칼슘 이온 채널의 활성화를 연구하기 위한 Single-cell Calcium Imaging

요약

이 논문에서는 Fura-2/AM 염료를 사용한 단일 세포 Ca²⁺ 이미징을 사용하여 세포 내 칼슘 이온(Ca²⁺) 농도를 실시간으로 정량적으로 모니터링하는 방법을 제시합니다. 이 기술은 효율적인 염료 로딩과 형광 강도 비율을 통한 Ca²⁺ 수준의 정확한 계산을 가능하게 하여 연구 응용 분야를 위한 간단하고 빠른 접근 방식을 제공합니다.

초록

단일 세포 Ca²⁺ 이미징은 온도, 전압, 천연 화합물 및 화학 물질 등과 같은 다양한 자극에 의해 활성화되는 Ca²⁺ 채널 연구에 필수적입니다. 주로 현미경 이미징 기술과 관련 Ca²⁺ 지시자 Fura-2/AM(AM은 Acetoxymethyl ester의 약자)에 의존합니다. 세포 내부에서 Fura-2/AM은 에스테라아제에 의해 Fura-2로 가수분해되며, 이는 유리 세포질 Ca²⁺와 가역적으로 결합할 수 있습니다. 결합 시 최대 여기 파장은 380nm에서 340nm(Ca²⁺로 포화된 경우)로 이동합니다. 방출된 형광 강도는 결합된 Ca²⁺의 농도와 정량적으로 관련됩니다. 340/380 비율을 측정하여 세포질의 Ca²⁺ 농도를 측정할 수 있으며, 서로 다른 시료 간의 형광 프로브의 로딩 효율 차이로 인한 오류를 제거할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 여러 세포에서 Ca²⁺ 변화를 실시간으로 정량적으로 동시에 모니터링할 수 있습니다. 결과는 "에 저장됩니다. 후속 분석을 위한 XLSX" 형식으로 빠르고 직관적인 변화 곡선을 생성하여 검출 효율성을 크게 향상시킵니다. 다양한 실험적 관점에서 이 논문은 내인성 또는 과발현 채널 단백질이 있는 세포에서 Ca²⁺ 신호를 검출하기 위해 이 기술을 사용하는 방법을 나열합니다. 한편, 세포를 활성화하는 다양한 방법도 제시하고 비교했습니다. 목표는 독자에게 단일 세포 Ca²⁺ 이미징의 사용 및 응용 분야에 대한 보다 명확한 이해를 제공하는 것입니다.

서문

Ca²⁺ 는 근육 수축¹, 신경 전도², 분비³ 및 유전자 발현⁴과 같은 다양한 세포 기능을 조절하여 세포 신호 전달에 중요한 역할을 하여 여러 생리적 과정에 영향을 미칩니다. 비정상적인 Ca²⁺ 농도는 부정맥^{5, 응}고 장애⁶, 호르몬 불균형7과 같은 질병을 유발할 수^있다. 따라서 세포 내 Ca²⁺ 농도 변화의 메커니즘을 연구하는 것이 가장 중요합니다.

세포의 Ca²⁺ 농도 조절에는 Ca²⁺-선택성 칼슘 방출 활성화 칼슘(CRAC^{) 채널8} 및 TRP^계열의 비선택적 양이온 채널9을 포함한 다양한 이온 채널이 관여합니다. 이러한 이온 채널은 온도¹⁰, 화합물 및 중국 전통 의학¹¹에서 발견되는 활성 성분과 같은 자극에 의해 활성화될 수 있으며, 다양한 Ca²⁺ 관련 생리학적 과정에서 중요한 역할을 합니다.

세포 내 Ca²⁺ 농도 변화의 효과적인 모니터링은 특히 칼슘 신호 조절이 많은 치료 접근법에서 중심적인 역할을 하는 중국 전통 의학 분야에서 Ca²⁺ 관련 이온 채널을 연구하는 데 필수적입니다. 현재 세포 내 Ca²⁺ 를 측정하는 기본 방법은 전기 측정과 광학 측정의 두 가지 유형으로 분류할 수 있습니다. 전기 측정 접근법은 패치 클램프 기법을 사용하여 Ca²⁺ 유입¹²로 인한 세포막 전위의 변화를 평가합니다.

