Eucommia ulmoides Bark 추출물을 이용한 아연 기반 나노 물질의 제형 및 상처 치유 잠재력

요약

여기에서는 Eucommia ulmoides 나무 껍질에서 얻은 폴리이소프렌이 풍부한 수성 추출물을 사용하여 산화아연(ZnO) 나노 입자를 합성하는 프로토콜을 제시합니다. 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)에서 합성된 ZnO 나노 입자가 보여주는 상처 치유 잠재력은 간단하고 비용 효율적이며 효율적인 방법인 스크래치 분석을 사용하여 평가되었습니다.

초록

Eucommia ulmoides의 껍질에서 추출한 수성 추출물은 수많은 건강상의 이점을 가진 생체 활성 화합물의 풍부한 공급원 역할을 합니다. 이 프로토콜은 Eucommia ulmoides 껍질 매개 폴리이소프렌이 풍부한 수성 추출물을 사용하여 산화아연(ZnO) 나노 입자를 제조하는 방법을 탐구하는 것을 목표로 합니다. 한편, 제안된 프로토콜은 프로세스를 완화하여 상처 치유 재료의 준비와 관련이 있습니다. 또한, 합성된 나노입자(Eu-ZnO-NPs)의 상처 치유 가능성은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC) 단층에 대한 간단한 스크래치 분석을 사용하여 평가되었습니다. Eu-ZnO-NPs로 24시간 동안 처리한 후, HUVEC 세포의 세포 증식 및 이동을 평가했습니다. 연구가 끝날 무렵, 다양한 농도의 Eu-ZnO-NP로 처리된 긁힌 단층에서 세포 증식 및 이동이 관찰된 반면, 대조 세포에서는 낮은 세포 이동 및 증식 속도가 관찰되었습니다. 선택한 농도 중 20μg/mL Eu-ZnO 나노 물질은 더 나은 세포 이동과 향상된 상처 치유 잠재력을 보여주었습니다.

서문

약용 식물과 식물 유래 화합물은 수많은 건강상의 이점을 나타내는 것으로 나타났습니다¹. 세계보건기구(WHO)는 전 세계 인구의 80%가 1차 의료 서비스를 위해 전통적인 약용 식물에 의존하고 있다고 보고했습니다. 중국은 전통 중국 의학(TCM)으로 잘 알려져 있고 인기가 있습니다. 한약재는 다양한 질병을 치료하고 생물학적 잠재력으로 활용되는 것으로 보고되었습니다. 약용 식물은 생체 활성 화합물과 다양한 치료 역할의 저장소 역할을 합니다. 상처를 치료하기 위해 약용 식물도 활용되었습니다. 만성 상처를 치료하기 위해 적용되는 방법에는 여러 가지가 있다². 최근의 조사에 의하면 약용 식물은 상처 치유에 유리한 조건을 제공하고, 감염이 없으며, 조직 재생을 고정시킴으로써 상처 치유 과정에 관여하는 것으로 밝혀졌다³. 한편, 약용 식물에 존재하는 생리 활성 화합물의 항균 및 항진균 특성은 상처를 치료하고 상처 치유 효율을 높이는 데 도움이 될 수 있습니다⁴.

