택 지점에 단단한 검은색과 흰색 팔을 제시합니다. 마우스가 연속 2일 동안 시행된 시험의 70%에서 블랙 암을 올바르게 선택했다면 점점 더 까다로워지는 차별 과제를 통해 다음 단계로 진행합니다. 이를 달성하려면 모든 진행 수준에서 각 팔에 대비되는 색상의 10%를 점진적으로 추가로 도입하십시오. 예를 들어, 흰색 팔을 90%가 흰색이고 10%가 검은색으로 구성되도록 또는 그 반대로 전환하면 각 발전에 따라 차별이 더 까다로워집니다.
            참고: 증가에 대한 아이디어는 50%의 흰색/검은색에 도달할 수 있다면 팔을 구별할 수 없기 때문에 효과적인 제어가 될 것입니다. 그러나 마우스가 시각적으로 구별할 수 있는 가장 먼 거리는 80%:20%였습니다(그림 5B).

결과

이 파일럿 연구는 간단한 복도와 복잡한 의사 결정 작업(Y-미로 시각 구별 작업)이라는 두 가지 별개의 작업에서 쥐를 효율적으로 훈련시키기 위한 방법론을 설명하는 것을 목표로 했습니다. 이러한 데이터는 VR에서 행동 훈련을 위한 시간적 가이드라인을 수립하는 기초가 되었습니다.

절차 단계는 그림 1에서 헤드 바의 외과적 이식을 간략하게 설명하는 것으로 시작합니다. 이 임플란트는 행동 평가 중에 마우스의 두개골을 안정화하는 역할을 하며, 특히 전기 생리학 또는 이미징 기술과 함께 사용할 때 신경 기록의 정밀도를 향상시킵니다.

그림 2 와 그림 3 은 실험 시스템의 하드웨어 구성 요소와 설정을 보여줍니다. 그림 2 는 페트리 식수대 방법을 활용한 물 공급 시스템을 자세히 설명합니다. 여기에는 60mm x 15mm 페트리 접시를 오목한 면이 아래로 향하게 하여 케이지 바닥에 부착하고, 더 작은 35mm x 10mm 페트리 접시를 오목한 면이 아래로 향하게 하여 더 큰 접시의 중앙에 고정하고, 또 다른 60mm x 15mm 페트리 접시를 오목한 면이 위로 향하게 하여 더 작은 접시 위에 놓아 저수지 역할을 하는 것이 포함되었습니다. 상부 접시의 높이는 침구 재료에 의한 오염을 방지하는 동시에 쥐가 물에 쉽게 접근할 수 있도록 신중하게 조정되었습니다.

그림 3 에는 시스템 하드웨어 및 마우스 위치 지침이 나와 있습니다. 그림 3A 는 중앙에 구형 트레드밀이 위치한 6개의 스크린 어레이를 특징으로 하는 VR 설정을 보여줍니다. 그림 3B 는 머리가 자연스러운 위치에 정렬되고 네 발이 모두 표면과 접촉하는 트레드밀에서 마우스의 최적 위치를 보여줍니다. 그림 3C 는 헤드 바를 기준으로 올바른 마우스 배치와 잘못된 마우스 배치를 비교하며, 마우스의 중간 시상면이 헤드 바 자체와 정렬되는 것이 아니라 중앙에 있어야 한다는 점을 강조합니다.

그림 4 는 선 그래프에 보상 획득 곡선을 표시하며, 진행을 위해 미리 정의된 매개변수를 기반으로 VR에서 1m, 2m, 3m의 좁은 복도에 대한 예상 학습 시간을 보여줍니다. 각 트랙 길이에 걸쳐 마우스의 평균 속도를 나타내며, 난이도 증가에 상응하는 작업 학습 및 개선의 증거로 속도가 점진적으로 증가함을 보여줍니다. 또한 마우스가 선형 트랙의 기준에 도달하는 데 필요한 평균 일수를 보여주는 막대 그래프와 각 트랙 길이에 대한 평균 속도를 표시하는 막대 그래프가 표시됩니다. 그 다음에는 마우스가 학습한 선형 추적 작업의 점진적 단계도 설명됩니다. 이러한 작업은 학술 문헌에 확립된 방법론을 복제하는 동시에 마우스가 실현 가능한 학습 곡선을 보장하여 레벨을 통한 발전을 촉진하도록 설계되었습니다.