광학 측정에서 형광 프로브는 특히 Ca²⁺에 결합하여 연구자가 세포 형광 강도의 변화를 추적할 수 있도록 합니다. 일반적인 광학 방법에는 형광 단백질 기반 및 형광 염료 기반 기술이 포함됩니다. 형광 단백질 기반 방법에서 연구자들은 세포에서 Cameleon¹³ 및 GCaMP¹⁴와 같은 Ca²⁺에 민감한 형광 단백질을 과발현하고 형광 현미경 또는 유세포 분석을 사용하여 형광 신호 변화를 모니터링하여 세포질 Ca²⁺ 농도의 변화를 관찰할 수 있습니다. 또한 연구자들은 생쥐에서 이러한 단백질을 과발현하고 이광자 형광 현미경을 사용하여 세포 내 Ca²⁺ 농도의 실시간 생체 내 또는 조직 수준 모니터링을 통해 고해상도와 깊은 조직 침투를 제공할 수 있습니다¹⁰.

형광 염료 기반 방법의 경우 일반적으로 사용되는 Ca²⁺ 프로브에는 Fluo-3/AM, Fluo-4/AM 및 Fura-2/AM¹⁰이 있습니다. 연구자들은 이러한 형광 프로브가 포함된 용액에서 세포를 배양하며, 이 프로브는 세포막을 가로지르고 세포 내 에스테라제에 의해 절단되어 세포 내에 남아 있는 활성 화합물(예: Fluo-3, Fluo-4 및 Fura-2)을 형성합니다. 이 프로브는 자유 리간드 형태에서 최소한의 형광을 나타내지만 세포 내 Ca²⁺에 결합할 때 강한 형광을 방출하여 세포질 Ca²⁺ 농도의 변화를 나타냅니다. 다른 형광 단백질 및 염료와 비교하여 Fura-2는 일반적으로 340nm 및 380nm 파장에서 여기됩니다. 세포 내 free Ca²⁺에 결합하면 Fura-2는 흡수 이동을 겪어 여기 파장 피크를 380nm에서 340nm로 이동하는 반면 510nm 부근의 방출 피크는 변하지 않습니다. 형광 강도와 결합된 Ca²⁺ 농도 사이에는 정량적 관계가 있으며, 이 두 가지 여기 파장에서 형광 강도 비율을 측정하여 세포 내 Ca²⁺ 농도를 계산할 수 있습니다. 비율 측정은 광표백, 형광 프로브 누출, 불균일한 로딩 및 세포 두께의 차이를 줄여 보다 신뢰할 수 있고 재현성 있는 결과를 제공합니다(그림 1).

단일 세포 Ca²⁺ 이미징 시스템은 주로 현미경 기술과 Ca²⁺ 지시자 Fura-2/AM을 사용하여 세포 내 Ca²⁺ 농도를 검출합니다. 이러한 시스템은 형광 현미경, Ca²⁺ 이미징 광원 및 형광 이미징 소프트웨어로 구성되어 여러 세포의 세포질에서 Ca²⁺ 변화를 동시에 정량적으로 모니터링할 수 있습니다(시야당 최대 50개 세포). 결과는 후속 분석을 위해 ".xlsx" 형식으로 저장됩니다. 이 시스템은 빠른 분석 속도(한 시야 내의 세포 그룹을 분석하는 데 약 1분)를 제공하고 직관적인 변화 곡선을 생성하여 검출 효율성을 크게 향상시킵니다. 단일 세포 Ca²⁺ 이미징은 Ca²⁺ 관련 채널을 연구하기 위한 필수적인 기술적 접근 방식이며 이온 채널 관련 생물 의학 연구에서 상당한 가치가 있습니다. 단세포 칼슘 이미징 기술에 적용되면 중국 전통 의학의 기저에 있는 메커니즘에 대한 연구를 크게 발전시킬 것으로 기대됩니다.

프로토콜

실험 방법은 칭화대학교(Tsinghua University)와 베이징 중의과대학(Beijing University of Chinese Medicine)의 IACUC 지침에 의해 승인되었으며 이를 따랐습니다. 이 프로토콜은 여러 신생아 마우스의 피부에서 분리된 1차 각질세포를 포함하여 다양한 세포 유형에 대한 단일 세포 Ca²⁺ 이미징 방법을 소개합니다(출생 후 3일 이내, 성별 무작위 암컷 C57BL/6 마우스). 이 연구에 사용된 시약 및 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 세포 준비

메모: 일차 세포, 내인성 표적 유전자가 있는 세포주 또는 과발현 플라스미드로 transfection된 세포주는 모두 단일 세포 Ca²⁺ 이미징에 적합합니다. 이 연구에 사용된 플라스미드는 칭화대학교의 Xiao Bailong 교수 실험실에서 얻은 것입니다. 이러한 플라스미드는 GFP 형광 단백질과 human STIM1, DsRed 형광 단백질과 human Orai1, mRuby 형광 단백질과 rabbit TRPV1, 적색 형광 단백질 mCherry의 염기서열을 파지 플라스미드 벡터¹⁰에 통합하여 구성되었습니다.