금속 기반 나노 물질은 생체 적합성 및 생분해성 특성으로 인해 주목을 받고 있습니다. 일반적으로 중국 고무 나무라고 불리는 Eucommia ulmoides 는 중국의 토착 종입니다. 나무의 잎과 껍질은 의약 행위에 사용됩니다. 가장 중요한 것은 식물 종이 중국 중부 및 서부 지방에서 재배되었다는 것입니다⁵. Peng et ^al.6은 잎, 나무 껍질 및 staminate 꽃이 치료 잠재력으로 먹을 수 있다고 보고했습니다. 또한 E. ulmoides 는 리그난, 페닐프로파노이드, 이리도이드, 플라보노이드, 아미노산 및 미량 원소의 최상의 공급원 역할을 합니다. 또한, 나무 껍질은 혈압 조절, 지방 감소, 항골다공증 및 저혈당 활동 촉진과 같은 다양한 생물 의학 응용 분야에 활용되어 왔습니다⁷. 따라서 의심할 여지 없이 E. ulmoides 껍질 추출물이 중국 전통 의학에서 오랜 역사를 가지고 있음이 입증되었습니다. 이전 보고서에서는 천연 고분자 폴리이소프렌이 Eucommia ulmoides⁸의 껍질에 풍부하다고 제안했습니다. 위의 정보를 바탕으로 본 연구는 Eucommia ulmoides 껍질 추출물을 사용하여 나노 물질을 제조하는 것을 목표로 합니다. 아연과 껍질 추출물의 조합은 나노 물질을 제조하는 데 매력적인 선택입니다. 전반적으로, 본 조사의 궁극적인 목적은 상처 치유 응용 분야를 위한 새로운 하이브리드 나노 물질을 제조하는 것이었습니다.

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프로토콜

참고 : 추출물을 준비하기 전에 얻은 나무 껍질 재료를 탈 이온수를 사용하여 두 번 세척하고 그늘진 곳에서 건조시켰다. 그늘에서 건조된 나무 껍질은 밀폐 용기에 보관되었습니다.

1. Eucommia ulmoides 껍질 추출물의 준비

1. Eucommia ulmoides 나무에서 수집한 나무 껍질을 가위로 작은 조각으로 자릅니다.
2. 다진 나무 껍질 재료를 이중 증류수로 두 번 씻으십시오.
3. 그늘진 조건에서 37 ° C에서 24 시간 동안 나무 껍질 조각을 건조시킵니다.
   1. 연구에 사용된 나무 껍질의 양에 따라 건조 과정의 지속 시간을 조정합니다. 나무 껍질을 작은 조각으로 자르기 전에 나무 껍질이 완전히 건조되었는지 확인하십시오. 직사광선을 피하십시오.
4. 그늘에서 건조된 나무 껍질 20g을 멸균 이중 증류수 220mL가 들어 있는 원뿔형 플라스크에 옮기고 130°C에서 20분 동안 가열합니다.
   1. 반응 용액의 색상이 밝은 노란색으로 바뀝니다. 용액의 색상 변화는 10분 후에 발생합니다. 용액을 10분 더 가열합니다. 샘플 수량에 따라 이중 증류수의 양을 조정하십시오.
5. 폴리이소프렌을 함유한 미처리 추출물을 4°C에서 보관하여 나중에 사용하십시오. 실과 같은 구조의 형성은 추출물에 폴리이소프렌이 존재함을 나타냅니다.

2. E. ulmoides 나무 껍질 매개 ZnO 나노 입자의 생합성

1. 500mL 원추형 플라스크에 1M 질산아연 이수화물 Zn(NO₃)₂ 를 50mL의 탈이온수를 추가합니다. 자기 교반(60RPM)을 사용하여 계속 저어줍니다. Zn (NO₃) ₂ 는 완전히 용해되는 데 30 분이 걸립니다.
2. 15mL의 E. ulmoides 껍질 추출물을 1M 질산아연이수화물(Zn(NO:₃)₂) 용액 20mL에 적가합니다.
3. 덮인 반응 혼합물을 자석 교반기에 놓고 교반기를 켠 다음 (60RPM)으로 3시간 동안 회전합니다.
4. 1 N 수산화나트륨 NaOH (3 mL) 용액을 반응 혼합물에 적가하여 pH를 9로 조정한다. 용액 혼합물이 유백색으로 변하고 pH가 9 이하가 될 때까지 NaOH를 첨가합니다. 용액은 ZnO 나노 입자가 형성 될 때 유백색이됩니다.
   1. 1M의 질산 아연 이수화물 Zn (NO₃ ) ₂ 용액 부피의 준비는 실험 요구에 따라 달라질 수 있습니다. 갓 준비한 껍질 추출물을 사용하십시오. pH가 10을 초과하면 나노 입자 응집이 발생합니다.
5. 합성된 Eu-ZnO-NP를 50mL 원심분리 튜브에 옮기고 100 x g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.
   알림: 불순물은 즉시 세탁하여 피할 수 있습니다.
6. 세척된 Eu-ZnO-NP를 유리판에 모아 뜨거운 공기 오븐에서 45-50°C에서 1시간 동안 건조시킵니다.
   참고 : Eu-ZnO-NP를 30 분 이상 보관하면 나노 입자의 물리 화학적 특성에 영향을 줄 수 있습니다.