마지막으로 그림 5 는 Y-Maze 작업과 관련된 데이터를 제공합니다. 이 그림은 단색 흑인 팔과 흰색 팔을 간단하게 구별하는 것으로 시작하여 작업의 점진적인 성격을 보여줍니다. 이 초기 단계는 대조되는 시각적 신호를 구별하는 쥐의 능력을 확립하는 기본 단계 역할을 합니다. 작업의 후속 수준에서는 각 팔에 대비되는 색상의 추가 비율을 통합함으로써 복잡성을 증가시켜 마우스의 구별 능력에 더 많은 도전을 가합니다. 과제 난이도의 점진적인 증가는 단색 흑백 팔에서 한 가지 색상의 90%와 다른 색상의 10%로 구성된 팔로의 전환으로 예시됩니다. 특히, 그림 5 에 제시된 데이터는 각 진행 수준에 따라 변별의 정확도가 향상되는 반면, 일부 마우스는 지속적으로 시각적 변별 능력의 임계값을 보여 최대 80%/20%의 백인/흑인 변별에 도달한다는 것을 나타냅니다. 이 관찰은 Y-Maze 과제의 맥락에서 쥐의 시각 구별 능력에 내재된 한계를 강조하여 과제의 실현 가능성과 피험자의 인지 능력에 대한 귀중한 통찰력을 제공합니다. 그 후, 문헌에서 확립된 방법론에 맞게 설계된 Y-미로 추적 작업의 점진적 단계가 자세히 설명되어 있습니다. 이러한 단계는 생쥐에게 실현 가능한 학습 곡선을 보장하여 레벨을 통해 점진적인 발전을 지원했습니다.