1. 24웰 플레이트에 직경 8mm의 멸균 유리 슬라이드를 준비합니다. 각 웰에 500μL의 폴리-D-라이신(PDL) 완충액(DPBS의 경우 50μg/mL)을 추가합니다.
2. 코팅을 허용하기 위해 37°C에서 1시간 동안 슬라이드를 배양한 다음 피펫을 사용하여 코팅 용액을 폐기합니다.
3. DPBS로 슬라이드를 한 번 세척하고 나중에 사용할 수 있도록 따로 보관하십시오.
4. 1차 세포와 세포주를 특정 배양 방법에 따라 별도로 배양하십시오¹⁰.
5. 준비된 24-well plate에 well당 약 1.5 x 10⁵ 개의 세포의 밀도로 seed세포를 주입합니다. 커버슬립에 부착된 세포를 Ca²⁺ 이미징에 사용합니다.
6. 플라스미드를 과발현하는 세포의 경우, Lipofectamine 2000 (또는 Lipofectamine 3000) 형질주입 시약을 사용하여^10,15 타겟 플라스미드(1 μg/well)를 1:1 비율로 transfection하고, 세포 배양 incubator에서 약 24시간 동안 배양합니다.
   메모: 더 큰 발현 단백질의 경우 더 긴 배양 시간이 필요할 수 있습니다.

2. Fura-2/AM 작업 용액의 준비

1. 50μg의 Fura-2/AM 분말이 들어 있는 튜브에 50μL의 디메틸 설폭사이드(DMSO)를 넣고 잘 섞어 Fura-2/AM의 1μg/μL 원액을 준비합니다.
2. Fura-2/AM 원액과 Pluronic F-127을 1.3mM Ca²⁺가 함유된 Hank's buffer에 혼합합니다.
   메모: 작업 용액에서 Fura-2/AM 및 Pluronic F-127의 최종 농도는 2.5μg/mL입니다. 행크의 버퍼는 1x HBSS 버퍼에 10mM HEPES를 추가하여 준비됩니다.
3. 알루미늄 호일을 사용하여 Fura-2/AM 작업 솔루션을 빛으로부터 보호하십시오.

3. 단일 세포 Ca²⁺ 이미징을 위한 세포 전처리

1. 셀이 있는 유리 슬라이드를 세척을 위한 Hank's buffer가 들어 있는 새로운 24웰 플레이트로 옮깁니다.
2. 피펫을 사용하여 버퍼를 버리고 각 웰에 500μL의 Fura-2/AM 작업 버퍼를 추가합니다.
3. 프로브를 로딩할 수 있도록 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
4. Fura-2/AM 작동 버퍼를 제거하고 Hank's buffer로 셀을 세 번 세척하여 과도한 Fura-2/AM을 제거합니다. 이제 셀을 사용할 준비가 되었습니다.

4. Ca²⁺ 이미징 시스템 시작

참고: 이 연구에서는 Ca²⁺ 이미징에 형광 현미경이 사용됩니다.

1. DG4 조명(크세논 램프), 카메라, 백색광 소스, 현미경 스테이지 컨트롤러, 현미경, 컴퓨터 및 형광 이미징 소프트웨어를 순서대로 시작합니다.
   메모: 온도에 의한 이온 채널의 활성화를 감지하는 경우 관류 시스템, 가열 시스템, 온도 조절기 및 액체 순환 가열/냉각 장치의 구성 요소도 켭니다.