3. TEM을 이용한 사이즈 확인

1. DDH₂O에 1 mg/mL의 나노 입자를 준비하고 구리 그리드에 5 μL의 Eu-ZnO-NP 샘플을 로드하고 완전히 마를 때까지 기다립니다. 구리 그리드에 로드하기 전에 샘플을 소용돌이치십시오.
2. Eu-ZnO-NP가 포함된 구리 그리드를 TEM 시료 홀더에 로드하고 50x 및 100x 배율로 이미지를 획득합니다.
   참고: 이 단계에서는 핀셋을 사용하여 그리드를 선택해야 합니다.

4. 세포독성 평가

1. 1 웰 플레이트의 각 웰에 1^{× 10 4} HUVEC을 파종하고 5 % CO₂ 37 ° C 인큐베이터에 놓습니다.
2. 다양한 농도의 Eu-ZnO-NP 10μL를 90% 융합 세포에 첨가하고 24시간 동안 배양합니다.
3. 배양 후 세포를 방해하지 않고 기존 배지를 제거하고 90μL의 신선한 DMEM 배지를 포함하는 각 웰에 10μL의 CCK-8 용액을 첨가하고 5% CO₂, 37°C 인큐베이터에서 배양합니다.
4. 분광 광도계를 사용하여 450nm에서 CCK8 용액으로 처리된 세포의 흡광도를 측정합니다.
   참고: 흡광도의 변화를 피하기 위해 15분 이내에 즉시 흡광도를 측정했습니다.

5. 스크래치 분석을 위한 HUVEC 세포 준비

1. 10% 소 태아 혈청(FBS)과 1% 펜 연쇄상구균이 포함된 Dulbecco의 변형된 Eagle 배지를 포함하는 12개의 웰 배양 플레이트에 적절한(1 × 10⁵) 수량의 HUVEC을 파종하고 5% CO₂ 37 °C 인큐베이터에서 배양합니다.
   1. 스크래치 분석을 수행하기 전에 도립 현미경을 사용하여 포화도를 확인하십시오.
      참고: 스크래치 분석을 수행하기 위해 요구 사항에 따라 6개의 웰 플레이트 또는 12개의 플레이트가 사용되며 세포 밀도는 배양 플레이트에 따라 다릅니다. 70%-80% 융합 세포의 사용은 이상적이며 스크래치 분석에 권장됩니다. DMEM 배지의 부피는 연구에 사용된 배양 플레이트에 따라 달라질 수 있습니다. 예를 들어, 6개의 웰 플레이트에는 1-1.5mL의 배양 배지가 필요하고 12개의 웰 플레이트에는 0.5-1.0mL의 성장 배지가 필요합니다.
2. 멸균 200μL 피펫 팁을 사용하여 상처 너비가 200μm인 대표적인 상처를 부드럽게 긁습니다.
3. 세포 단층을 긁는 데 사용되는 팁이 세포 표면과 접촉하는지 확인합니다.
   알림: 흠집이 생길 때마다 멸균 팁을 사용하십시오.
4. 전체 배지를 제거하고 1x PBS 1mL를 사용하여 HUVEC 단층을 세척하여 분리된 세포를 제거합니다.
   참고: 분리된 단층 셀이 해당 웰에서 완전히 제거되었는지 확인합니다. 상처로 인해 발생한 부위에 손상이 발생하지 않았는지 확인합니다.
5. 합성된 Eu-ZnO-NP의 상처 치유 가능성을 평가하기 위해 10% FBS가 포함된 완전한 배지와 결합된 0(대조군), 10 및 20μg/mL 농도의 Eu-ZnO 나노입자를 웰에 추가합니다. 5% CO₂ 인큐베이터에서 실험 플레이트를 37°C로 유지합니다.
   참고: 신선하고 완전한 배지를 추가하는 동안 세포 단층을 방해하지 마십시오. 배양 중에 단층 세포가 방해받지 않고 유지되는지 확인하십시오.
6. 도립 현미경을 사용하여 0시간 및 24시간 동안 현미경 사진을 획득합니다. 주석 도구를 사용하여 다른 시간 간격으로 상처 봉합을 측정합니다.
   1. 다음 공식을 사용하여 상처 폐쇄의 백분율을 계산합니다: 상처 폐쇄(%) = [(0h에서 세포 이동(μm) - 24시간에서 세포 이동(μm))/0h에서 세포 이동(μm)] x 100.