그림 1: 헤드 바 이식을 위한 수술 지침. (A) 절개 부위는 마우스의 두개골에 표시되어 있습니다. (B) 나사는 브레그마보다 약간 아래에 있는 전두간 봉합사의 왼쪽으로 1mm, 람다보다 약간 높은 전두간 봉합사의 오른쪽으로 3mm에 이식해야 합니다. (C) 헤드 바는 전두간 봉합사를 따라 배치해야 합니다. (D) 헤드바 임플란트 위에 치과용 시멘트를 바릅니다. (E) 치과용 시멘트를 도포한 후 헤드바의 실제 시각화. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 페트리 접시 분수 방법을 사용한 물 공급 시스템. 60mm x 15mm 페트리 접시는 케이지 바닥에 오목한 면이 아래로 향하게 고정되었습니다. 더 작은 35mm x 10mm 페트리 접시는 더 큰 접시 중앙에 배치되었고, 다른 60mm x 15mm 페트리 접시는 저장소 역할을 하기 위해 오목한 면이 위로 향하게 놓였습니다. 이 설정은 물이 침구에 의해 오염되지 않고 쥐가 접근할 수 있도록 했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 시스템 하드웨어 및 마우스 위치 지침 (A) 사용된 VR 설정이 표시됩니다. 구형 트레드밀이 중앙에 배치된 6개의 화면 설정이 사용되었습니다. (B) 구형 트레드밀에서 최적의 마우스 배치를 옆모습으로 보여줍니다. 마우스 머리는 자연스러운 위치에 있고 네 발은 모두 구형 트레드밀에 있습니다. (C) 헤드 바와 관련하여 마우스의 올바른 위치와 잘못된 배치의 상단 보기. 올바른 배치를 위해서는 헤드바 자체가 아닌 마우스의 중간면이 중앙에 있어야 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 선형 트랙 데이터. (A) 제시된 데이터는 각 30분의 시험 기간 내에 수집된 일일 보상을 나타냅니다. 마우스는 연속 2일 동안 분당 평균 2개의 보상을 달성하면 더 긴 트랙 길이로 진행하여 총 60개의 보상(임계값)을 달성했습니다. (B) 생쥐가 과제에 숙련됨에 따라 속도가 점진적으로 증가했는데, 이는 보상 강화의 효과를 나타냅니다. 이 그래프는 트랙에 있는 각 마우스의 평균 일일 속도를 cm/s 단위로 보여주며, 학습된 행동의 선형 진행을 보여줍니다. (C) 이 막대 그래프는 각 마우스가 개별 트랙 길이에 대한 숙련도를 획득하는 데 걸린 시간을 각 트랙 길이에 대해 표시된 각각의 평균 및 표준 오류와 함께 보여줍니다. (D) 이 막대 그래프는 다양한 트랙 길이에 걸쳐 각 마우스가 달성한 평균 일일 속도의 평균 및 표준 오차를 보여줍니다. 거의 선형에 가까운 진행은 달리기 속도의 학습된 향상을 암시합니다. (E) 이것은 더 긴 버전의 미로로 진행하기 전에 60개의 보상으로 2일 연속 시험이 필요한 선형 트랙 작업의 진행 상황을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5: Y-Maze 데이터. (A) 이것은 Y-미로 진행의 여러 단계에서 획득한 보상의 분포를 보여줍니다. 이 분석은 선형 트랙의 모든 단계를 완료한 4마리의 쥐 하위 집합에만 집중하여 남성과 여성 참가자 모두를 공평하게 대표할 수 있도록 했습니다. (B) 이 시각적 표현은 Y-Maze 과제의 단계를 보여주며, 마우스는 이틀 연속으로 70%의 정확한 선택을 달성하면 진행됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구는 VR 환경에서 생쥐의 행동 반응을 조사하기 위해 포괄적인 접근 방식을 사용하여 수술 절차, 유체 제한 프로토콜, 시스템 설정 및 행동 작업의 구현에 중점을 두었습니다. 이러한 결과는 절차적 세부 사항, 교육 시간 프레임 및 성공률을 제공함으로써 이 분야에 기여합니다. 이를 통해 마우스에서 VR 절차를 보다 효과적으로 채택할 수 있으며 이 절차를 연구에 사용하는 데 관심이 있는 실험실의 계획 및 구현을 용이하게 할 수 있습니다.

헤드 바의 외과적 이식은 VR 환경에서 머리 고정 행동 실험을 촉진하는 데 필수적이었습니다. 확립된 프로토콜을 주의 깊게 따르고 적절한 수술 후 관리를 제공함으로써 동물의 건강과 행동에 대한 부작용을 최소화하면서 헤드 바의 성공적인 통합이 보장되었습니다. 또한, 수분 섭취를 조절하고 생쥐의 수분 섭취와 갈증 수준을 유지하기 위해 유체 제한 프로토콜이 구현되었습니다. 점진적인 적응 과정과 주기적인 물 접근은 동물의 복지를 보장하는 동시에 행동 과제의 실행을 촉진하는 데 중요했습니다.

VR 행동 시스템의 설정에는 마우스를 위한 몰입형 가상 환경을 만들기 위해 하드웨어 및 소프트웨어 구성 요소를 통합하는 작업이 포함되었습니다. 완전히 몰입할 수 있는 가상 디스플레이, 액체 보상 시스템, 스티로폼 볼을 구형 트레드밀로 사용하고, 헤드 홀더를 활용하여 실험 조건과 데이터 수집을 정밀하게 제어할 수 있었습니다. 선형 트랙 및 Y-미로 패러다임을 포함한 행동 작업은 이동, 의사 결정 및 보상 처리와 같은 마우스 행동의 주요 측면을 조사하기 위해 신중하게 설계되었습니다.