5. 세포 Ca²⁺ 반응 절차

1. 형광 이미징 소프트웨어를 엽니다( 재료 표 참조).
   1. Protocol(프로토콜)을 선택한 다음 File(파일)을 선택한 다음 Load Protocol(프로토콜 로드)을 선택합니다. 프로토콜을 선택하고 확인을 클릭합니다.
   2. 실험을 구성합니다(메뉴 목록에서).
   3. 새 실험을 선택합니다.
2. 관류 챔버를 현미경에 장착합니다.
   메모: 대물렌즈의 손상을 방지하기 위해 거친 초점 손잡이를 사용하여 챔버를 장착하거나 제거할 때 항상 대물렌즈를 완전히 낮추십시오.
3. Fura-2/AM 처리된 세포 슬라이드를 제거하고 Hank's buffer가 들어 있는 챔버에 넣습니다.
4. 관류 시스템을 시작합니다.
5. 20x DIC 대물렌즈를 선택하고 백색광 아래에서 초점을 조정합니다.
6. 작업 표시줄에서 Cfg Exp 를 클릭합니다.
   1. 이미징을 위해 원하는 형광을 선택합니다.
   2. 수집 빈도 및 화면에 표시 설정을 결정합니다(획득: 340, 380, GFP 확인; 획득 간격: 1초; 저장 간격: 1초).
7. 초점
   1. 실험 제어판에서 Focus 버튼을 클릭합니다.
   2. 획득 시간(보통 100ms)을 조정하고 필요에 따라 게인을 조정한 다음 "이 파동을 위해 저장"합니다.
      메모: 자외선의 경우 노출 시간 대신 게인을 사용합니다.
   3. 초점을 맞추기 위해 원하는 파장(예: 380)을 선택하고 초점 시작을 클릭합니다.
   4. 쌍안경에서 컴퓨터로 보기를 전환합니다.
   5. 쌍안경을 통해 희미한 녹색이 보이는지 확인하십시오.
   6. 세포에 초점을 맞추고, 먼저 대략적인 초점을 사용하여 대물렌즈를 가까이 한 다음 미세한 초점을 맞춥니다.
      메모: 현미경이 s에 너무 가까워지면 신호음이 울립니다.tage. 이 경우 대물렌즈를 낮추고 스테이지에서 플레이트를 재정렬한 다음 다시 초점을 맞춥니다. 레이저로 인한 세포 손상을 줄이기 위해 초점에 소요되는 시간을 최소화합니다.
   7. 포커싱 과정에서 세포의 형광 강도를 확인합니다.
   8. 노출 시간과 게인을 수정하여 세포의 형광 강도를 조정합니다.
      메모: 340 및 380에 대한 노출 시간과 게인은 일관되어야 합니다.
   9. 좋은 초점이 잡히면 현미경의 버튼을 눌러 view컴퓨터로 이동합니다.
   10. 컴퓨터에서 가장 선명한 이미지를 얻기 위해 필요에 따라 초점을 다시 맞춘 다음 초점 중지를 클릭합니다.
8. GFP 양성 세포를 찾기 위한 대체 절차
   1. 먼저 340/380 절차를 사용하여 세포에 초점을 잘 맞춥니다.
   2. FITC를 선택한 다음 Start Focusing을 클릭합니다.
   3. 스테이지 컨트롤러를 사용하여 GFP 양성 세포를 찾습니다.
   4. 보기를 컴퓨터로 전환한 다음 Stop Focusing을 클릭합니다.
9. 지역 선택
   1. 메뉴 표시줄에서 Region(지역) 버튼을 클릭합니다.
   2. 원하는 조명 유형(340/380/FITC/TRITC)을 선택합니다. FITC 및 TRITC 필터는 타겟 플라스미드를 과발현하는 세포에 대해 각각 GFP 및 mCherry/DsRed/mRuby에 대해 선택됩니다. 그렇지 않으면 Fura-2를 선택합니다.
      메모: 상태가 좋지 않거나 죽은 세포, 예를 들어 분명히 둥글거나 형광 단백질이 과도하게 노출된 세포는 선택하지 마십시오.
   3. Acquire Images(이미지 획득)를 클릭한 다음 OK(확인)를 클릭합니다.
   4. 새 창이 나타납니다. Oval 도구를 클릭한 다음 셀을 클릭하여 셀을 선택합니다.
   5. 타겟 단백질이 운반하는 형광 아래에서 원하는 세포(FITC 또는 TRITC)를 선택합니다. 380nm 조건에서 타겟 단백질을 발현하지 않는 대조 세포를 선택합니다.
   6. 원을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 Delete Region(지역 삭제)을 선택하여 영역을 실행 취소합니다.
   7. 배경 샘플을 마지막 영역으로 선택하고 해당 ID 번호를 기록합니다.
   8. Save( 저장 )를 클릭한 다음 Done(완료)을 클릭합니다.
10. 배경 빼기
    1. 메뉴 버튼을 클릭하십시오 참조 .
    2. 배경 영역의 번호를 나타냅니다.
       메모: 배경이 마지막으로 선택한 영역인 경우 매우 높은 숫자를 입력하면 마지막으로 선택한 영역으로 자동 전환됩니다.
    3. Subtract References(참조 빼기) 상자를 선택한 다음 OK(확인)를 클릭합니다.
11. 로그 데이터
    1. 실험 제어판에서 Log Data 버튼을 클릭합니다.
       메모: 이미지는 나중에 실험을 다시 재생하려는 경우에만 저장됩니다. 일반적으로 데이터 상자를 확인하는 것만으로도 충분합니다.
    2. 선호하는 데이터 파일 유형을 묻는 프롬프트가 나타나는지 확인합니다. 선택. XLSX 형식을 사용하는 것이 좋습니다.
    3. ".xlsx" 유형 워크시트가 열립니다. 워크시트를 최소화하면 워크시트가 화면 공간을 차지하지 않습니다.
12. 데이터 수집
    1. 제어판의 Time Lapse 섹션에서 데이터 수집 간격을 1초로 설정합니다.
       메모: 이것은 실제 필요에 따라 조정할 수 있습니다.
    2. 실험 제어판에서 Zero Clock 과 Acquire 를 클릭하여 실험을 시작합니다. 기준선은 선택한 각 셀 영역을 나타내는 그래프에 표시됩니다.
    3. 실험 요구 사항에 따라 세포에 대한 일련의 처리를 수행합니다.
    4. 셀의 온도 반응을 관찰하려면 온도 조절기를 사용하여 관류 시스템의 버퍼를 적절한 온도로 가열합니다.
    5. 약물이 세포에 미치는 영향을 관찰하려면 약물 함유 완충액을 관류하거나 수동으로 추가하고 세포 변화를 기록합니다.
    6. 데이터 수집이 완료되면 Pause(일시 중지)를 클릭합니다.
       메모: 데이터 수집을 일시 중지할 수 있으며 실험 중 언제든지 시계를 재설정할 수 있습니다.
    7. 데이터를 저장하고 분석합니다.
13. File and Close Experiment를 클릭하여 실험을 종료하고 대화 상자에서 No를 선택하여 프로토콜을 저장합니다.
14. 메뉴에서 새로 만들기를 클릭하여 새 실험을 열고 프로세스를 반복합니다.
15. 끄세요
    1. 소프트웨어를 닫고 컴퓨터에서 데이터를 전송하십시오.
    2. 시작 절차를 반대로 합니다.
    3. 가입 시트에 시간을 기록하고 지저분한 것을 청소하십시오.
16. 데이터 분석
    1. 세포 내 Ca²⁺ 농도를 Fura-2 340/380 비율로 나타내거나 해당 Ca²⁺ 농도로 변환합니다.