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결과

본 연구는 Eucommia ulmoides 나무의 껍질을 사용하여 나노 입자를 합성하는 것을 목표로 합니다. 나무 껍질 재료는 그늘진 환경에서 완전히 건조되었습니다 (그림 1). 껍질 재료를 사용하여 샘플을 130°C에서 20분 동안 가열하여 온수 수성 미처리 추출물을 제조했습니다. 온도와 지속 시간이 약간 변하면 식물 화합물이 파괴되어 수성 추출물을 준비...

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토론

E. ulmoides 껍질, 씨앗 및 잎은 수많은 건강상의 이점을 나타내는 것으로 여겨집니다. 우리의 결과는 EU-ZnO 나노 입자의 합성이 간단하고 비용 효율적인 접근 방식을 사용하여 달성되었음을 보여주었습니다. 수성 추출물은 나노 입자를 합성하는 데 사용되었습니다. 껍질 재료를 고온에서 가열하면 일부 식물 성분이 분해되고 추출 효율이 저하 될 수 있습니다. 수성 허...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
12 well plate	NEST	703011	Used for cell culture and assay
Centrifuge	SCILOGEX	SC1406	Used to separate the nanoparticles from the colloidal mixture
Centrifuge Tube – 15 mL	BIOFIL	CFT-312150	To centrifuge the synthesized solution
Centrifuge tube – 5 mL	Biosharp	BS-50-CM-S	To store the nanoparticles
CO2 incubator	Thermo scientific	3010	To culture the HUVEC cells
Denoised water	Millipore	Not applicable	For preparation of the extract
DMEM medium	Cytiva	SH30243.01	Used for cell culture work
Funnel	Thermo scientific	42600060	To hold the filter paper during the filtration
Glass beakers	Borosilicate	1102-50	Used to prepare the aqueous extract
Hot air oven	Genetimes	Not Applicable	Used to dry the nanoparticles and collect in the powder form
Magnetic stirrer	KYLIN-BELL	GL-5250-A	Used for nanoparticles synthesis
Microscope	Nikon Eclipse	Ts2	Used to take microphotographs
Petri dish	NEST	753001	Used to collect the nanoparticles
Pipette 1 mL	Lab Science	YEA17AD0055580	To take/add the specific volume of solution/extract
Pipette tips 1 mL	SAINING	3014200-T	To take/add the specific volume of solution/extract
PTFE Magnetic Mixer Stir Bars	LAN RAN	Not applicable	Used for nanomaterial synthesis process
Sodium hydroxide	Sigma Alrich	71690	Used to adjust pH during the synthesis
Stainless Scissor	Deli	6034	Used for chopping the bark materials
T25 tissue culture flask	NEST	707001	Used to maintain the cells
Weighing Balance	Radwag	AS220R2	Used to weigh the chemicals
Whatman filter paper No.1	Newstar	GB/T1914-2017	Used to filter the extract for synthesis
Zinc nitrate	Sigma Alrich	13778-30-8	Used as precursor for the nanoparticle’s synthesis