실험 절차를 최적화하기 위한 최선의 노력에도 불구하고 연구 중에 몇 가지 문제가 발생했습니다. 개별 마우스 응답의 가변성과 하드웨어 및 소프트웨어 통합과 관련된 기술적 문제는 데이터 수집 및 분석에 문제를 제기했습니다. 또한 유체 제한 프로토콜에 의존하기 때문에 동물의 수분 상태를 주의 깊게 모니터링하고 그에 따라 실험 절차를 조정해야 했습니다. 때때로 생쥐는 공 위에 놓였을 때 어려움을 겪거나, 보상 주둥이에서 물을 마시지 않거나, 얼어붙어 공 위에서 뛰지 못했습니다. 이러한 문제 중 일부는 일시적일 수 있지만 마우스가 진행에 방해가 되지 않는지 모니터링하는 것이 중요합니다. 동료에 비해 발전을 보이지 않는 마우스는 연구에서 제외해야 합니다. 한 유사한 실험에서는 55마리의 쥐 중 4마리가 패러다임²⁵를 학습할 수 없기 때문에 제거되었습니다. 5일 연속으로 공에 대한 일관된 부동성을 보이는 마우스는 체중, 물을 마시기 위해 보상 주둥이에 접근할 수 있는 능력, 근본적인 문제가 없는지 확인하기 위해 공에 대한 위치에 대한 철저한 평가에 따라 연구에서 제외되었습니다. 이러한 경우 연구를 효율적으로 재개하기 위해 어떤 전략을 취해야 하는지 결정하는 것은 연구자의 재량에 달려 있습니다.

이러한 교육 프로토콜은 쥐가 행동 과제를 실행하는 숙련도를 보장하면서 점진적으로 도전하도록 설계되었습니다. 선형 트랙에서 Y-미로 패러다임으로의 진행 기준은 성공적인 시험 연속 달성 및 보상 획득과 같이 미리 결정된 성능 임계값을 충족하는 마우스의 능력을 기반으로 했습니다. 엄격한 훈련 프로토콜의 구현을 통해 우리는 생쥐의 행동 능력과 점점 더 복잡해지는 작업에 대한 적응력을 평가할 수 있었습니다. 이러한 세심하게 구조화된 프로토콜은 행동 신경과학 분야의 연구자에게 강력한 프레임워크를 제공하여 다양한 실험 패러다임을 위해 동물을 평가하고 훈련하는 체계적인 접근 방식을 제공합니다. 진행에 대한 명확한 기준을 설명함으로써 연구자는 실험 대상자의 학습 곡선을 효율적으로 측정하고 그에 따라 교육 패러다임을 선별할 수 있습니다. 또한 이 방법론적 접근 방식은 실험 전반에 걸쳐 재현성과 표준화를 촉진하여 비교 분석을 촉진하고 동물 모델의 인지 과정 및 학습 메커니즘에 대한 이해를 촉진합니다.

마우스를 위한 VR 패러다임을 설계할 때 작업 복잡성 및 교육 진행과 관련하여 사용할 수 있는 접근 방식의 범위를 인식하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 실험 설계를 구성하기 위한 광범위한 프레임워크를 제공하지만, 연구의 필요에 따라 보상 전달, 편향 제어, 자극 유형, 작업 진행 및 시스템 매개변수와 같은 특정 측면을 조정하는 것은 연구자의 몫입니다. 예를 들어, 일부 연구에서는 즉각적인 작업 참여에 초점을 맞춘 보다 간소화된 접근 방식을 선택합니다. 예를 들어 Krumin et al.은 서로 다른 작업 간에 점진적인 학습 요법을 사용하는 대신 하나의 일관된 T-maze 작업을 구현했습니다. 이와는 대조적으로, 다른 연구들은 자극 강화 전략과 청각적 단서와 같은 다양한 임상시험 설계 요소를 제공한다. 이 연구는 잘못된 시도에 대한 처벌로 청각적 피드백을 활용하고, 올바른 시도에 대한 보상으로 물만 제공했다²⁶. 반대로, Zhao 등은 올바른 시행에 대한 보상으로 10%의 자당 용액을 사용했으며, 잘못된 시행에 대해서는 어떠한 형태의 처벌도 포함하지 않았다²⁷. 대신, 연구진은 반편견 훈련(anti-bias training)과 같은 방법을 통해 잘못된 반응을 완화하는 데 초점을 맞췄는데, 이는 동물의 이전 선택에서 신호 방향을 전환할 확률을 높이고 동기 부여를 강화하기 위해 일일 물 허용량을 조정하는 것과 관련이 있습니다. Harvey et al.이 관찰한 선택 의존적 활성화 시퀀스와 대조적으로 궤적과 공간 선호도에 의해 설명되는 후방 두정엽 피질 세포 선택성을 발견하는 Zhao et al.이 입증한 바와 같이 작업 전반에 걸쳐 공간적 단서의 존재와 같은 실험 설계의 차이는 신경 코딩에 대한 다양한 해석으로 이어질 수 있습니다^27,28. 사용된 특정 하드웨어에는 6개의 LCD 모니터, 확장 가능한 핥기, 에어 쿠션 스티로폼 볼 러닝머신이 포함되었다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 실험실에 걸쳐 가상 현실 시스템 전반에 걸쳐 프로젝터⁽²⁹) 대 컴퓨터 모니터, 비구형 트레드밀(³⁰), 고정¹⁰ 대 확장 가능한 핥기 주둥이의 사용을 포함하여 많은 차이점이 있습니다.