결과

온도 반응 감지
원발성 각질세포
1차 각질세포는 신생아에서 분리하고 확립된 프로토콜¹⁰에 따라 준비되었습니다. 이 세포는 유리 슬라이드를 포함하는 24웰 플레이트에 파종되었습니다. Fura-2 프로브를 로드한 후 그림 2A와 같이 세포 형태를 명확하게 시각화하기 위해 380nm 파장에서 현미경으로 초점을 조정...

토론

단일 세포 Ca²⁺ 이미징 시스템의 적용은 광범위하여 각질 세포, 줄기 세포¹⁶, 간 세포, 심장 세포¹⁷, 포도사이트¹⁸, 면역 세포 및 표적 단백질^10,19를 과발현하는 세포주를 포함한 다양한 세포 유형에서 Ca²⁺ 신호를 연구할 수 있습니다. 이 기술은 세포 Ca²⁺...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Camera	Nikon
Capsaicine	Sigma	211275
CL-100 temperature controller	Warner Instruments
Cyclopiazonic Acid (CPA)	Sigma	C1530
DG-4 light	Sutter Instrument Company
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Amresco	231
DPBS	Thermofisher	14190144
Fluorescence imaging software (MetaFluor, Paid software)	Molecular Devices
Fluorescence microscope	Nikon
Fura-2/AM	Invitrogen	F1201
HBSS buffer	Gibco	14175103
HEPES	Sigma	H3375
Lipofectamine 3000	Invitrogen	L3000008
Pluronic F-127	Beyotime	ST501
poly-D-lysine	Beyotime	ST508
SC-20 liquid circulation heating/cooling device	Harvard Apparatus
White-light source	Nikon