결론적으로 본 연구는 VR 환경에서 생쥐의 행동 반응에 대한 귀중한 통찰력을 제공하고 복잡한 행동을 조사하기 위해 몰입형 기술을 사용할 수 있는 가능성을 보여줍니다. 향후 연구 노력은 실험 프로토콜을 개선하고, 의사 결정 과정의 기초가 되는 신경 메커니즘을 탐구하고, 연구 결과를 임상 적용으로 변환하는 데 중점을 둘 수 있습니다. 쥐의 행동에 대한 이해를 지속적으로 발전시킴으로써, 과학자들은 건강과 질병 모두의 복잡한 행동의 기저에 있는 신경 회로와 인지 과정을 더욱 명확히 할 수 있습니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
2.4 mm Screws (00-96 X 3/32)	Protech International	8L0X3905202F	For Added Headbar Stability
Bupivocaine	Hospira	NDC:0409-1162-19	Local Anesthetic
Buprenorphine	Wedgewood Pharmaceuticals	SKU: BUPREN-INJ010VC	Analgesia
Buzzers	Wahl	1565q	For Shaving Surgical Region
Drill and microinjection robot	Neurostar	17129-IDA	Stereotaxis
GLUture	Zoetis	32046	Surgical Adhesive
Head-bar Implant	Luigs-Neumann	130060	Mouse Head Implant
Heating Pad (Lectro-Kennel)	K&H Manufacturing	100212933	Post-operative
Hemostats	World Precision Instruments	501291	Surgical Tool
Hydrogen Peroxide	Swam	L0003648FB	Cleaning Agent
Isoflurane	Dechra	B230008	Surgical Inhalation Anesthetic
Isoflurane/O2 Delivery device w Nosecomb attachments	Eagle Eye Anesthesia Inc.	Model 50 Anesthesia	Surgical Device
Metabond	Parkell	CB-S380	Adhesive Cement
Microscissors	Fine Science Tools	15000-08	Surgical Tool
Oxygen	Praxair	UN1072	Surgical Oxygen
Povidone-Iodine Swabstick	Dynarex	g172095-05	Surgical Tool
Saline	Hospira	NDC:0409-1966-02	Hydration Agent
Sterile Cotton Tipped Applicator (Q-tips)	Puritan	25-806 2WC	Surgical Tool
Sucrose	Fisher Chemical	CAS 57-50-1	Primary Reinforcer/Motivator/Reward
Tweezers	World Precision Instruments	504505	Surgical Tool
Virtual Reality System	PhenoSys	JetBall-TFT	The JetBall, an air cushioned spherical treadmill allows an animal to navigate effortlessly in a virtual world projected on 6 surrounding monitors.
White petrolatum lubricant eye ointment ointment	AACE Pharmaceuticals	NDC:71406-124-35	Eyelube